CC BY
41ВКВО-2019- Стендовые
РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
Максимов А.Ю.1*, Шилова А.В.2'Варушкина А.М.2
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН - филиал ПФИЦ УрО РАН, г.Пермь 2 Пермский федеральный научный центр УрО РАН, г. Пермь * E-mail: almaks1@mail.ru
DOI 10.24411/2308-6920-2019-1610182
Разработка и использование методов молекулярных исследований с применением флуоресцентных меток является важным направлением биофотоники. Бурное развитие флуоресцентных методов в сопряжении с микрочиповыми технологиями, достижениями в области микрофлюидики, микроэлектроники и других направлений привело к новому этапу развития и автоматизации молекулярно-биологических исследований, появлению omics-направлений, таких, как геномика, протеомика, метаболомика и т.д. В частности, совершенствуются методы и аппараты для полимеразной цепной реакции в реальном времени, гибридизации нуклеиновых кислот, высокопроизводительного секвенирования, флуоресцентного иммуноанализа и др. Важным приложением данных методов является генетический анализ и выявление патогенов с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов.
Инфекционные заболевания являются одной из основных угроз в процессах выращивания и хранения продуктов сельского хозяйства. В частности, они наносят значительный экономический ущерб картофелеводству. Своевременное выявление фитопатогенов особенно важно в процессах селекции новых сортов растений и поддержания семенного фонда.
В настоящее время в России разработаны диагностические системы для выявления большого количества вирусных и бактериальных заболеваний картофеля (www.syntol.ru/catalog/nabory-reagentov-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/dlya-vyyavleniya-fitopatogenov.html). Диагностикумы к другим возбудителям, таким как фитоплазмы картофеля, находятся в стадии разработки. При этом неохваченными являются такие важные, распространенные в средней полосе России и наносящие огромный ущерб фитопатогены, как грибы-микромицеты и другие инфекционные эукариотические микроорганизмы , ранее относимые к грибам (в частности, виды Phoma exiqua, Fusarium oxysporum и Phytophthora infestans). В то же время их диагностика по морфологическим признакам возможна лишь на поздних стадиях заражения, что сопряжено с быстрым распространением этих патогенов.
Для разработки диагностической системы получены изоляты фитопатогенных микроорганизмов методом прямого высева на селективные среды из клубней картофеля с признаками характерных заболеваний - фитофтороза, фомоза, фузариоза. Образцы зараженных клубней картофеля были отобраны ранее в ходе многолетнего мониторинга в хозяйстве ООО «Труженик» Краснокамского района и других агрофирмах Пермского края. Для выделения культур были использованы две основные среды - картофельный агар и среда Чапека, а также селективные среды для исследуемых возбудителей. Идентификация изолятов проводилась методами полифазной таксономии по культурально-морфологическим, хемотаксономическим, биохимическим признакам. Основными критериями для первичной идентификации фитопатогенных грибов являлось определение морфологических признаков, в т.ч. особенностей конидиогенеза.
Проведена разработка методологии детекции исследуемых фитопатогенов, в том числе ПЦР -анализ по генам рибосомальных РНК, в частности, 18S РНК, для плесневых грибов.
Проведен анализ и тестирование методов ПЦР-детекции исследуемых фитопатогенов. Выбраны ПЦР-системы, эффективные для обнаружения исследуемых фитопатогенов. В настоящее время существует большое количество ПЦР-систем для диагностики фитофторозов [1-5].
Для конструкирования праймеров и флуоресцентных зондов из базы данных GenBank (сайт Национального центра биотехнологической информации - NCBI) выбирали последовательности ДНК, включающие ген 18S рРНК, внутренний транскрибируемый спейсер 1, ген 5,8S рРНК и внутренний транскрибируемый спейсер 2 в кластере генов рРНК видов Fusarium oxysporum, Phoma exiqua, Phytophthora infestans, а также других видов и представителей близких родов. Для сравнения брали последовательности размером 1000 - 1900 п.н. Проводили множественное выравнивание, сравнивали и анализировали последовательности с помощью интерфейса ClustalW и программ
348 №6 2019 СПЕЦВЫПУСК «ФОТОН-ЭКСПРЕСС-НАУКА 2019» www.fotonexpres.rufotonexpress@mail.ru
ВКВ0-2019 Стендовые
VectorNTI 11.5. Таким образом, выявляли генетические полиморфизмы, отличающие исследуемые виды.
В качестве исходных для конструирования праймеров брали последовательности длиной до 40 п.н., которые отличались на 1 или несколько нуклеотидов с 3' конца. Выбранный участок ДНК проверяли на специфичность с помощью онлайн-сервиса BLAST nucleotide. Исходя из результатов анализа в этой программы было видно, на сколько выбранные олигонуклеотиды специфичны к выявляемой последовательности.
Для определения температурных параметров праймера, использовали программный пакет Vector NTI 11.5. На основе проанализированных последовательностей выбраны группы олигонуклеотидов, содержащие полиморфизмы на З'-концах и выявляющие межвидовые различия.
Синтез олигонуклеотидов проводили на установке ASM-2000 (Биоссет, Новосибирск). Все олигонуклеотиды в виде пар были исследованы на специфичность и отсутствие неспецифического связывания в полимеразной цепной реакции. Выбраны олигонуклеотиды, показывающие наиболее стабильные результаты без появления неспецифических продуктов.
Таким образом, на основе специфичных олигонуклеотидов, комплементарных к последовательностям кластера генов рибосомальных РНК разработаны методы ПЦР и ДНК -гибридизации для выявления эукариотических фитопатогенов картофеля. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 17-45-590657.
Литература
1. A 'Hara D., et al. Methods Mol Biol. 1302, 17-27 (2015)
2. Barrera V., et al. Revista Argentina de microbiología 45(4):277-281 (2013)
3. Hussain T., et al. Saudi JBiol Sci. 21(4), 380-386 (2014)
4. Hussain T., et al. Türk Tarim ve Doga Bilimleri Dergisi 4(1) 63-69 (2016)
5. Xu R., et al. Lett ApplMicrobiol. 62(2), 153-159 (2016)
№6 2019 СПЕЦВЫПУСК «ФОТОН-ЭКСПРЕСС-НАУКА 2019»
www.fotonexpres.rufotonexpress@mail.ru 349
