CC BY
37
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2022 - Vol. 29, № 4 - P. 108-110
УДК: 616.65-002-006 DOI: 10.24412/1609-2163-2022-4-108-110 EDN JZVKXO ||||j
РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Н.Г. КУКЛИНА*, Д.А. ВИКТОРОВ**, А.Н. ТОРОПОВСКИЙ*, О.Н. ПАВЛОВА***, О.Н. ГУЛЕНКО**,
Л.Г. ВАРФОЛОМЕЕВА***
*ООО «ТестГен», 44-й проезд Инженерный, д. 9, офис 13, лаборатория 33-34, г. Ульяновск, 432072, Россия **ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской
Федерации, ул. Чапаевская, д. 89, г. Самара, 443099, Россия
***ФГБОУ ВО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина» Министерства высшего образования и науки Российской Федерации, ул. Интернациональная, д. 33, г. Тамбов, 392000, Россия
Аннотация. Рак предстательной железы - одно из крайне распространенных заболеваний с высокой летальностью. Основная группа риска - мужчины старше 50 лет. Определение простатспецифического антигена является основным методом скрининга рака предстательной железы, но это органоспецифический маркер и его повышение может сигнализировать о разнообразных заболеваниях предстательной железы, и это не обязательно рак, или о ранее проведенных манипуляциях. В последнее время все одним из инструментов диагностики рака предстательной железы является анализ экспрессии мРНК гена PCA3, гиперэкспрессия которого встречается в 95% случаев рака предстательной железы. При раке предстательной железы установлено генетическое нарушение, вовлекающее регулируемый андрогенами ген TMPRSS2 и гены транскрипционных факторов ETS, ERG и ETV1. Ген ERG, относящийся к семейству ETS, принадлежит к числу онкогенов, который достоверно высоко экспрессиро-ван при раке предстательной железы (более 70% случаев). При раке предстательной железы ERG может быть слитным с геном ТМРRSS2, который кодирует сериновую протеазу, секретируемую эпителием простаты в ответ на действие андрогенов. Такая генная перестройка приводит к слитному транскрипту ТМРRSS2-ETS, через который ERG экспрессируется на повышенном уровне под контролем андрогенов. Определение химерного гена TMPRSS22-ERG в ткани демонстрирует высокую специфичность и чувствительность при раке предстательной железы.
Ключевые слова: рак предстательной железы, ПСА, PCA3, TMPRSS2, ETS, ТМРRSS2-ETS.
DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX PCR TEST SYSTEM FOR THE DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER N.G. KUKLINA*, D.A. VIKTOROV*, A.N. TOROPOVSKIJ*, O.N. PAVLOVA**, O.N. GULENKO**, L.G. VARFOLOMEEVA***
*TestGen, 44 Engineering Lane, 9, Ulyanovsk Region, Ulyanovsk, 432072, Russia **Samara State Medical University Ministry of Health Care of the Russian Federation, 89, Chapayevskaya St., Samara, 443099, Russia
Abstract. Prostate cancer (PC) is one of the most common diseases with a high mortality rate. The main risk group is men over 50 years of age. PSA determination is the main method of screening for prostate cancer, but it is an organ-specific marker and its increase may signal a variety of prostate diseases, not necessarily cancer, or previous manipulations. Recently, one of the tools used to diagnose prostate cancer is mRNA expression analysis of the PCA3 gene, whose hyperexpression is found in 95% of cases of PCa. A genetic disorder involving the androgen regulated gene TMPRSS2 and the transcription factor genes ETS, ERG and ETV1 has been identified in prostate cancer. The ERG gene, a member of the ETS family, is one of the oncogenes that is significantly highly expressed in PCa (more than 70% of cases). In PCa, ERG can be fused to the TMRRSS2 gene, which encodes a serine protease secreted by the prostate epithelium in response to androgens. This gene rearrangement results in a fusion TMPRSS2-ETS transcript through which ERG is expressed at an elevated level under androgen control. Detection of the chimeric TMPRSS22-ERG gene in tissue demonstrates high specificity and sensitivity in PCP.
Keywords: prostate cancer, PSA, PCA3, TMPRSS2, ETS, TMPRSS2-ETS.
Введение. Одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний у мужчин является рак предстательной железы (РПЖ) и каждый год регистрируется более 550 тыс. новых случаев заболевания [2,3]. В последнее десятилетие в России численность больных с впервые установленным диагнозом РПЖ на 100 000 населения возросла на 300% [3]. Основная группа риска - мужчины старше 50 лет.
Некоторое время наиболее точным показателем РПЖ считался уровень простатспецифического антигена (ПСА) и его определение является основным методом скрининга. Проведение данного анализа требует тщательного соблюдения пациентов предписанных врачом рекомендаций (соблюдения режима питания, в том числе употребление алкоголя, отсутствие физических нагрузок и так далее), несоблюдение которых, а также наличие серой зоны (значения
4-10 нг/мл) могут привести к неправильной интерпретации полученных результатов. Также, следует отметить, что ПСА - это органоспецифический маркер и его повышение может сигнализировать о разнообразных заболеваниях предстательной железы, и это не обязательно рак, или о ранее проведенных манипуляциях. Конечным этапом для постановки диагноза является проведение гистологического исследования биопсийного материала, являющимся «золотым стандартом» диагностики. Проведение биопсии является при этом достаточно болезненной процедурой с частыми осложнениями. При этом около 40% биопсий оказывается отрицательными [2,7].
В последнее время все одним из инструментов диагностики РПЖ является анализ экспрессии мРНК гена PCA3 (Prostate Cancer Gene 3), гиперэкспрессия которого встречается в 95 % случаев РПЖ [5], и на уровень его экспрессии не влияет локализация опухоли
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2022 - Vol. 29, № 4 - P. 108-110
предстательной железы или наличие хронического простатита [16].
Согласно различным исследованиям, чувствительность анализа экспрессии РСА3 варьирует от 46,9% до 82%, а специфичность - от 55% до 92% [5,12].
При РПЖ установлено генетическое нарушение, вовлекающее регулируемый андрогенами ген TMPRSS2 и гены транскрипционных факторов ETS, ERG и ETV1. Ген ERG относящийся к семейству ETS, принадлежит к числу онкогенов, который достоверно высоко экспрессирован при РПЖ (более 70 % случаев) [14]. При РПЖ ERG может быть слитным с геном TMPRSS2, который кодирует сериновую протеазу, секретируемую эпителием простаты в ответ на действие андрогенов. Такая генная перестройка приводит к слитному транскрипту TMPRSS2-ETS, через который ERG экспрессируется на повышенном уровне под контролем андрогенов. Определение химерного гена TMPRSS22-ERG в ткани демонстрирует высокую специфичность (до 99%) и чувствительность (до 86%) при РПЖ [8].
Слияние генов TMPRSS2 и ERG наблюдается примерно в 50-70% случаев РПЖ [15].
Установлено в исследованиях, что ген TMPRSS2-ERG высоко специфичен и встречается в 50% случаев у европейцев с РПЖ [13].
Комбинация генов PCA3 и TMPRSS2-ERG, предложенная в 2007 году, позволяет повысить диагностический потенциал обоих маркеров и с большей точностью прогнозировать наличие клинически значимого РПЖ [4].
Цель исследования состояла в определении диагностической значимости комплексного исследования экспрессии генов PCA3 и TMPRSS2-ERG методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени в образцах мочи при диагностике РПЖ.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились образцы клеточного осадка мочи, полученной без массажа простаты у пациентов с результатами гистологического исследования биопсии простаты. Образцы клеточного осадка мочи с результатами гистологических исследований биопсийного материала были предоставлены ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ» (г. Казань). Всего было исследовано 37 образцов.
Для получение клеточного осадка мочу центрифугировали в течение 20 минут при 5 тыс. оборотов/минуту, после чего стерильными наконечниками удаляли супернатант, а к осадкам добавляли раствор для стабилизации и хранения РНК (ЗАО «Евроген»). Для хранения и транспортировки осадков мочи для стабилизации РНК был добавлен фиксатор IntactRNA для стабилизации РНК (ЗАО «Евроген») в количестве 1 мл. Перед выделением РНК проводили промывание осадков от фиксатора и нерастворимых солей с использованием стерильного физиологического раствора, а также добавлялся внутренний контрольный образец.
Выделение РНК из осадков проводили с использованием набора «РеалБестЭкстракция» согласно инструкции. Реакцию обратной транскрипции проводили набором реагентов для выявления экспрессии мРНК гена PCA3 и определения уровня его экспрессии с использованием набора «Проста-Тест» (ООО «ТестГен») согласно инструкции производителя.
Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР-реакции по определению относительного уровня экспрессии гена PCA3 и уровня экспрессии гена T2E с использованием разработанной мультиплексной тест-системы и набора реагентов «Проста-Тест» (ООО «ТестГен»).
Разработанная мультиплексная система включает в себя несколько пар праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, обеспечивающих одновременное обнаружение экспрессии комплекса генов-онкомаркеров T2E и PCA3.
Контроль взятия материала, выделение РНК и прохождение реакции обратной транскрипции проводился при постановке реакции ПЦР с добавлением в те же пробирки специфично подобранных прайме-ров на ген KLK3.
Для приготовления реакционной смеси использовались следующие реактивы: 5х кратный ПЦР буфер (ЗАО «Евроген»), стерильная вода. Концентрации праймеров и флуоресцентных зондов были подобраны экспериментально. Для проведения реакции амплификации был использован прибор с детекцией в режиме реального времени DTprime (ООО «ДНК-Технология»).
Оценка относительного уровня экспрессии гена PCA3 проводилась на основании расчетов отношения PCA3/KLK3 согласно формуле, указанной в инструкции к набору «Проста-тест».
Оценка экспрессии химерного гена TMPRSS2-ERG проводилась качественным способом на основе графика накопления флуоресцентного сигнала для данной мишени с пороговым циклом (Cp) не менее 40.
Прогностическую значимость мультиплексной системы оценивали путем сравнения результатов определения относительного уровня гена PCA3 и уровня экспрессии гена TMPRSS2-ERG с результатами гистологического исследования биопсийного материала.
Результаты и их обсуждение. Было проанализировано 37 образцов мочи, из которых для 20 был подтвержден диагноз рака предстательной железы гистологическим исследованием, а для 17 образцов получено отрицательное гистологическое заключение.
Из 20 образцов с положительным гистологическим заключением высокий уровень относительной экспрессии при использовании набора «Проста-тест» показало 16 образцов (43%), а при использовании мультиплексной системы - 17 образцов (45%), при этом экспрессия химерного гена была выявлена в 1 образце (3%). Из 17 отрицательных образцов высокий уровень экспрессии гена PCA3 при использовании набора «Проста-тест» показали 9 образцов (24%), при использовании мультиплексной системы - 4 образца (11%). При этом у образца в гистологическом заключении которого стоит хроническое воспаление в стадии обострения наблюдается высокая экспрессия гена PCA3 и гена TMPRSS2-ERG.
Таким образом, разработанная мультиплексная система для определения экспрессии маркеров рака предстательной железы имеет следующие диагностические показатели: чувствительность - 85%, специфичность - 71%, положительная прогностическая ценность - 77%, отрицательная прогностическая ценность - 80%, диагностическая точность - 78%.
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2022 - Vol. 29, № 4 - P. 108-110
В ранее проведенных исследованиях установлено, что неинвазивное определение продукта слияния генов TMPRSS2 и ERG или ETV1 возможно в моче методом ПЦР-РВ, специфичность при этом составляет 94 % для РПЖ, чувствительность же составляет 37 %, однако при комбинации с определением PCA3 чувствительность повышается до 73 % [10].
TMPRSS2-ERG коррелирует с индексом Глисона и объемом опухоли, а в совокупности с PCA3 предсказательная способность наличия РПЖ при биопсии повышается и позволяет использовать комбинацию этих маркеров для стратификации РПЖ по группам риска [1,4,6,9,11].
Выводы. Полученные результаты показывают, что разработанная мультиплексная система достаточно с высокой точностью (78%) может выявлять экспрессию генов PCA3 и TMPRSS2-ERG. Несмотря на то, что экспрессия химерного гена была выявлена только в 3% случаев, комбинация данных генов показывает большую чувствительность и специфичность по сравнению с набором «Проста-тест», что подтверждается гистологическим заключением.
Литература / References
1. Аполихин О.И., Сивков А.В., Ефремов Г.Д. PCA3 и TMPRSS2-ERG в диагностике рака предстательной железы: первый опыт применения комбинации маркеров в России // Экспериментальная и клиническая урология. 2015. №2. С. 30-36 / Apolikhin OI, Sivkov AV, Efremov GD. PCA3 i TMPRSS2-ERG v diagnostike raka predstatel'noy zhelezy: pervyy opyt primeneniya kombinatsii markerov v Rossii [PCA3 and TMPRSS2-ERG in the diagnosis of prostate cancer: the first experience of using a combination of markers in Russia]. Eksperimental'naya i klinicheskaya urologiya. 2015;2:30-6. Russian.
2. Клинические рекомендации «Рак предстательной железы», Утвержденные Министерством здравоохранения России, 2018 / Klinicheskie rekomendatsii «Rak predstatel'noy zhelezy», Utverzhdennye Ministerstvom zdravookhraneniya Rossii [Clinical guidelines "Prostate Cancer", Approved by the Ministry of Health of Russia]; 2018. Russian.
3. Пушкарь Д.Ю., Говоров А.В., Сидоренков А.В., Прилеп-ская Е.А., Ковылина М.В. Ранняя диагностика рака предстательной железы: методические рекомендации. Москва, 2015. №19, 56 с. / Pushkar' DYu, Govorov AV, Sidorenkov AV, Prilepskaya EA, Kovylina MV. Rannyaya diagnostika raka predstatel'noy zhelezy: metodicheskie rekomendatsii [Early diagnosis of prostate cancer: guidelines]. Moscow; 2015. №19. Russian.
4. Сивков А.В., Ефремов Г.Д., Михайленко Д.С., Григорьева М.В. Комбинация маркеров PCA3 и TMPRSS2-ERG в ранней диагностике рака предстательной железы (обзор литературы) // Экспериментальная и клиническая урология. 2014. №3. С. 20-23 / Sivkov AV, Efremov GD, Mikhaylenko DS, Grigor'eva MV. Kombinatsiya mark-erov PCA3 i TMPRSS2-ERG v ranney diagnostike raka predstatel'noy zhelezy (obzor literatury) [Combination of PCA3 and TMPRSS2-ERG markers in early diagnosis of prostate cancer (literature review)]. Eksperimental'naya i klinicheskaya urologiya. 2014;3:20-3. Russian.
5. Тороповский А.Н., Никитин А.Г., Павлова О.Н., Викторов Д.А. Перспективы совершенствования диагностики рака предстательной железы на основе анализа гена РСА3 // Урология. 2019. №2. С. 82-87 / Toropovskiy AN, Nikitin AG, Pavlova ON, Viktorov DA. Perspektivy sovershenstvovaniya diagnostiki raka predstatel'noy zhelezy na osnove analiza gena RSA3 [Prospects for improving the diagnosis of
prostate cancer based on the analysis of the PCA3 gene]. Urologiya. 2019;2:82-7. Russian.
6. Arlen P.M., Bianco F., Dahut W.L. Prostate Specific Antigen Working Groupguidelines on prostate specific antigendoubling time // J Urol. 2008. Vol. 179, N6. P. 2181-2185 / Arlen PM, Bianco F, Dahut WL. Prostate Specific Antigen Working Groupguidelines on prostate specific antigendoubling time. J Urol. 2008;179(6):2181-5.
7. Babaian R.J., Mettlin C., Kane R., Murphy G.P., Lee F., Drago J.R., Chesley A. The relationship of prostate-specific antigen to digital rectal examination and transrectal ultrasonography: findings of the American Cancer Society National Prostate Cancer Detection Project // Cancer. 1992. Vol. 69, N 5. P. 1195-1200 / Babaian RJ, Mettlin C, Kane R, Murphy GP, Lee F, Drago JR, Chesley A. The relationship of prostate-specific antigen to digital rectal examination and transrectal ultrasonography: findings of the American Cancer Society National Prostate Cancer Detection Project. Cancer. 1992;69(5):1195-200.
8. Clark J., Merson S., Jhavar S. Diversity of TMPRSS2-ERG fusion transcripts in the human prostate // Oncogene. 2007. Vol. 26. P. 26672673 / Clark J, Merson S, Jhavar S. Diversity of TMPRSS2-ERG fusion transcripts in the human prostate. Oncogene. 2007;26:2667-73.
9. Hessels D., Smit F.P., Verhaegh G.W. Detection of TMPRSS2-ERG fusion transcripts and prostate cancer antigen 3 in urinary sediments may improve diagnosis of prostate cancer // Clinical Cancer Res. 2007. Vol. 13. P. 5103-5108 / Hessels D, Smit FP, Verhaegh GW. Detection of TMPRSS2-ERG fusion transcripts and prostate cancer antigen 3 in urinary sediments may improve diagnosis of prostate cancer. Clinical Cancer Res. 2007;13:5103-8.
10. Leyten G.H., Hessels D., Jannink S.A. Prospective multicentre evaluation of PCA3 and TMPRSS2-ERG gene fusions as diagnostic and prognostic urinary biomarkers for prostate cancer // Eur Urol 2014. Vol. 65, N3. P. 534-542 / Leyten GH, Hessels D, Jannink SA. Prospective multicentre evaluation of PCA3 and TMPRSS2-ERG gene fusions as diagnostic and prognostic urinary biomarkers for prostate cancer. Eur Urol. 2014;65(3):534-42.
11. Lin D.W., Newcomb L.F., Brown E.C. Urinary TMPRSS2:ERG and PCA3 in an active surveillance cohort: results from a baseline analysis in the canary prostate active surveillance study // Clin Cancer Res. 2013. Vol. 19. P. 2442-2450 / Lin DW, Newcomb LF, Brown EC. Urinary TMPRSS2:ERG and PCA3 in an active surveillance cohort: results from a baseline analysis in the canary prostate active surveillance study. Clin Cancer Res. 2013;19:2442-50.
12. Luo Y., Gou X., Huang P., Mou C. Prostate cancer antigen 3 test for prostate biopsy decision: a systematic review and meta analysis // Chin Med J. 2014. Vol. 127, N 9. P. 1768-1774 / Luo Y, Gou X, Huang P, Mou C. Prostate cancer antigen 3 test for prostate biopsy decision: a systematic review and meta analysis. Chin Med J. 2014;127(9):1768-74.
13. PCA3 and TMPRSS2-ERG gene fusions as diagnostic bi-omarkers for prostate cancer Chin // J Cancer Res. 2016. Vol. 1. P. 65-71 / PCA3 and TMPRSS2-ERG gene fusions as diagnostic biomarkers for prostate cancer Chin J Cancer Res. 2016;28(1):65-71.
14. Petrovics G., Liu A., Shaheduzzaman S. Frequent overexpression of ETS-related gene-1 [ERG1] in prostate cancer transcriptome // Oncogene. 2005. Vol. 24. P. 3847-3852 / Petrovics G, Liu A, Shaheduzzaman S. Frequent overexpression of ETS-related gene-1 [ERG1] in prostate cancer transcriptome. Oncogene. 2005;24:3847-52.
15. Van Leenders G.J., Boormans J.L., Vissers C.J. Antibody EPR3864 is specific for ERG genomic fusions in prostate cancer: implications for pathological practice // Mod Pathol. 2011. Vol. 24, N8. P. 11281138 / Van Leenders GJ, Boormans JL, Vissers CJ. Antibody EPR3864 is specific for ERG genomic fusions in prostate cancer: implications for pathological practice. Mod Pathol. 2011;24(8):1128-38.
16. Vlaeminck-Guillem V., Bandel M., Cottancin M., Rodriguez-Lafrasse C., Bohbot J.M., Sednaoui P. Chronic prostatitis does not influence urinary PCA3 score // Prostate. 2012. Vol. 72, Iss. 5. P. 549-554 / Vlaeminck-Guillem V, Bandel M, Cottancin M, Rodriguez-Lafrasse C, Bohbot JM, Sednaoui P. Chronic prostatitis does not influence urinary PCA3 score. Prostate. 2012;72(5):549-54.
Библиографическая ссылка:
Куклина Н.Г., Викторов Д.А., Тороповский А.Н., Павлова О.Н., Гуленко О.Н., Варфоломеева Л.Г. Разработка мультиплексной ПЦР-тест-системы для диагностики рака предстательной железы // Вестник новых медицинских технологий. 2022. №4. С. 108-110. БОТ: 10.24412/1609-2163-2022-4-108-110. ББМ ^УКХО.
Bibliographic reference:
Kuklina NG, Viktorov DA, Toropovskij AN, Pavlova ON, Gulenko ON, Varfolomeeva LG. Razrabotka mul'tipleksnoy PTsR-test-sistemy dlya diagnostiki raka predstatel'noy zhelezy [Development of a multiplex PCR test system for the diagnosis of prostate cancer]. Journal of New Medical Technologies. 2022;4:108-110. DOI: 10.24412/1609-2163-2022-4-108-110. EDN JZVKXO. Russian.
