CC BY
2УДК 577.212.3:635.64:631.527
О. Г. Бабак, Е. В. Дрозд, Н. А. Некрашевич, Н. В. Анисимова, К. К. Яцевич, А. В. Кильчевский
РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ НАКОПЛЕНИЯ АНТОЦИАНОВ В ПЛОДАХ И ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕНОВ ANT1, AN2 И ATV У SOLANUM
LYCOPERSICUM
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: o.babak@igc.by
Выполнено ресеквенирование генов Anti, An2 и Atv MYB ТФ на коллекции образцов S. lycopersicum и близких диких видов томата с различным накоплением антоцианов в плодах. Разработаны новые молекулярные маркеры для ДНК-типирования аллелей генов Anti (SCAR Ant1.1-FAM), An2 (SCAR An2-AFT (OM), SCAR An2-4F/R), Atv (SCAR Atv2), подтверждена их высокая эффективность. Показано тесное сцепление аллелей Anti и An2-Aft, anti и Myb75 генов Anti и An2. Обнаружен новый аллель гена An2 у S. glandulosum (An2-Ins57), отличительные полиморфизмы которого от Myb75 ведут к шести аминокислотным заменам в белковой последовательности, две из них расположены в области первого и второго ДНК-связывающих доменов. Выявлено максимальное накопление антоцианов в вегетативных органах и плодах у образцов с аллелями Anti/An2-Aft/atv в генотипе. Сочетание аллелей anti/Myb75/Atv связано с отсутствием антоцианов в различных частях растения. Комбинация аллелей Anti/An2-Aft/Atv обеспечивает слабое накопление антоцианов в вегетативных органах, но высокое их накопление в кожице плодов.
Ключевые слова: Solanum lycopersicum, полиморфизм генов Anti, An2 и Atv, регуляция синтеза антоциа-нов, ДНК маркеры.
Введение
Несмотря на относительный успех, достигнутый в увеличении содержания антоцианов в плодах томатов с помощью трансгенеза [1], потребность современного мирового общества в продуктах для здорового питания обеспечивает интерес к созданию сортов с высоким содержанием антоцианов, полученных без использования методов генной инженерии. В связи с этим изучение вопросов генетической регуляции биосинтеза антоцианов в плодах и поиск новых источников повышения их концентрации является актуальной задачей.
Sapir M. с соавторами [2], изучая Anthocyaninfruit (Aft) фенотипы томата с пурпурным цветом кожицы и наружного слоя околоплодника, установили, что доминантный аллель гена Anthocyanini (Anti) из S. chilense увеличивает количество флавоно-идов в плодах томатов. Они показали, что наряду с антоцианами Aft-фенотипы S. chilense характеризуются значительно более высоки-
ми уровнями флавонолов кверцетина и кемп-ферола, что повышает их функциональную ценность. Авторы указывали на полную ассоциацию Aft фенотипа с геном Anti, кодирующим Myb фактор транскрипции и его отличия по нуклеотидному и аминокислотному составу у S. chilense и S. lycopersicum [1]. Изучение генетики близкородственных диких видов позволило выделить и интрогрессировать источники повышения концентрации антоци-анов в плодах S. lycopersicum. Интрогрессия доминантного аллеля Anti из Solanum chilense в сорта окультуренного томата привела к незначительному светозависимому накоплению антоцианов в кожуре плодов [3-6]. Наряду с геном Anthocyanini (Anti), Aft-фенотип связан с полиморфизмом генов MYB ТФ An2 (локус NC_015447, хромосома 10), AN2-like (локус OP094092.1, хромосома 10), ATV (локус NC_015444, хромосома 7) [7]. В связи с недостаточной изученностью аллельного полиморфизма указанных генов в литературе
чаще говорится о генах, связанных с фенотипом Aft, чем указываются конкретные сочетания аллелей [3-6].
Известно, что рецессивный аллель гена atroviolacea (atv) из Solanum cheesmaniae в сортах культурного томата приводил к накоплению антоциана в вегетативных органах и плодах [8]. X. Cao с соавторами [8] показали, что добавление аллеля atv к Aft комплексу генов приводило к резкому увеличению пигментации антоциа-нов в кожуре плодов, особенно в стрессовых условиях (избыточный солнечный свет, пониженные температуры), что указывает на то, что ген Aft взаимодействует с геном atv в регуляции биосинтеза антоцианов.
В ранее выполненных исследованиях на основе данных по полиморфизму гена Anti [2] нами апробированы SCAR маркер Ant1_NcoI, позволяющий дифференцировать формы томата по наличию в генотипе аллелей anti или Anti, и SCAR маркер Atv-Ins, позволяющий выявлять в генотипах аллели atv или Atv [8]. ДНК-маркирование известных аллелей и фенотипическая оценка широкой коллекции форм томата по признаку накопления анто-цианов в вегетативных органах и плодах не смогла объяснить всех имеющихся фенотипов, связанных с накоплением антоцианов в плодах. На основе информации из базы данных NCBI были обнаружены последовательности двух аллелей гена An2: An2-Aft,Myb75. В связи с чем целью нашей работы был поиск новых полиморфизмов генов Anthocyanin1 (Anti), Anthocyanin2 (An2), Atroviolacea (Atv), изучение их взаимодействия для использования в селекции, направленной на улучшение качества плодов томата. Для этого были поставлены следующие задачи: оценить наблюдаемое фенотипическое проявление признака «накопление антоцианов в вегетативных органах и плодах томата» на разных стадиях развития
растений; выявить полиморфизм изучаемых генов Anti, An2 и Atv путем ресеквенирования у форм Solanum lycopersicum и диких видов (подвидов) томата с различным накоплением антоцианов в вегетативных органах и плодах; подобрать ДНК-маркеры для типирования выявленных полиморфизмов и оценить возможность маркирования новых фенотипических проявлений накопления антоцианов на основе выявленных структурных изменений последовательностей изучаемых генов.
Материалы и методы
Объектами для исследований полиморфизма генов Anti, An2 и Atv являлись константные формы c различным характером накопления антоцианов в плодах и вегетативных органах (рис. 1, 2).
Образцы Дачный и Линия № 17-2020 характеризуются отсутствием накопления ан-тоцианов в плодах, формы Индиго, Дзивосны и Октябрята имеют повышенное накопление антоцианов в кожице плодов с максимальным проявлением у образца Октябрята, которое приводит к практически черной окраске плода на стадии технической спелости. Особенностью формы Бурштын является неравномерное распределение антоциана по поверхности плода с образованием так называемого янтарного рисунка. Форма Белесый ИСИ на стадии технической спелости характеризуется отсутствием накопления антоциа-нов, а также низким накоплением хлорофилла в вегетативных органах и плодах, образец Blue leaf характеризуется высоким накоплением ан-тоцианов в вегетативных органах и их отсутствием в плодах (рис. 1, 2).
Наряду с образцами S. lycopersicum для исследований были использованы восемь родственных диких форм: S. pimpinellifolium, S. humboldtii, S. glandulosum, S. peruvianum,
А Б В Г Д E Ж
Рис. 1. Формы c различным фенотипическим проявлением признака «накопление антоцианов в плодах на стадии технической и биологической спелости»: А — Дачный; Б — Линия № 17-2020; В — Индиго; Г — Дзивосны;
Д — Октябрята; Е — Бурштын; Ж — Белесый ИСИ
Рис. 2. Формы c различным накоплением антоцианов в вегетативных органах: А — Blue leaf; Б — Белесый ИСИ
S. chilense, S. cheesmanii, S. paviflorum, S. hirsutum.
Для изучения связи выявленных полиморфизмов генов Anti, An2 и Atv с фенотипом, а также для оценки эффективности разработанных ДНК-маркеров использовались популяции F2 с различным составом аллелей гена Anthocyanini (Anti): 157 индивидуальных растений гибрида Индиго (Anti) х Дачный (anti), 79 растений гибрида Индиго (Anti) х № 172020 (anti), а также 370 растений популяций F3 из указанных гибридов.
Выделение ДНК проводили при помощи набора реагентов компании Праймтех из молодых верхушечных листьев растений томата согласно протоколу производителя. Концентрацию ДНК в образце определяли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro.
Секвенирование последовательностей Anti, An2 и Atv проводили с подобранными геноспецифическими праймерами на основе последовательности участка хромосомы 10 томата (EF433416.1), где локализован ген
Anti, хромосомы 10 томата (NC_015447.3), где локализован ген An2, хромосомы 7 томата (NC_015444.3), где локализован ген Atv (табл. 1). Использовали набор реагентов Big Dye® Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit согласно методике производителя. Для дизайна праймеров использовали программу Primer-BLAST на сайте Центра биотехнологической информации NCBI [7].
Продукты секвенирующей реакции очищали спиртовым осаждением и растворяли в 20 мкл формамида, денатурировали нагреванием до 95 °С в течение 2 мин и далее проводили капиллярный электрофорез с использованием ДНК-секвенатора Genetic Analyzer 3500. Компьютерную обработку данных, полученных в результате секвенирования, проводили в программе Sequencing Analysis Software v 5.2.
Для построения аминокислотных последовательностей использовали программу Blast на сайте Центра биотехнологической информации NCBI [7].
ДНК-типирование материала с разработанными маркерами проводили согласно разработанным протоколам ДНК-идентификации аллелей изучаемых генов [9].
Эффективность разработанных маркеров оценивали по соответствию между наблюдаемым фенотипическим и ожидаемым по результатам ДНК-типирования расщеплениям изучаемых признаков методом Хи-квадрат (х2), где общей мерой отклонения практических данных от теоретических, т. е. критерия соответствия х2, является сумма отношений квадратов разностей между частотами практического f и теоретического Fn распределений к частотам теоретического Fn распределения для данной выборки (формула 1) [10].
X2 = I (fn-Fn)2) / Fn (1)
Таблица 1
Праймеры для секвенирования генов Anti, An2, Atv у томата
Ген, белок Наименование праймера Последовательность праймера, 5' ^ 3' T отжига, °С Размер ПЦР продукта, н. п.
ANTi, R2R3MYB ТФ An1-1F/R CTCTCTACAAGTTGGTAGTTACAA 56 678
CACACTTATTGTTAATCTTTTCGCGA
An1-2F/R ATGCAAGTTTATGTTTTGACAAA 50 754
CATTCTAACAACATTAATTACTTC
Окончание таблицы 1
Ген, белок Наименование праймера Последовательность праймера, 5' ^ 3' T отжига, °С Размер ПЦР продукта, н. п.
An2-1F/R CACCATGAATACTCCTATGTGTGC 59 792
AGACAAACCGTGCTAGTCTCATT
An2-2F/R TTAAACAATCATCGTTGTCTGAT 54 928
TTAATTAAGTAGATTCCATAAGTCAATATC
An2-1.1F/R ATTACAAGTGTCATTTTGTGGAAAG 51 370
TCAAAACTTAGAATTTAGTAAATC
MYB75 (AN2), An2-4F/R ACTTCACAAACTCTTAGGCAATAG 56 580
R2R3MYB ТФ AGTCTACCAGCAATAAGTGACCAC
An2-3.1F/R ACTGGAAAATTGCATTGAAATTG 51 352
ATATTCTTTAATACCAACTAAGGAT
An2-1AFTF GGCATCTTGTTCCTGCTAGAGCTG 61 907
GTCTACCAGCAATAAGTGACCACC
An2-2AFTF TCCAGATGAAGTGGATCTCATCTT 59 1 056
ACGGTGGTGATATTTCCTCATGTAAC
Atv1F/R CAGTCGATATTTGAGTATCCACC 52 728
GTATTTTGGAAGTAGCCAAAAGG
Atv2F/R CTAATGAGCTAAGGGTAAACATG 52 795
TTATGAAGTACATCGAATTAATATTAG
Atv3F/R TTTTGTGTATTAATTATTTAAGGTTT 50 586
ATGTATTCGCGCTTGTATTATTG
ATV, Atv4F/R TTATCTAACTTATCTACTGTAGATTAT 52 461
R3MYB ТФ GATATTCACTGTGTATACTGTTC
Atv5F/R TATTCGTTAGGTAAGATACAATA 50 477
ATTGATATCTAGTGAATAATACTT
Atv6F/R CATTTACTTTATTTTTACTTTATCTACTTT 52 608
AATAGTTGAGGCCCAATATCTGA
Atv7F/R CATTATCTGTAACGTTTTTATTAGG 52 712
TAAACAATTGTGTCGTCAAACAC
Результаты исследования
Секвенирование гена Anthocyaninl (EF433416.1) проводилось на коллекции образцов томата Бурштын, Дзивосны, Дачный, Индиго, фенотипическое описание которых представлено в разделе «Материалы и методы» и на рисунке 1. Данная коллекция использована, чтобы выяснить, связаны ли описанные особенности накопления антоциа-нов с полиморфизмом данного гена. В результате ресеквенирования гена Antl у четырех коллекционных образцов было обнаружено два аллеля гена Antl. Из проанализированных образцов сорт Дачный характеризуется нали-
чием аллеля antl, описанного в базе данных (EF433416.1), а сорта Дзивосны, Индиго и Бурштын — аллеля Antl. У аллеля antl у сорта Дачный с наименьшим накоплением антоциа-нов в плодах выявлены следующие отличия от аллеля Antl: 12 SNP в экзонных и 10 интрон-ных областях, инсерция 4 н. п. в интроне 1, что соответствует найденной последовательности аллеля antl (EF433416.1) (рис. 3).
Белковые последовательности с указанием аннотированных регуляторных элементов ТФ, формируемые на базе двух аллелей Antl и antl (рис. 4), различаются между собой наличием восьми аминокислотных замен за пределами
1 Anl-1F 1
3. lycopersicum ANTI EF433416.1 “ Дзивосны Бурштын Дачный Индиго 2020
20
Anl.lF
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
С AAATTATI С AAATTATT САААТТАТТ САААТТАТТ
ATGААСAGTACАТСTATGTCТТСATTGGGAGTGAGAAAAGGTTCATGGACTGATGAAGAAGATTTTСТТСTAAGAAAATGTATTGATAAGTATGGTGAAGGAAAATGGCАТС ТТ ATG AACAGTACАТСTATGTCТТСATTGGGAGTGAGAAAAGGTTCATGGACTGATGAAGAAGATTTTCТТТТAAGAAAATGTATTGATAAGTATGGTGAAGGAAAATGGCАТС ТТ ATGAACAGTACАТС TATGTC ТТСATTGGGAGTGAGAAAAGGTTCATGGACTGATGAAGAAGATTTTC ТТТТAAGAAAATGTATTGATAAGTATGGTGAAGGAAAATGGCАТС ТТ ATG AAC AGTAC АТС TATGTC TTCATTGGGAGTGAGAAAAGGTTCATGGACTGATGAAGAAGATTTTCТТСTAAGAAAATGTATTGATAAGTATGGTGAAGGAAAATGGCАТС TT ATGAACAGTACАТСTATGTCTTC ATTGGGAGTGAGAAAAGGTTCATGGACTGATGAAGAAGATTTTCTTTTAAGAAAATGTATTGATAAGTATGGTGAAGGAAAATGGCАТС TT
S. lycopersicum ANTI EF433416.1 Дзивосны Бурштьш Дачный
Индиго 2020
S. lycopeisicum ANTI EF433416.1 Дзивосны Бурштьш Дачный Индиго 2020
Старт-конок
. ШМ.........ЕЛЯ.
150
160
170
180
190
Первым эк: он
200
210
220
230
240
GTTCCCATAAGAGCTGGTAACTATTAAATTAACTATCACGTTATTTTTATTTGTCTTTCTGTCTCATTTTATTTGACGTTATTACGAATATCATCTGAAAATGTACGTGCAGGTCTGAATAGA
GTTCCCATAAGAGCTGGTAATTATTAAACTGACTATCACGTTATTTTTATCTGTCT----GTCTCATTTTATATGACGTTATTTTGAACATTATCTGAAAATGTACGTGCAGGTCTGAATAGA
GTTCCCATAAGAGCTGGTAATTATTAAACTGACTATCACGTTATTTTTATCTGTCT----GTCTCATTTTATATGACGTTATTTTGAACATTATCTGAAAATGTACGTGCAGGTCTGAATAGA
GTTCCCATAAGAGCTGGTAACTATTAAATTAACTATCACGTTATTTTTATTTGTCTTTCTGTCTCATTTTATTTGACGTTATTACGAATATCATCTGAAAATGTACGTGCAGGTCTGAATAGA GTTCCCATAAGAGCTGGTAATTATTAAACTGACTATCACGTTATTTTTATCTGTCT----GTCTCATTTTATATGACGTTATTTTGAACATTATCTGAAAATGTACGTGCAGGTCTGAATAGA
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
Anl.lR-F.AM Второй эк юн
350- 1
360
TGTCGGAAAAGTTGTAGATTGAGGTGGGTGAATTATCTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGAACAAGATGAAGTGGATCTCATTTTGAGGCTTCATAAGCTCTTAGGGAACAGGCAT
TGTCGGAAAAGTTGTAGATTGAGGTGGCTGAATTATCTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGAACAAGATGAAGTGGATCTCATTTTGAGGCTTCATAAGCTCTTAGGCAACAGGCAT
TGTCGGAAAAGTTGTAGATTGAGGTGGCTGAATTATCTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGAACAAGATGAAGTGGATCTCATTTTGAGGCTTCATAAGCTCTTAGGCAACAGGCAT
TGTCGGAAAAGTTGTAGATTGAGGTGGGTGAATTATCTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGAACAAGATGAAGTGGATCTCATTTTGAGGCTTCATAAGGTCTTAGGGAACAGGCAT
TGTCGGAAAAGTTGTAGATTGAGGTGGCTGAATTATCTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGAACAAGATGAAGTGGATCTCATTTTGAGGCTTCATAAGCTCTTAGGCAACAGGCftT
370| ,370 380
3. lycopersicum ANTI EF433416.1 Дзивосны Бурштьш Дачный Индиго 2020
3. lycopersicum ANTI EF433416.1 Дзивосны Бурштьш Дачный Индиго 2020
390
400
410
430
440
450
460
470
480
490
GC AAGTTTATGTTTTGAC AAAATTTGATTAGTATATATTATATATAC GTGTGACТАТТТС АТСTAAATGTTACGTTATTTTACGTAGATGGTCАСTTATTGCTGGTAGACТТСCCGGAAGGAC GC AAGTTTATGTTTTGACAAAATTTGATTAGTATАТАТТАТАТАТАСGTGTGACТАТТТСАТСTAAATGTTACATTАТТТТАСGTAGATGGTCАСTTATTGCTGGTAGACТТС СAGGAAGGАС GCAAGTTTATGTTTTGACAAAATTTGATTAGTATATATTATATATACGTGTGACТАТТТСАТСTAAATGTTACATTАТТТТАСGTAGATGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCAGGAAGGAC GC AAGTTTATGTTTTGACAAAATTTGATTAGTATATATTATATATACGTGTGACТАТТТСАТСTAAATGTTACGTTATTTTACGTAGATGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCCGGAAGGAC AAGTTTATGTTTTGAC AAAATTTGATTAGTATATATTATATATACGTGTGACТАТТТСАТСTAAATGTTACATTАТТТТАСGTAGATGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCAGGAAGGAC
Anl-'F Трети эким ^--------
493|______500_______510________520_______530_______540_______550________560_______570_______580_______590________600_______610
AGCТАACGATGTGAAAAACTATTGGAАСАСТААТСTTC ТАAGGAAGTTAAATACTACTAAAATTGTTCСTCGCGAAAAGATTAACAATAAGTGTGGAGAAATTAGTACТАAGATTGAAATTAT AGG ТАACGATGTGAAAAACTATTGGAАСАСТААТСTTCTAAGGAAGTTAAATACTACTAAAATTGTTCCTCGTGAAAAGACГAACAATAAGTGTGGAGAAATTAGTACTAAGATTGAAATTAT AGC ТА AC GATGTGAAAA AC TATTGGA AC AC TAATC TTC TAAGGAAGTTAA AT AC TAC TAAAATTGTTC C TC GTGAAA AGAC ТА AC AAT AAGTGTGGAGAAATT AGT AC T A AG ATTG A A ATT AT AGC ТАACGATGTGAAAAACTATTGGAACACTAATCTTCTAAGGAAGTTAAATACTACTAAAATTGTTCCTCGCGAAAAGATTAACAATAAGTGTGGAGAAATTAGTACTAAGATTGAAATTAT AGC TAAC GATGTGAAAAAC TATTGGAAC AC TAATC TTC TAAGGAAGTTAAATAC TAC TAAAATTGTTC C TC GTGAAAAGAC ТАAC AATAAGTGTGGAGAAATTAGTАС ТАAGATTGAAATTAT
Antl-NcoIF
3. lycopeisicum ANTI EF433416.1 Дзивосны Бурштьш Дачный Индиго 2020
620
630
640
650
660
Tpei
670
HZ
680
690
700:
J Anl-IR 710
720:
,730: I
AAAACCTCAACGACGCAAGTATTTCTCAAGCACAATGAAGAATGTTACAAACAATAATGTAATTTTGGACGAGGAGGAACATTGCAAGGAAATAATAAGTGAGAAACAAACTCCAGATGCATC
AAAACCTCAACCACGAAAGTATTTCTCAAGCACAATGAAGAATATTACAAACAATATTGTAATTTTGGACGAGGAGGAACATTGCAAGGAAATAAAAAGTGAGAAACAAACTCCAGATGCATC
AAAACCTCAACCACGAAAGTATTTCTCAAGCACAATGAAGAATATTACAAACAATATTGTAATTTTGGACGAGGAGGAACATTGCAAGGAAATAAAAAGTGAGAAACAAACTCCAGATGCATC
AAAACCTCAACGACGCAAGTATTTCTCAAGCACAATGAAGAATGTTACAAACAATAATGTAATTTTGGACGAGGAGGAACATTGCAAGGAAATAATAAGTGAGAAACAAACTCCAGATGCATC
AAAACCTCAACCACGAAAGTATTTCTCAAGCACAATGAAGAATATTACAAACAATATTGTAATTTTGGACGAGGAGGAACATTGCAAGGAAATAAAAAGTGAGAAACAAACTCCAGATGCATC
739
S. lycopersicum ANTI EF433416.1 Дзивосны Бурштьш Дачный
Индиго 2020
3. lycopersicum ANTI EF433416.1 Дзивосны Бурштьш Дачный Индиго 2020
730
3. lycopeisicum A NT 1 EF433416.1 Дзивосны Бурштьш Дачный Индиго 2020
739
740.
. 750.
760
770
780
790
310
. 820.
. 830.
. 840.
. 850.
861
GATGG AC ААС GTAG ATC С ATGGTGGАТАААТТТАС TGGAAAATTGC AATG AC GATATTG'A AGAAGATGAAGAGGTTGTААТТАATTATGААААААС АС ТААС AAGTTTGTTACATGAAGА ААТ GATGGACAACGTAGATCAATGGTGGATAAATTTACTGGAAAATTGCAATGACGATATTGAAGAAGATGAAGAGGTTGTAATTAATTATGAAAAAACACTAACAAGTTTGTTACATGAAGAAAA GATGGACAACGTAGATCAATGGTGGATAAATTTACTGGAAAATTGCAATGACGATATTGAAGAAGATGAAGAGGTTGTAATTAATTATGAAAAAACACTAACAAGTTTGTTACATGAAGAAAA GATGGACAACGTAGATCCATGGTGGATAAATTTACTGGAAAATTGCAATGACGATATTGAAGAAGATGAAGAGGTTGTAATTAATTATGAAAAAACACTAACAAGTTTGTTACATGAAGAAAT GATGGACAACGTAGATCAATGGTGGATAAATTTACTGGAAAATTGCAATGACGATATTGAAGAAGATGAAGAGGTTGTAATTAATTATGAAAAAACACTAACAAGTTTGTTACATGAAGAAAA Сайт рестрнкшш Ncol Треп* экзон
862Е0..... 870...... 880...... 890...... 900...... 910....... 920...... 930...... 940...... 950...... 960...... 970......980
853 ATCACCACCATTAAATATTGGTGAAGGTAACTCCATGCAACAAGGACAAATAAGTCATGAAAATTGGGGTGAATTTTCTCTTAATTTACCACCCATGCAACAAGGAGTACAAAATGATGATTT 858 ATCACCACCATTAAATATTGGTGAAGGTAACTCCATGCAACAAGGACAAATAAGTCATGAAAATTGGGGTGAATTTTCTCTTAATTTACAACCCATGCAACAAGGAGTACAAAATGATGATTT 858 ATCACCACCATTAAATATTGGTGAAGGTAACTCCATGCAACAAGGACAAATAAGTCATGAAAATTGGGGTGAATTTTCTCTTAATTTACAACCCATGCAACAAGGAGTACAAAATGATGATTT 862 ATCACCACCATTAAATATTGGTGAAGGTAACTCCATGCAACAAGGACAAATAAGTCATGAAAATTGGGGTGAATTTTCTCTTAATTTACCACCCATGCAACAAGGAGTACAAAATGATGATTT 858 ATCACCACCATTAAATATTGGTGAAGGTAACTCCATGCAACAAGGACAAATAAGTCATGAAAATTGGGGTGAATTTTCTCTTAATTTACAACCCATGCAACAAGGAGTACAAAATGATGATTT
990
1000
1010
Antl-NcoDS
976 ТТС ТС ГС Т GAC ТТАТ GGA АТ С TAC ТТ G:
981 TTCTGCTGAAATTGACTTATGGAATCTACTTGAT ГАА 881 TTCTGCTGAAATTGACTTATGGAATCTACTTGAT ГАА 985 TTCTGCTGAAATTGACTTATGGAATCTACTTGATГАА 981 TTCTGCTGAAATTGACTTATGGAATCTACTTGAT ГАА
Рис. 3. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена Anti
S. lycopeisicum ANTI EF433416.1 Дачный Буршгын
SANT-домен Myb_DNA-bmding
1| ,1.....,10........ 20....... 30........ 40....... 50....... 60 70....... 80........ 90.......,100....... 110
Т MWSUSMSSLGVRKGSTJUDEEDFLLRKCIDKYGEGKraLVPIRAGLNRCRKSCRLRWLNYLRPHIKRGDFEQDEVDLILRLHKLLGNRTTSLIAGRLPGRUANDVKWYliJNUNLL 1 HNSTSHSSLGVRKGSTJTDEEDFLLRKCIDKYGEGKWHLVPIRAGLNRCRKSCRLRWLNYLRPHIKRGDFEQDEVDLILRLHKLLGNRTJSLIAGRLPGRTANDVKNYWNTNLL 1 MWSTSHSSLGVRKGSTTTDEEDFLLRKCIDKYGEGKTilHLVPIRAGLNRCRKSCRLRWLNYLRPHIKRGDFEQDEVDLILRLHKLLGNRTTSLIAGRLPGRTANDVKimmTNLL
S. lycopeisicum ANTI EF433416.1 Дачный Буршгын
113
ТТз
113
113
PLNQ3212
....... ,120...... 130....... 140...... 150....... 160....... 170....... 180....... 190....... 200....... 210...... 220
RKLNUUKIVPREKimJECGEISUKIEIIEPGRRKYFSSTJHH'JVm'Jr-irr'/ILDEEEHCKEIISEKQUPDASHDEP/DPTmiNLLENCNDDIEEDEEWINYEKlTLUSLLHEEISP RKLWTTKIVP REKINWKC GEIS TKIEIIEP QRRKYF SSTHEMVTfJMNVILD E ЕЕНС ЕЕ 11S EKQTPD AS HDNVD PT,JT.T IMLL ENCND DIEE D EEW ШУЕ KTL TS LLHE E IS P ^ELNTTEIVP RE ETNNEC GEIS ТЕIE11KP QPREYF SSТНКЫI TNN IVIL I1 E E E НС ЕЕ IKS E EQTP D AS HDNVD QUI'I INL L ENCND DIEE D E E W Ш YE ETL TS L L HE E ES P
S. lycopersicum ANTI EF433416.1 Дачный Буршшн
226
226
226
226
230_______240_______250________260_______270
LNIGEGNSMQQGQISHENWGEFSLNLPPMQQGVQNDDFSAEIDLWJLLD
LNIGEGNSMQQGQISHENWGEFSLNLPPMQQGVQNDDFSAEIDLWNLLD
LNIGEGNSMQQGQISHENWGEFSLNLQPHQQGVQNDDFSAEIDLWJLLD
Рис. 4. Аминокислотные последовательности ANT1 ТФ и их регуляторные элементы, синтезируемые на основе
аллелей Anti и anti
известных ДНК-связывающих доменов.
Учитывая, что области известных доменов, особенно ДНК-связывающего домена, у данных двух аллелей одинаковы, можно предположить, что существует еще неизученная
область связывания с ДНК или данный ген не участвует в регуляции экспрессии структурных генов биосинтеза антоцианов.
Несмотря на различный характер накопления антоцианов в плодах сортов Дзивосны,
Индиго и Бурштын, полиморфизма по экзон-но-интронной части гена Anti у них не обнаружено, что говорит об отсутствии связи данного гена с характером распределения антоциана по поверхности плода.
Ранее для типирования аллелей гена Anti нами был апробирован CAPS маркер Ant1-NcoI (F: GGAAGGACAGCTAACGATGTG, R: GTT GCAT GGGT GGTAAATTAAG) к сайту рестрикции в третьем экзоне аллеля anti., возникшему в результате SNP (А/C) в положении +756 (рис. 1). приводящей к аминокислотной замене (Q-P) (рис. 2. номер аминокислоты 187) [2].
На основе выявленных полиморфизмов при ресеквенировании гена Anti для исключения этапа рестрикции при идентификации аллелей anti и Anti была выделена маркируемая область. включающая инсерцию в первом ин-троне размером 4 п. н. Подобрана следующая пара праймеров с флюоресцентной меткой [9]: An1.1 (FAM)F: TTCATTGGGAGTGAG AAAAGGTT;
An1.1R: AACTTGCATGCCTGTTGCCTA.
В результате апробации праймеров были получены фрагменты 340 п. н. у аллеля Anti и 344 п. н. — у аллеля anti.
Для проверки эффективности работы нового маркера выполнен анализ расщепляющихся популяций F2 с различным составом аллелей генов Anthocyanini (Anti): Индиго (Anti) х Дачный (anti) и Индиго
(Anti) х № 17-2020 (anti) с использованием двух маркеров. Частичные результаты представлены в таблице 2. Согласно полученным данным. результаты типирования аллелей полностью совпадают. что говорит об эффективности использования нового маркера.
Таким образом. ресиквенс гена Anti подтвердил наличие двух аллелей у изучаемых форм томата. а также позволил разработать новый молекулярный маркер для их разделения на основе делеции в интронной области в последовательности аллеля Anti. Новый маркер позволяет эффективно разделить аллели Anti и anti гена Anti в случае отсутствия рестрик-тазы. однако требует анализа фрагментов ПЦР в полиакриламидном геле.
Для ресеквенирования генаAn2 S. lycopersicum были взяты формы с различным характером накопления антоцианов в вегетативных и генеративных частях растений: в качестве сортов без накопления антоцианов в плодах и вегетативных органах использованы образцы ИСИ 63. Золотце. а также указанные выше образцы (рис. 1. 2). Поскольку из литературных источников известно. что ген Anti интрогрессиро-ван из S. chilense. для ресеквенирования гена An2 были взяты дикие родственные формы. С помощью разработанных праймеров (табл. 1) была проведена амплификация. выполнено секвенирование и выравнивание полученных фрагментов (рис. 5А и 5Б).
Таблица 2
Результаты ДНК-типирования аллелей гена Anti с использованием CAPS Ant1-NcoI. SCAR
An1.1 (FAM) маркеров
Номер образца по номенклатуре 2022 г. CAPS маркер Antl-NcoI SCAR маркер Anl.l (FAM)
Размеры маркируемых продуктов, п. н.
100-6 478 340
100-9 478 340
100-15 478. 271. 207 340. 344
100-17 271. 207 344
100-21 478 340
100-40 271. 207 344
100-42 271. 207 344
100-51 478 340
100-61 478. 271. 207 340. 344
100-71 478. 271. 207 340. 344
Лв 2-1.1 F*
S. iycopersicum TF MYB75 NC_Q15447.3 ИСИбЗ Blue leaf Золотце Дзнвасны
Бурштын S .glandulosum
Anl-IF
20
30
50
60
70
SO
100
110
131
iT АС Г С СI AT GT 3 ТЭС АТ С ST Т GGGAGTTAGKAAAGGT Т CATGGAC Т GAAi ТАСТССТATGT GTGCAT CGTT GGGAGTTAGEAAAGGTT CATGGACTGAAC iTACT ССТATGTGT GCATCGTTGGGAGTTAG§!aAA>T CATGGACTGAAC iTACTCCTAT GTGT GCAT CGTT GGGAGTTAGEAAAGGTT CATGGACT GAAC TACTCCTAT GTGT GCATCGTT GGGAGTTAGBAAAGGTT CATGGACTGAAC iTACTCCTAT GTGT GCAT C GTTGGGAGTTAGGAAAGGTT CATGGACT GAAC lT ACT CCT AT GT G T SC AT CGTT GGGA 3ITAGAAAAGGTT CATGGAC T GAAC
: AASAAGAT ТСГ С TTT TJ :AAGAAGATTBT( ;AASAAGATTGT •AA3AAGATTCT
.TTGCATT CAAAAATAT GGT GAAGGAAAGT GGCAT CTT GTT С CT GCTAGAG CTlTTAAGAlATT GCATT CAAAAATAT GGT GAAGGAAAGT GGCATCTTGTTCCT GCTAGAG TITTAAGaIaTT GCATT CAAAAATAT GGT GAAGGAAAGT GGCAT CTT GTT CCT GCTAGAG TBTTAAGaJaTT GCATT CAAAAATAT GGT GAAGGAAAGT GGCAT CTT GTT CCT GCTAGAG : AAGAAGAT TCTCTTTTAAGAAATT GCATT CAAAAATAT GGT GAAGGAAAGT GGC AT CTT GTT С CT GCTAGAG ;AAGAAGATT§T TTTT TAAGAAATT GCATT CAAAAATAT GGT GAAGGAAAGT GGCAT CTT GTT С CT GCTAGAG lAAGAAGATTTTCTATTAAGAAATrGCATTCAAAAATATGGTGAAGGAAAGIGGCATCrrGTTCCTGCTAGAG
140
150
160
170
180
190
200
I
220
230
240
.TABTTTT
260
S. Iycopersicum TF MYB75 NC_015447.3 ИСИбЗ Blue leaf Золотце ДЗИБОСЕЫ Бурштын S.glandulosum
S. Iycopersicum TF MYB75 NC_015447.3 ИСИ63 Blue leaf Золотце Дзнвосны Бурштын S.glandulosum
128
132
132
132
132
132
132
263 L 259
CTGGTATTACTTTTGTACTTTTTCTAATTTGTTTTAAAAAATAAT
CTGGTATTACTTTTGTACTTTTTCTAATTTGTTTTAAAAAATAAT
CTGGTATTACTTTTGTACTTTTTCTAATTTGTTTTAAAAAATAAI
CTGGTATTACTTTTGTACTTTTTCTAATTTGTTTTAAAAAATAAT
ATTTTATATATTTATAAATGATTTACTAAATTCTAAGTTTTGATTTTACTTl
ATTTTATATATTTATAAATGATTTACTAAATTCTAAGTTTTGATTTTACTT
ATTTTATATATTTATAAATGATTTACTAAATTCTAAGTTTTGATTTTACTT!
ATTTTATATATTTATAAATGATTTACTAAATTCTAAGTTTTGATTTTACTT
CTGGTATTACTTTTGTACTTTTTCTAATTTGTTTTAAAAAATAATATATTTTATATATTTATAAATGATTTACTAAATTCTAAGTTTTGATTTTACTT
CTGGTATTACTTTTGTACTTTTTCTAATTTGTTTTAAAAAATAATATATTTTATATATTTATAAATGATTTACTAAATTCTAAGTTTTGATTTTACTT
CTGpTATTACTTTTGTACTTTTTCTAATTTGTTTTAAAAAATAATATATTTTATATATTTATAAATGATTTACTAAATTCTAAGTTTTGATTTTACTT
JctaataacataatttataBttttatgatttgt
T С ТААТ AACAT AAT TT AT AGTTTT AT GATTT GT :lcTAATAACATAATTTATABTTTTATGATTT GT TTT AAT AACAT AAT TT AT AGTTTT AT GATTT GT - CTAATAACATAATTTATAATTTTAT GATTT GT ■CTAATAACATAATTTATAATTTTAT GATTT GT ■CTAATAACATAATTTATAGTTTTAT GATTTGT
.270
2S0
300
.310
.320
.330
,340
.350
. ,360
.370
,380
.390
394
ТЩТАААТ C AT AAAT T TTTGT AAT ATT T T AT-ATTTATTTATTAATTTTGAATGTTATGTGAACATGTATAGGTTTAAATCGATGTCGAAAGAGTTGCAGACTAAGGTGGCTAAACTATCTAAGGCC
ТщТАААТСАТАААТТТТТяТААТАТТТТАТ-----------ATTT ATTTATT AATTTT GAAT GTT AT GTGAACAT GTATAGGTTTAAAT CGATGT CGAAAGAGTTGC AGACTAAGGT GGCT AAACTAT CT AAGGC C
TTTAAAT C ATAAAT T TTTGT AATATT T T AT---ATTTATTTATTAATTTT GAAT GTTAT GTGAACAT GTATAGGTTTAAAT C GATGT CGAAAGAGTTGCAGACTAAGGT GGCTAAACTAT CTAAGGC C
TTrAAATCATAAATTTrrGTAATATTTTAT-----------ATTT ATTTATTAATTTTGAATGTTAT GTGAACATGTATAGGTTTAAATCGATGTCGAAAGAGTTGCAGACTAAGGTGGCTAAACTATCTAAGGCC
TTTAAAT CATAAATTTTTATAATATTTTАТЙАТТТATTTATTTATTAATTTTGAATGTTATGTGAACAT GTATAGGTTTAAAT C GATGTCGAAAGAGTTGCAGACTAAGGT GGCTAAACTATCTAAGGCC TTT AAAT CATAMTTTTTAT ДАТATTTT ATgljjAT T T ATTT ATTTATTAATTTTGAATGTTATGTGAACA.TGTATAGGTTTAAAT CGATGT CGAAAGAGTTGCAGACTAAGGTGGCTAAACTAT CT AAGGC C TCT AAAT CATAAATTTTTGT ААГАТТТТ ATTT-----ATTTATTTATTAATTTTGAATSTTATGTGAACATGTATAGGTTTAAATCSATGTCGAAAGAGTTSCAGACTAAGGTGGCTAAACTATCTAASSCC
АП2-4Г ' Btodoh эюон-----------■■ ~
-I p .Vnl-.VFT(F.VM) R |----------------1—
147Q леп лоп1 con --
400
410
420
Aal-l.AFT-r
430
An3-3J
440
450
460
480
490
500 ,510 520
АТТАГГХСАТТСААААгТГГТТС-АГЭТТА
S. Iycopersicum TF MYE75 NCJ515447.3 ИСИбЗ Blue leaf Золотце
Бурштын
S.glandulosum
384 а.:агат-:аа:-а:-а:.-:.-т:-а:тттэсг:-:а:;-ат:-аа::-т:-:-ат-:т-:аг:тт..-а:-а:тт.:асааастсгга:-:.-:аага:-:.
388 ACATATCAAGAGAGGTGACTTTGCTCCAGATGAAGTGGATCTCATCTTGAGACTTCAEAAACTCTTAGGCAATAG(
388 ACAIATCAAGAGAGGT GACTTT GCTC CAGAT GAAGT GGAT CT CAT CTT GAGACTT CAEAAACT CTTAGGCAATAGC
388 ACATAT CAAGAGAGGT GACT T T GCT CCAGAT GAAGT GGAT CT CAT С T T GA GA С T T C ACA.'T 77AGGCAA7AG!
393 ACATATCAAGAGAGGTGACTTTGCTCCAGATGAAGTGGATCTCATCTTGAGACTTCATAAACTCTTAGGCAATAGGCAAGTCTAT1IATTTACTA—TT GCGATТ ATTT CAT 7:AAAAGCTTT CGAIGTTA 393 ACATATCAAGAGAGGTGACTTTGCTCCAGATGAAGTGGATCTCATCTTGAGACTTCATAAACTCTTAGGCAATAGGCAAGTCTATGCATTTACTA—TT 3 I:GATTATTTCATTCAAAAGCTTTCGATGTTA
389 ACATATCAAGASAGGTGACTTTGCTCCAGATGAAGTGGATCTCATCTTGAGACTTCA®AAACTCTTAGGCAATAGGCAAGTCTAT3::GTCTACTATATT :‘- lAATT ATTT I ATT TAAAAGTTTTTGATSTTA
kGTCTATGC------------TO
.GTCTATSC------------T GC§ATT ATTT C AT TT AAAAC-T 7 7 T T GAT GTT A
iGTCTATGC------------T SC AAT T ATTT CAT Г CAAAAG5BTT 7TGAT GTT A
.STCTATGC------------T GCgATT ATTT CAT T T AAAAC-T TTTT & AT GTT A
Второй 5i
525
530
540
550
560
570
580
590
600
610
620
630
640
650
S. Iycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 ИСИ63 Blue leaf Золотце
Бурштын
S.glandulosum
504 TATTTTTTTTTATATTGrATTGGTTAAATArATAAGTAGATTTTTAAATTTGTIGGATTTTTTTTTTIAGATATTTCAATTACGTTArTTTTСГТТАТААГСАТАЗААТТССТАТААТТТТТТССАТГГАА
508 TATTrTTTTTTATATTGTATTGGTCAAATATATAAGTAGATTTTTAAATTTGTTGGATTTTTTTCCTCAGATATTTCAATTACGTCATTTTTCTGTATAATCATA3AACTCCCATAATTTGTTCCATTTAA
508 tatttttttttatattGtattggtcaaatatataagtagatttttaaatttgttggatttttttcctcagatatttcaattacgtcatttttctgtataatiatagaactcccataatttgttccatttaa
508 T А ГТГ T T TTT TATATTGTATT GGT CAAAT A T A T AAGT AGAT T T TT AAAT TTGTT GGATTTTT T T CCT CAGATATT T CAATT ACGT CATT T T TCTGT AT AA TIATAGAACTCCCATAATTTGTTCCATTTAA
522 ТАТТТТТ CCT AAT ATTATATT--AT AT AT A---TT---------------------------------------------------------ATCATA---------------------------
522 TATTTTT CCT AAT ATTATATT--AT AT AT A---TT---------------------------------------------------------ATCAT A- -■Ш
520 T ATT TT TTTTTAT AT TG T AT T GGT CAAAT A T А Г AAGC AGAT T T CTAAATTTGTTGG- -TTTTTT CCT CAGATATTTCAA CTACGTCATTTTTCT GT AT AA T IAT A!
_______Anl-IF______
656 660 670 680 690 700 710 ,720 730 740 750 760 770 780
S. Iycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 ИСИбЗ Blue leaf Золотце Дзиеосны Бурштын S .glandulosum 635 639 639 639 .-. AA A A. .. A .-.. A . AA.-.. . A1A . 1 . . AA 1 1 . A1A . 1 _ ..... . A . AA. . . .. ......... . ............. ...... .... ....... . . ACAATCATCGTTGTCTGATGTGGATCAAGATTTGTGAGGGTATT L-7TXCAC AAATCATAGTCCAATTGATASTGAAAATGTTTGAGAATAATTST 3TTTTACTGAAGTCATTTT&AACACATTAGAAAACA ACAATCATCGTTGTCTGATGTGGATCAAGATTTGTGAGGGTATT T T TCACAAATCATAGT C CAATT GATAGT GAAAATGTTT GAGAATAATT GT GTTTTACTGAAGT CATTTT GAACACATTAGAAAACA ACAATCATCGTTGTCT GATGTGGATCAAGATTTGTGAGGGTATTGT T ГCACAAATCATAGTCCAATTGATAGTGAAAATGTTTGAGAATAATTGTGTTTTACTGAAGTCATTTT GAACACATTAGAAAACA
557 649 787 TGTTT ACAATCATCGTTGTCT GATGT GGATAAAGATTT GT GAGGGTATT С- T T T CACAAAT CAT AGT CCAATTGATAGTGAAAATGTTTGAGAATAATTGTGTTTTACTGAAGTCATTTTGAATACATTAGAAAACA An2-1R 790 .800 slo .820 .830 340 .850 860 .870 880 .890 900 .910
S. Iycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 ИСИбЗ Blue leaf Золотце Бурштын S .glandulosum 766 770 770 770 565 563 780 AATGAGACTAGCACGGTTTGTCTTCATTCCTTCTATCAAAATTATTACAACTCAAACACAATCGAAGACATTTACAATAGAAAAGCTGATCAAAAGTGTTTTAAAAAAACAAATTATGGGTGGTTCAATGA AATGAGACTAGCACGGTTTGTCTTCATTCCTTCTATCAAAATTATTACAACTCAAACACAATCGAAGACATTTACAATAGAAAAGCTGATCAAAAGTGTTTTAAAAAAACAAATTATGGGTGGTTCAATGA AATGAGACTAGCACGGTTTGTCTTCATTCCTTCTATCAAAATTATTACAACTCAAACACAATCGAAGACATTTACAATAGAAAAGCTGATCAAAAGTGTTTTAAAAAAACAAATTATGGGTGGTTCAATGA AATGAGACTAGCACGGTTTGTCTTCATTCCTTCTATCAAAATTATTACAACTCAAACACAATCGAAGACATTTACAATAGAAAAGCTGATCAAAAGTGTTTTAAAAAAACAAATTATGGGTGGTTCAATGA
AATSAGACTAACACGGTTTGTCTTCATTCCTTCAATCAAAATTATTACAATTCGAACACAATTGAAGACATTTACAATAGAAAAGCTGATCAAAAGTGTTTTAGAAAAACAAATTATGGGTGGTTCAATGA
Anl-I.IR
918
S iycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 ИСИбЗ Blue leaf Золотце Дзиеосны Бурштын S.glandulosum 897 901 901 TTCAATTGAAAAAT - 7AAAT -T.TTT.TT-T T-TAT.TTATTT TATTTA TT C AATTGAAAAAT GACGT AATTGAGGTACCT GAGAAAAAAAAAC CTAAAC AAT АГ GT GTAATT ATTTCATTTA TT C AATTGAAAAAT GAC GT AATT GAGGTAC CT GAGAAAAAAAAACCTAAAC AAT AT GTGT AAT TATTTCATTTA
565 5tfc 911
AAT AT GTGT AAT TATTTCATTTA ttcaattgaaaaatgacgtagttgac-ctatctgaggaaaaaaatctaacSagtttaaggatttgtttatgtatttggcctattgtattatatgtattatcatatgtttaatatc-tgtaattatttcattta
Рис. 5А. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена An2
В результате ресеквенирования гена An2 установлено полное соответствие структуры аллелей гена известным последовательностям: Myb75 у образцов ИСИ 63, Золотце, Blue leaf и An2-Aft — у форм Дзивосны, Бурштын. Полученные результаты показывают отсутствие связи между характером распределения антоцианов у форм Дзивосны и Бурштын и аллельным составом гена An2. Основными отличиями аллеля An2-Aft от Myb-75 являются 14 SNP в экзонных областях. Из них 1 SNP замена расположена в первом экзоне, 1 SNP — во втором экзоне, 6 SNP — в третьем экзоне до стоп-кодона и 6 SNP — после стоп-кодона. Кроме полиморфизмов в экзон-
ной области, у изучаемых двух аллелей выявлены существенные различия в интронных областях: две вставки, содержащие TTA-боксы в первом и втором интронах общим размером 14 п. н., три делеции общим размером более 410 п. н. во втором интроне аллеля An2-Aft (рис. 5А и 5Б).
В результате ресеквенирования гена An2 у родственной дикой формы S. glandulosum был выявлен аллель гена An2, ранее незарегистрированный в базе данных NCBI. Основными отличиями аллеля, названного нами An2-Ins57, от Myb75 у данного дикого вида являются: 13 SNP в экзонных областях. Из них 4 SNP расположены в первом экзоне,
Aul-IAFT-R I 1
1 |ahZ-4R
1049
S lycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 970 -тт,- - —' -7 - :-т:- ------ -- - гг: ass? - . - - - i- .- - -7.7.777: ' : -
ИСИ63 974 AAAGTTA-GITATTTrsrATAGGTGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCcllGGAAGGACAGCAAACGATGTGAAGAACTATTGGAASACACACTTTCACAAGAAGTTAAGTATTATTGCTCCTCATCTACAl
974 AAAGTTA-GTTATTTTGrATAGGTGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCfflGGAAGGACAGCAAACGATGTGAAGAACTATTGGAieACACACTTTCACAAGAAGrTAAGTATTATTGCTCCTCATCTACAl
Золотце 974 AAAGTTA-GTTATTTTSTATAGGTGGTCACTTATTGCTGSTAGACTTCCyGGAASSACAGCAAACGATSTGAAGAACTATTGGAAfACACACTTTCACAAGAAGTTAAGTATTATTGCTCCTCATCTACAT
Дзнвосны 586 aaagttaIgttattttstataggtggtcacttattgctgstagacttccgggaaggacagcaaacgatgtgaagaactattgsaacacacactttcacaagaagttaagtattattgctcctcatctacat
Бурштын 586 aaagttaIgttattttgtataggtggtcacttattgctggtagacttccgggaaggacagcaaacgatgtgaagaactattggaacacacactttcacaagaagttaagtattattgctcctcatctacai
S. glandulosum 1042 AAAGTTATSriATTTTSXATAGSTSSTCACTTAITGCTSSTAGACrTTCAGSAAGSACASCAAACGATGTGAAGAACTATTSSAACACACACrTTCACAAGAAGTTAAGTArrATTSCC : 7 777.7 :77.17.7
Тоетнё ЭК1СШ
1180 1180 .1190 1200 .1210 .1220 1230 .1240 .1250 1260 .1270 1280 1290 .1300 1
S. lycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 ИСИ63 Blue leaf Золотце Дзнвосны Бурштын S. glandulosum 1100 1104 1104 1104 717 717 1173 С CT С A7T С Т С G7 7ITCSTT 7 7 CAT С С 7 CGTCTACAGATTAAGCATAAGAGCAT CGCGG7TACTAAGAATGAAATAATAAGA С СТ СААС С Т С GGAACT Т С Т САААС GTTAAGAAGAATGATT С Г CATTGG7G CCTCArLECTCGTCCTCGTTCTCATCCTCGTCTACAGATTAAGCATAAGAGCATCGCGGTTACTAAGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAACTTCTCAAACGTTAAGAAGAATGATTCTCATTGGTG CCTCArpjcTCGTCCTCGTTCTCATCCTCGTCTACAGATTAAGCATAAGAGCATCGCGGTTACTAAGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAACTTCTCAAACGTTAAGAAGAATGATTCTCATTGGTG CCTCATEtCTCGTCCTCGTTCTCATCCTCGTCTACAGATTAAGCATAAGAGCATCGCGGTTACTAAGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAACTTCTCAAACGTTAAGAAGAATGATTCTCATTGGTG CCTCATCCTCGTCCTCGTTCTCATCCTCGTCTACAGATTAAGCATAAGAGCATCGCGGTTACTAAGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAACTTCTCAAACGTTAAGAAGAATGATTCTCATT>G cctcatcctcgtcctcgttctcatcctcgtctacagattaagcataagagcatcgcggTtactaagaatgaaataataagacctcaacctcggaacttctcaaacgttaagaagaatgattctcattggtg CCTCAr^CTCGTCCTCGTTCTCATCCTCGTСТАСАGATTAAGCATAAGAGCATCGCGGTTACTAAGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAACTTCTCAAACGTTAAGAAGAATGATTCTCATTGGTG
Третий экюж
1311 310 ,1320 1330 1340 ,1350 1360 1370 ,1380 1390 ,1400 ,1410 1420 ,1430 ,14
S. lycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 ИСИ63 Blue leaf Золотце Дзнвосны Бурштын S.glandulosum 1231 1235 1235 1235 848 848 1304 CAACAACAAAAGrArGATCACAAACACArpjAGACAAAGATGACAAAdBrTGCAACGAAArCGfTSTAAfeTArTTGTGAGAAGCCAATA^GAGAAAATACATCGTCGArAGACGArSSAGTTGAArGGTGSA CAACAACAAAAGTATGAT CACAAAC ACATfflAGACAAAGAT GACAAAcStT GCAACGAAAT CGJBT GTAAAT ATTTGT GASAAGCCAATaBgAGAAAATACATCST CGATAGACGATGGAGTT GAATGGT GGA caacaacaaaagtatgatcacaaacacatsagacaaagatgacaaacSttgcaacgaaatcgstgtaaatatttgtgagaagccaataMgagaaaatacatcgtcgatagacgatggagttgaatggtgga CAACAACAAAAGTATGAT CACAAACACATfAGACAAAGATGACAAACHTT GCAACGAAAT C GST GTAAATATTTGT GAGAAGCCAATAEGAGAAAATACATCGTCGATAGACGATGGAGTT GAATGGTGGA CAACAACAAAAGTATGAT CACAAACACAT CAGACAAAGATGACAAACl&T Г GCAACGAAAT С &ТГ GTAAATATTTGT GAGAAGC CAATABGAGAAAATАСАТС GT CGATAGACGATGGAGTT GAATGGTGGA caacaacaaaagtatgatcacaaacacatcagacaaagatgacaaacCttgcaacgaaatcgttgtaaatatttgtgagaagccaata|gagaaaatacatcgtcgatagacgatggagttgaatggtgga CAACAACAAAAGTATGATCACAAACACAT^AGACAAAGATGACAAACATTGCAACGAAATCGCTGTAAGTATTTGTGAGAAGCCAATAAGA&AAAATACATCGT CGATAGACGAT GGAGTT GAAT GGTGGA
| AnI-3.1F I P I AnZ-ZAFT-R 1
1442
S. lycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 ИСИ63 Blue leaf Золотце Дзнвосны Буржтьш S.glandulosum 1362 1366 1366 1366 979 979 1435 CAAATTTACTGGAAAATTGCATTGAAATTGAAGAAGAAACAGCTAATACAAATTTTGGAAAAACACCAACAATGTTGTTACATGAGGAAATATCACCACCGTTAWrTAATGjSTGAAGACAACTCCATGCAA caaatttactggaaaattgcattgaaattgaagaagaaacagctaatacaaattttggaaaaacaccaacaatgttgttacatgaggaaatatcaccaccgttaIttaatggtgaagacaactccatgcaa CAAATTTACTGGAAAATTGCATTGAAATTGAAGAAGAAACAGCTAATACAAATTTTGGAAAAACACCAACAATGTTGTTACATGAGGAAATATCACCACCGTTAeTTAArGGrGAAGACAACTCCATGCAA CAAATTTACTGGAAAATT GCATT GAAATTGAAGAAGAAACAGCTAATACAAATTTTGGAAAAACACCAACAATGTTGTTACATGAGGAAATATCACCACCGTTAjTTAAT G||T GAAGACAACTCCATGCAA CAAATTTACTGGAAAATTGCATTGAAATTGAAGAAGAAACAGCTAATACAAATTTTGGAAAAACACCAACAATGTTGTTACATGAGGAAATATCACCACCGTTAATTAATGATGAAGACAACTCCATGCAA CAAATTTACTGGAAAATTGCATTGAAATTGAAGAAGAAACAGCTAATACAAATTTTGGAAAAACACCAACAATGTTGTTACATGAGGAAATATCACCACCGTTAATTAATGATGAAGACAACTCCATGCAA CAAATTTACTGGAAAATTGCATTGAAATTGAAGAAGAAACAGCTAATACAAATTTTGGAAAAACACCAACAATGTTGTTACATGAGGAAATATCACCACCGTTAATTAATGGTGAAGACAACTCCATGCAA
AnZ-IR Третий зкзон AnZ-3.1R
1573 0 1580 ,1590 1600 ,1610 ,1620 1630 1 ,1640 ,1650 1660 ,1670 1680 1690
S. lycopersicum TF MYB75 NC 015447.3 ИСИ63 Blue leaf Золотце Дзнвосны Бурштын S.glandulosum 1493 1497 1497 1497 1110 1110 1566 CAAGGACCAACTAATAATTGGGATGACTTTTCAACTGATATTGACTTATGGAATCTACTTAAT CAAGGACCAACTAATAATT GGGAT GACTTTT СAACT GATATT GACTTAT GGAATCTACTTAAT CAAGGACC AACTAATAATT GGGAT GACTTTT CAACT GATATT GACTTAT GGAAT CTACTTAAT CAAGGAC CAACTAATAATTGGGAT GACTTTT CAACT GATATT GACTTAT GGAAT CTACTTAAT C AAGGAC CAACTAATAATTGGGAT GACTTTT CAACT GATATT GACTTAT GGAAT CTACTTAAT CAAGGAC CAACTAATAATTGGGAT GACTTTT CAACT GAT ATT GACTT AT GGAAT CTACTT AAT CAAGGACCAACTAATAATT GGGATGACTTTTCAACT GATATT GACTTAT GGAAT CTACTTAAT ГАА ГАА ГАА ГАА ГАА ГАА ГАА &.G aattttIat t|tt GT C-Ac gttt|atatttatattagagt c CAAC t GAATTT AAA H.GAATT T ГМАТ t| 7 T ST C GfiC GT T T1ЙАТ ATT T AT ATT AGAG Т C CAAC T GAATT T AAATTT i 1-AAT Г Г iIaT Т|ГТ ST 7 SAC GTTTiATATTTATAT TAGAGT С CAAC T GAATTTAAATTT PiGAATTTTfAT т|гт GT C GAC GTTT jgATATTT AT ATT AGAG Г С CAAC T GAATTT AAATTT iiGAATTTTCATTCTTGT C GGCiTTTAATATTTATATTAGAGT С C GACT GAATTTAAA PiGAATTTTCATTCTTGTCGGCmTTTAATATTTATATTAGAGTCCGACTGAATTTAAA PS.GAAT T T ГСАТТ CTTGT CG§cJrTljATArT ТАТАТ TAGAGT C CAACT GAATTT AAA
Тсетнн экюн
Рис. 5Б. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена An2
6 SNP — в третьем экзоне до стоп-кодона и 3 SNP — после стоп-кодона. Кроме полиморфизмов в экзонной области, у изучаемых двух аллелей выявлены различия в интронных областях: делеция размером 1 п. н. и вставка 2 п. н. в первом интроне, делеция 2 п. н. и три вставки общим размером 69 п. н. в интроне 2 у аллеля An2-Ins57 S. glandulosum (рис. 5А и 5Б).
На рисунке 6 представлены белковые последовательности, формируемые на базе трех аллелей An2, с указанием аннотированных регуляторных элементов ТФ. Анализ последовательностей выявил одну общую аминокислотную замену в области SANT-домена (D-N, аспарагиновая кислота — аспарагин),
SANT-домен
формируемую на базе аллелей An2-Aft и An2-Ins57, отличную от последовательности, формируемой аллелем Myb75. В целом аминокислотные последовательности аллелей An2-Aft и An2-Ins57 отличаются от последовательности аллеля Myb-75 шестью различными заменами.
На основе выявленных полиморфизмов аллелей An2-Aft, Myb75 и An2-Ins57 были подобраны праймеры, представленные в таблице 3, а также разработаны два протокола ДНК-ти-пирования аллелей [9].
SCAR An2-AFT(ОМ) маркер с флюоресцентной оптической меткой охватывает область SNP замены в первом экзоне, изменяющей
S. lycopersicum MYB TF An2-AftFJ70532Q.l S. lycopersicum TF MYB75 NM_001279063.2 S. glandulosum
Г
"I Г
Myb_D NA-bin d in g
“I
lip
hhtpm:aslз-vb::gswtegedsllrhc:gxygeskwhlvparaglnrcrksc?lrhlnylrphixrgdfapei":l:lrihklignrwsl:a:e grtandvkhtwmihfhkxlгiiafhi::pf.erpr
MNTPMCASLGVRKGSWTEQEE^LLRDCIQKYGEGKWHLVPARAGLNRCRKSCRLRWLNYLRPHIKRGDFaPDEVDLILRLHKLLGNRWSLIAGRBPGRTANDVKNYWNTHFHKKLSIIAPHLKFHiRPR
MNTPMCASLGVRKGSWTEQEDFLLRficiCKTS-STa'il-ILVFARAGLNRCEKSCRLRWI^YLRPHIKRGDFAPDEVDI.ILRLHKLLGNRHSLIAGMPGRTANDVKNTfmiTHFJIKKLSIIAPaiJIPmiPR
I__________________________________________________________________________________________________________________________I
S. lycopersicum MYB TF An2-AftFJ705320.1 S. lycopersicum TF MYB73 MM 001279063.2 S. glandulosum
SHPRLGIKHXSIAYTXNEIIRPCERMFSMYXXMI.SHWCNNK.SMCrNTSDKTIXRCNEIWllI CEKPCQEirrSSITDGVSWWTNLLENCISrESErANTl-lFSKrFTMLLHEEISPPLINDEPNSMCCSPT SHPRLQIKHKSIAVTKNEIIRPQPRNFSNVKKNDSHWCraKSMITNTEDKDDKScNE7V'.TJi:EKPl6ENTSSIDDGVEWWTNLLENCIEIEEETANTNFGKTPTMLLHEEISPPlJblGEDNSMQOGPT SHPRLCIKHKSIAVTKlilEIIRPCPRIlFSir.^KKMDSHWCNNKSMITtilTlbKDDBaCNEIAVSICEKPIRENTSSIDDSVOrWTHLLENCISIEEETAMTllFSKTPTMLLHEEISPpAlGEDNSMGQSEI
S. lycopersicum MYB TF An2-AftFJ705320.1 S. lycopersicum TF MYB75 NM_001279063.2 5. glandulosum
NNWDDFSTDIDLWNLLN
NNWDDFSTDIDLWNLLN
NNWDDFSTDIDLWNLLN
Рис. 6. Аминокислотные последовательности AN2 ТФ и их регуляторные элементы, синтезируемые на основе
аллелей An2, An2-Aft и An2-Ins57
Таблица 3
Праймеры для выявления аллелей гена An2 Solanum lycopersicum
Ген, белок Полиморфизм Последовательность 5'-3' T отжига, °С
MYB75 (AN2), R2R3MYB ТФ Инсерции и делеция в первом и втором интроне общим размером 14 п. н. An2-AFT(FAM) F: ATTACAAGTGTCATTTTGTGGAAAG An2-AFT R: AAACTTTTGAATGAAATAATTGC 51
Инсерции размером 9 п. н. и три делеции общим размером более 410 п. н. во втором интроне An2-4F: ACTTCACAAACTCTTAGGCAATAG An2-4R: AGTCTACCAGCAATAAGTGACCAC 61
аминокислотный состав белка в области первого ДНК-связывающего домена, и инсер-ций в 1 и 2 интроне, содержащих TTA-боксы, размером 6 и 9 п. н. Размер продукта амплификации с подобранными праймерами составляет 647 п. н. дляMyb75 аллеля, 661 п. н. для An2-Aft аллеля и 659 н. п. для An2-Ins57 аллеля, что четко разделяется на генетическом анализаторе в полиакриламидном геле.
С целью упрощения методики выявления аллелей гена An2 разработан SCAR маркер An2-4, охватывающий области крупных делеций во втором интроне. После амплификации и последующей разгонки в агарозном геле у растений с аллелем Myb75 образуется фрагмент размером 580 п. н., с аллелем An2-Aft — 186 п. н., с аллелем An2-Ins57 — 647 п. н. (рис. 7).
Таким образом, ресиквенс гена An2 показал наличие трех аллелей у изучаемых форм томата, а также позволил разработать новые молекулярные маркеры для их разделения.
Изучение связи между особенностями накопления антоцианов в растениях и полиморфизмом гена Atroviolacea было начато с апробации известного в литературе SCAR маркера ATV-In(FAM) для выявления двух аллелей Atv и atv (табл. 4) [8]. При типировании широкой
Рис. 7. Электрофореграмма ДНК-типирования образцов томата с SCAR маркером An2-4: 1-3 — S. humboldtii; 4-6 — S. glandulosum; 7-9 — S. chilense, К — отрицательный контроль; M — маркер молекулярного веса
коллекции образцы Ty-42 и Ty-48 показали наличие фрагментов нетипичных размеров, что дало основание включить их в число форм для секвенирования, наряду с формами Blue leaf, Бурштын, Белесый ИСИ, Октябрята (рис. 2).
В результате ресеквенирования гена Atv (рис. 8А, 8Б) указанной коллекции образцов установлено полное соответствие структуры аллелей гена известным последовательностям Atv у образцов Бурштын, Белесый ИСИ и atv у образцов Blue leaf, Октябрята (рис. 8А, 8Б). Основными отличиями аллеля atv от Atv являются 6 SNP в экзонных областях (из них 1 SNP расположена в третьем экзоне, 2 SNP — в четвертом экзоне до стоп-кодона и 3 SNP — после стоп-кодона), а также вставка размером 4 п. н. во втором экзоне, приводящая к сдвигу рамки считывания ДНК, образованию раннего стоп-кодона и синтезу нефункционального белка. Выявлено, что аллель atv обеспечивает повышенное накопление антоцианов в вегетативных частях у образца Blue leaf (при отсутствии аллелей Ant1 и An2-Aft) и усиление накопления анто-цианов в плодах у образца Октябрята (при наличии в генотипе аллелей Ant1 и An2-Aft). Отсутствие индивидуальных полиморфизмов у форм Бурштын, Белесый ИСИ указывает, что особенности накопления и распределения пигментов у данных форм не связаны с геном Atv. Кроме полиморфизмов в экзон-ной области у изучаемых двух аллелей выявлены различия в интронных областях: одна однонуклеотидная делеция и 7 SNP в первом интроне, делеции размером 1 п. н. и 2 п. н., 13 SNP и три вставки общим размером более 390 п. н. в третьем интроне у аллеля atv.
У образцов Ty-42 и Ty-48 был выявлен ранее не обнаруженный в базе данных аллель, отли-
Таблица 4
Праймеры для выявления аллелей гена Atv Solanum lycopersicum
Ген, белок Полиморфизм Последовательность 5'-3' T отжига, °С
MYB-like transcription factor ATV Инсерция во втором экзоне размером 4 п. н. ATV-In(FAM)F: GAGGTTTCTTCGTTGGTAGTC ATV-In R: CTAAATAAAAGTTATTGAGTTCACG 53
три инсерции общим размером более 390 п. н. в третьем интроне Atv2F: GTTGGATAAGTAAGAATGTTGTAGA Atv2R: CTTCTGAAAGTACATAAACCACA 55
чиями которого от Atv являются 19 SNP в эк-зонных областях. Из них 4 SNP расположены в первом экзоне до старт-кодона, 1 SNP — во втором экзоне, 3 SNP — в четвертом экзоне до стоп-кодона и 11 SNP — после стоп-кодона. Также у аллеля, названного Atv-Ins9, присутствуют однонуклеотидная вставка и делеция в первом экзоне до старт-кодона и вставка размером 9 п. н. в четвертом экзоне за стоп-кодоном. Кроме полиморфизмов в экзонной области, у сравниваемых двух аллелей выявлены различия в интронных областях: две однонуклеотидные вставки, вставка 2 п. н. и 5 п. н. в первом интроне, две делеции по 1 п. н. и одна размером 2 п. н. в третьем интроне, а также вставка 2 п. н. в третьем интроне, у аллеля Atv-Ins9 (рис. 8А, 8Б).
На рисунке 9 представлены белковые последовательности, синтезируемые на базе трех аллелей Atv. Анализ последовательностей позволил выявить формирование на основе аллеля atv лишь 35 аминокислот с двумя заменами (G-R, R-T) и отсутствие ДНК-свя-зывающего домена ТФ, что влияет на экспрессию целевых генов (рис. 9). Учитывая, что аллель atv, интрогрессированный из дикой формы Solanum cheesmaniae, связан с активным накоплением антоцианов, то можно предположить, что наличие более высокого уровня антоцианов у ряда диких форм способствовало лучшему приспособлению к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды. Закреплению у S. lycopersicum аллеля Atv, блокирующего активный синтез антоцианов, способствовало культивирование человеком томата и оптимизация условий выращивания.
Для упрощения молекулярного разделения аллелей atv и Atv был подобран SCAR маркер Atv2 (табл. 4) к инсерциям в третьем интроне
общим размером 392 п. н., ПЦР с подобранными праймерами дает продукты размером 460 п. н. у аллеля Atv и 852 п. н. — у аллеля atv (рис. 10). В результате апробации нового маркера на широкой коллекции форм показана идентичность результатов типирования аллелей маркерами ATV-In(FAM) и Atv2.
Для изучения фенотипического проявления взаимодействия аллелей генов Ant1, An2 и Atv и подтверждения статистической достоверности эффективности разработанных маркеров проведено ДНК-типирование популяций F2-F3 гибридов общим количеством 606 индивидуальных растений. По результатам ти-пирования обширной коллекции изучаемого материала была подтверждена тесная связь аллеля An2-Aft с аллелем Ant1 в изучаемых образцах, которая обусловлена их сцеплением в связи с близким расположением на хромосоме 10. Расстояние между ними составляет 3 674 п. н. Частичные результаты ДНК-типи-рования аллелей представлены в таблице 5.
Для оценки характера накопления антоциа-нов на ранних стадиях развития из 370 индивидуальных растений популяций F3 отобраны генотипы с различным гомозиготным сочетанием аллелей регуляторных генов Myb-транскрипционных факторов Ant1, An2 и Atv: Ant1/ Ant1//An2-Aft/An2-Aft//atv/atv, ant1/ant1// Myb75/Myb75//atv/atv, Ant1/Ant1//An2-Aft/ An2-Aft//Atv/Atv, ant1/ant1//Myb75/Myb75//Atv/ Atv. В результате анализа окраски вегетативных органов (листовой пластинки и жилок листа, стеблей) было установлено постепенное снижение накопления антоцианов от образцов с генотипом Ant1/Ant1//An2-Aft/An2-Aft// atv/atv с максимальной пурпурной (антоциа-новой) окраской к формам с сочетанием аллелей Ant1/Ant1//An2-Aft/An2-Aft//Atv/Atv
Рис. 9. Аминокислотные последовательности ATV ТФ и их регуляторные элементы, формируемые на основе
аллелей Atv, atv и Atv-Ins9
Таблица 5
Результаты ДНК типирования популяций F3 № 17 2020 х Индиго на наличие аллелей генов
Anti, An2 и Atv
Название образца An2 Myb75 — 580; An2-Aft — 186; An2-Ins57 — 647 Anti Anti — 478; anti — 208 + 271 Atv Atv — 460; atv — 852
45-9/6 580 208, 271 460
45-6/9 580 208, 271 460
45-19/2 186 478 852
45-19/7 186 478 852
45-12/6 186 478 460
45-12/7 186 478 460
45-21/1 580 208, 271 852
45-21/2 580 208, 271 852
и anti/anti//Myb75/Myb75//atv/atv, затем к образцам с генотипом anti /anti //Myb75/Myb75// Atv/Atv, окраска которых оставалась зеленой (рис. 11).
При выращивании растений в теплице у взрослых растений томата максимальное накопление антоцианов в плодах было у изучаемых образцов при наличии в генотипе следующих аллелей генов: Anti, An2-Aft и atv (образцы Дзивосны, Октябрята — рис. 1). Усиление антоциановой окраски наблюдалось на вегетативных органах (у образцов с сочетанием аллелей anti/Myb75/atv) и плодах диких форм томата (с сочетанием аллелей Anti/An2-Ins57) при снижении температуры в конце вегетационного периода.
Анализируя особенности накопления анто-цианов в плодах, можно предположить, что отличный характер накопления антоцианов у образца Бурштын может быть связан с взаимодействием трех аллелей Anti /An2-Aft/Atv. Несмотря на одинаковые аллели Anti, An2-Aft, atv у образцов Дзивосны и Октябрята, характер распределения антоцианов у них различен,
что связано с участием в проявлении данного признака других генов. Ранее при изучении полиморфизма гена транскрипционного фактора GLK2 была установлена связь аллелей данного гена (U, u, U-del52) с распределением пигментов в плодах, в том числе антоцианов [11]. Наряду с геном GLK2, в регуляции накопления антоцианов участвуют гены DDB1, Deti, связанные с фенотипом «high pigment» [2]. Образец Октябрята содержит набор аллелей (Anti/An2-Aft/atv//Y/U/hp2dg) обеспечивающих максимальное накопление антоцианов в плодах и практически черную окраску при ярком солнечном освещении. У образца Дзивосны основные отличия в распределении и накоплении антоцианов от формы Октябрята обеспечиваются отсутствием аллеля hp2dg и наличием у аллеля гена SlMybi2, а также аллеля U-del52 гена GLK2.
Для оценки статистической достоверности эффективности разработанных молекулярных маркеров вышеуказанных аллелей выполнен анализ результатов фенотипической оценки и ДНК-типирования изучаемых популяций
Рис. 10. Электрофореграмма ДНК-типирования образцов томата с SCAR маркером Atv2: 1-15 — типируемые образцы популяции Т45; К — отрицательный контроль; M — маркер молекулярного веса
Рис. 11. Фенотип вегетативных органов растений с различным сочетанием аллелей генов Anti, An2 и Atv: А — 45-19/2 и 45-19/7 (Anti /Anti//An2-Aft/An2-Aft//atv/atv); Б — 45-12/6 и 45-12/7 (Anti/Anti//An2-Aft/An2-Aft//Atv/ Atv); В — 45-9/6 и 45-6/9 (anti/anti//Myb75/Myb75//atv/atv); Г — 45-21/1 и 45-21/2 (anti/anti//Myb75/Myb75//Atv/Atv)
методом Хи-квадрат. В таблице 6 представлены результаты анализа популяции F2 Индиго (Anti, An2-Aft) х Линия № 17-2020 (anti, Myb75). Общее число растений F2 составило 79. Фенотипическое проявление антоциано-вой окраски плодов полностью соответствовало ожидаемому после типирования. Учитывая
тесное сцепление аллелей генов Anti и An2, теоретически ожидаемое расщепление по генотипу: 1 Anti/An2-Aft : 2 Anti/anti//An2-Aft/ Myb75 : 1 Anti/Myb75; по фенотипу: 1 (сильная антоциановая окраска) : 2 (средняя антоци-ановая окраска) : 1 (отсутствие атноциановой окраски).
Таблица 6
Результаты анализа расщепления популяции F2 Индиго х Линия № 17-2020 методом х2
Показатели Расщепление Сумма
Ant1/An2-aft Ant1/ant1//An2/ Myb75 ant1/Myb75
Ожидаемое расщепление (Н0) 1 2 1 4
Наблюдаемые частоты (f) 21 39 19 79
Ожидаемые частоты (F) 19 41 19 79
Разность частот (f-F) 2 -2 0 -
Квадрат разности (f-F)2 4 4 0 -
Отношение (f-F)2/F 0,21 0,097 0 0,307 = х2
Фенотипическое проявление антоциановой окраски на плодах Большое накопление антоциана Среднее накопление антоциана в плодах Отсутствие антоциана в плодах
Примечание. Нулевая гипотеза (H0) — ожидаемое расщепление: 1 Anti/An2-Aft : 2 Anti/anti//An2-Aft/Myb75 : 1 Anti/Myb75. Число степеней свободы — (с-1) х (k-1) = (3-1) х (2-1) = 2; х2теор = 6,0; х2факг = 0,307 < х2теор (6,0), следовательно, гипотеза верна и расщепление соответствует 1 : 2 : 1
Проведенный анализ подтвердил статистическую достоверность выявленной связи с фенотипическим проявлением признака «накопление антоцианов в плодах».
Таким образом, на основе данных молекулярного маркирования и адаптированных методик ДНК-типирования аллелей качества плодов Anti, An2 и Atv проведен скрининг популяций F2-F3, который позволил расширить знания по взаимодействию генетических систем накопления пигментов в вегетативных органах и плодах томата.
Заключение
Выполнено ресеквенирование генов Anti, An2 и Atv Myb-транскрипционных факторов на коллекции образцов S. lycopersicum и близких диких видов томата с различным накоплением антоцианов в плодах. Подтверждены отличительные полиморфизмы между аллелями Anti и anti. На основе инсерции 4 п. н. разработан новый SCAR Antl.1 (FAM) маркер для выявления аллелей Anti и anti. Показана полная идентичность результатов ДНК-типирова-ния, полученных с помощью разработанного маркера и ранее используемого CAPS маркера Antl-AcoI [2].
В генотипе образцов изучаемой коллекции S. lycopersicum выявлены известные аллели Myb75 и An2-Aft гена An2. Впервые выявлены отличия в структуре гена An2 у S. glandulosum (An2-Ins57). Показаны изменения в первичной структуре белковой последовательности, кодируемой данным аллелем: шесть аминокислотных замен, две из которых расположены в области первого и второго ДНК-связываю-щих доменов, что может влиять на эффективность связывания с промотором и экспрессию целевых генов. Разработаны новые SCAR An2-AFT(OM) и SCAR An2-4F/R молекулярные маркеры для ДНК-типирования аллелей An2-Aft, An2-Ins57 и Myb75. SCAR An2-AFT(OM) охватывает область SNP замены в первом экзоне, изменяющей аминокислотный состав белка в области первого ДНК-связывающего домена, а также две ин-серции и делеция в первом и втором интро-нах общим размером 14 п. н., соответственно. Преимуществом данного маркера является непосредственная связь с полиморфизмом, изменяющим функции гена, но для разделения
продуктов амплификации требуется полиакриламидный гель. SCAR An2-4F/R охватывает область крупных делеций во втором интроне, характерных для аллеляMyb75. Типирование с помощью данного маркера позволяет четко разделить аллели гена An2, выявленные в изучаемой коллекции, с использованием обычной ПЦР и разгонкой продуктов в агарозном геле.
Апробирован известный в литературе ATV-In(oM) [8] и разработан новый Atv2 SCAR маркер, которые позволяют успешно типиро-вать известные аллели гена Atv. Разработка нового маркера позволяет разделить продукты ПЦР в агарозном геле, в отличие от маркера ATV-In (ОМ).
На основе данных молекулярного маркирования аллелей генов Anti, An2, atv в популяциях F2-F3 изучаемых гибридов и оценки фенотипического проявления признаков на различных этапах онтогенеза, связанных с накоплением антоцианов в растениях, показаны высокая эффективность разработанных молекулярных маркеров, тесное сцепление аллелей генов Anti и An2 (Anti и An2-Aft, anti иMyb75). Подтверждено повышение накопления антоцианов в плодах и вегетативных органах при усилении потока солнечного света, а также при понижении температуры в конце вегетационного периода.
Выявлены особенности накопления анто-цианов в растениях томата в зависимости от аллелей генов Anti, An2, Atv. Максимальное накопление антоцианов в вегетативных органах и плодах наблюдается у образцов с аллелями Anti/An2-Aft/atv в генотипе. Сочетание аллелей anti/Myb75/Atv связано с отсутствием антоцианов в различных частях растения. Комбинация аллелей Anti/An2-Aft/Atv обеспечивает слабое накопление антоцианов в вегетативных органах, но высокое их накопление в кожице плодов. Получен новый селекционный материал для создания форм с повышенным накоплением антоцианов и высокими антиоксидантными свойствами
Список использованных источников
1. Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols // S. R. Muir [et al.] / Nat Biotechnol: 2001. - Vol. 19, iss. 5. - P. 470474. - DOI: 10.1038/88150
2. Molecular Aspects of Anthocyanin fruit Tomato in Relation to high pigment-1 // M. Sapir [et al.] / Journal of Heredity: 2008. - Vol. 99, iss. 3. - P. 292-303. - DOI: 10.1093/jhered/ esm128
3. Activation tagging in tomato identifies a transcriptional regulator of anthocyanin biosynthesis, modification, and transport // H. V. Mathews [et al.] / Plant Cell: 2003. -Vol. 15, iss. 8. - P. 1 689-1 703. - DOI: 10.1105/ tpc.012963
4. Characterization of tomatoes expressing anthocyanin in the fruit // P. J. Mes [et al.] / J. Am. Soc. Hortic Sci.: 2008. - Vol. 133, iss. 2. - P. 262269. - DOI: 10.21273/JASHS.133.2.262
5. Anthocyaninl from Solanum chilense is more efficient in accumulating anthocyanin metabolites than its Solanum lycopersicum counterpart in association with the anthocyanin fruit phenotype of tomato // G. Schreiber [et al.] / Theor. Appl. Genet.: 2012. - Vol. 124, iss. 2. - P. 295-307. -DOI: 10.1007/s00122-011-1705-6
6. Colanero, S. The atroviolacea Gene Encodes an R3-MYB Protein Repressing Anthocyanin Synthesis in Tomato Plants // S. Colanero, P. Perata, S. Gonzali / Front. Plant Sci.: 2018. -Vol. 9:830. - DOI: 10.3389/fpls.2018.00830
7. GenBank [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank. - Дата доступа: 01.01.2024.
8. A putative R3 MYB repressor is the candidate gene underlying atroviolacium, a locus for anthocyanin pigmentation in tomato fruit // X. Cao [et al.] / J Exp Bot.: 2017. - Vol. 68(21-22). - P. 5 745-5 758. - DOI: 10.1093/jxb/erx382
9. Бабак, О. Г. Технология маркер-сопут-ствующего отбора форм томата с высокими биохимическими и технологическими свойствами плодов: методические рекомендации / О. Г. Бабак, Н. А. Некрашевич, Н. В. Анисимова, Е. В. Дрозд, К. К. Яцевич, А. В. Кильчев-ский. - Минск: Министерство сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь; Национальная академия наук Беларуси; Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси Право и экономика, 2023. - 74 с.
10. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и пе-рераб. - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.
11. Бабак, О. Г. Новый аллель гена Golden 2-Like, его фенотипическое проявление и селекционное значение у Solanum lycopersicum // О. Г. Бабак [и др.] / Молекулярная и прикладная генетика : сб. ст. / Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси; А. В. Кильчев-ский (гл. ред.) [и др.]. - Минск, 2023. - Т. 34. - C. 6-16.
O. G. Babak, E. V. Drozd, N. A. Nekrashevich, N. V. Anisimova, K. K. Yatsevich, A. V. Kilchevsky
DEVELOPMENT OF MOLECULAR MARKERS FOR THE ACCUMULATION OF ANTHOCYANINS IN FRUITS AND STUDYING THE SPECIFICS OF ANT1, AN2 AND ATV GENE INTERACTION IN SOLANUM
LYCOPERSICUM
State Scientific Institution
“Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus”
27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: o.babak@igc.by
Resequencing of Anti, An2 and Atv MYB TF genes was performed on the collection of S. lycopersicum accessions and related wild tomato species with the different accumulation of anthocyanins in fruits. New molecular markers for the DNA typing of Anti (SCAR Ant1.1-FAM), An2 (SCAR An2-AFT (OM), SCAR An2-4F/R), and Atv (SCAR Atv2) alleles were developed, and their high efficiency was confirmed. A close linkage of the Anti and An2-Aft, anti and Myb75 alleles of Anti and An2 genes was shown. A new allele of the An2 gene was discovered in S. glandulosum (An2-Ins57) the distinctive polymorphisms of which from Myb75 lead to six amino acid substitutions in the protein sequence; two of them are located in the region of the first and second DNA-binding domains. The maximum accumulation of anthocyanins in vegetative organs and fruits was revealed in the accessions with Anti/An2-Aft/atv alleles in the genotype. The combination of anti/Myb75/Atv alleles is associated with the absence of anthocyanins in various plant parts. The combination of Anti/An2-Aft/Atv alleles provides a weak accumulation of anthocyanins in vegetative organs and their high accumulation in the skin of fruits.
Keywords: Solanum lycopersicum, Anti, An2 and Atv genes’ polymorphism, regulation of anthocyanin synthesis, DNA markers.
Дата поступления в редакцию: 08 февраля 2024 г.
