CC BY
10УДК 577.21:631.524.01:635.64
Н.А. Некрашевич, К.К. Яцевич, С.В. Малышев, О.Г. Бабак, А.В. Кильчевский
РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДНК-ИДЕНТИФИКАЦИИ АЛЛЕЛЬНОГО СОСТАВА ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ТИП РОСТА И РАЗВИТИЕ БОКОВЫХ ПОБЕГОВ ТОМАТА (SOLANUM LYCOPERSICUM L.)
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Особенности роста и развития надземной части растения, определяющие его габитус, в условиях дикой природы направлены на эффективное использование ресурсов окружающей среды, таких как солнечная радиация, вода, элементы минерального питания. Представители вида Solanum lycopersicum имеют широкий спектр изменчивости по данному признаку. Встречаются различные формы: от низких супердетерминантных до лиановид-ных. Богатое разнообразие форм обусловлено полиморфизмом ряда структурных и регуля-торных генов, определяющих рост и развитие побегов. Создание и отбор форм томата человеком также направлены на эффективное использование антропогенных ресурсов, вид и количество которых определяется технологией возделывания.
Выращивание томата в условиях защищенного грунта характеризуется сложностью технологии и высокими энергозатратами. Большие объемы ручного труда приходятся на формирование и подвязку индетерминант-ных гетерозисных гибридов. Несвоевременное проведение этого технологического приема приводит к нерациональному использованию питательных веществ. Кроме того, места удаления переросших пасынков могут способствовать проникновению инфекции в растения. Исходя из этого, можно сделать вывод, что оптимальным габитусом для условий защищенного грунта характеризуются сорта с индетерминантным типом роста и ограниченным развитием боковых побегов.
В настоящее время в литературных источниках описаны мутантные аллели генов Self-pruning (Sp), Blind (Bl) и Lateral suppressor (Ls), детерминирующие рост и развитие главного
и боковых побегов томата [1-3]. Разработка методологических основ ДНК-идентификации аллельного состава генов, способствующих ограниченному формированию пасынков у томата, представляет важный практический интерес. Использование разработанных молекулярных маркеров позволит быстро и эффективно отбирать интересующий селекционный материал для дальнейшего изучения и вовлечения в схемы скрещиваний.
Таким образом, целью наших исследования явилась разработка методологических основ ДНК-типирования генов, детерминирующих тип роста и развитие боковых побегов томата.
Материалы и методы
Для проведения исследований использовались коллекционные образцы и гибриды Fj лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии НАН Беларуси, а также образцы томата, полученные из Центра генетических ресурсов томата (Калифорния, США).
На основании последовательностей, опубликованных в базе GeneBank, разработаны ДНК-маркеры к мутантным аллелям генов Self-pruning, Lateral suppressor, Blind, проведена их апробация на коллекции образцов Центра генетических ресурсов томата и типирование коллекционных образцов и гибридов Fj Института генетики и цитологии НАН Беларуси.
ДНК выделяли из свежесрезанных листьев растений набором «Нуклеосорб» комплектации С (Праймтех, Беларусь), согласно методике, рекомендованной производителем. Растительную ткань предварительно измельчали на гомогенизаторе TissueLyser II, концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro.
В работе использованы праймеры, разработанные с помощью программы Vector NTI Suite 7.0.
Реакционная смесь для проведения ПЦР (15 мкл) включала 50 нг ДНК, 250 нМ каждого из пары праймеров, 200 нМ dNTP, 7,5 мкл 2x PCR буфера для Tornado полимеразы, 1 ед.
Электрофорез проводили в 1,2-3%-ном ага-розном геле в стандартном трис-боратном буфере. Гели окрашивали этидиум бромидом и фотографировали при просвечивании ультрафиолетовыми лучами с помощью системы GelDoc 2000 (Bio-Rad). При ДНК-типировании аллеля to-1 продукт амплификации разделяли с помощью капиллярного электрофореза на секвенаторе ABIPRISM®310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).
Результаты и обсуждение
Разработка молекулярных маркеров для ДНК-типирования гена Self-pruning
Вегетативная и репродуктивная фазы роста томата последовательно повторяются во время симподиального роста побега. У растений с диким индетерминантным типом роста соцветия разделяются тремя вегетативными узлами. У детерминантных растений, гомозиготных по рецессивному аллелю гена Self-pruning, симподиальные сегменты прогрессивно развивают меньшее количество узлов вплоть до того, что побег заканчивается двумя последовательными соцветиями. Ген sp является томатным ортологом гена Terminal flower 1, который поддерживает индетерминант-ное состояние меристемы соцветия у ара-бидопсиса. Мутация sp вызвана заменой одиночного нуклеотида (SNP), который приводит к аминокислотной замене и появлению нефункционального белка [1]. Кроме того, в нуклеотидной последовательности sp-
Tornado полимеразы (Праймтех, Беларусь). ПЦР проводили в амплификаторе iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) по программе, представленной в таблице. Температура отжига и время элонгации подбирались индивидуально для каждой пары праймеров.
мутантного аллеля появляется дополнительный сайт рестрикции для эндонуклеазы MvaI.
На основании ДНК-последовательности мРНК (U84140) и информации о расположении интронов sp гена для идентификации мутации был разработан CAPS-маркер (spF/spR): spF CTGTCCAAGTGTTAAGATG spR CTGTAGTGCCTGGAATGT. Амплификация с этими праймерами приводит к синтезу фрагмента длиной 1030 п.н. После рестрикции эндонуклеазой MvaI у растений дикого индетерминантного типа образуются фрагменты 396, 624 и 10 п.н, а у мутантного де-терминантного фенотипа sp - 1020 и 10 п.н. [4].
На рис. 1 представлены результаты ДНК-типирования, в результате которого у семи протестированных коллекционных линий Центра генетических ресурсов томата (LA3903, LA0059, LA3451, LA3901, LA3133, LA3541, LA3802) обнаружен мутантный аллель sp.
Разработка молекулярных маркеров для ДНК-типирования гена Lateral suppressor
Основываясь на литературных данных о влиянии гена Lateral suppressor на ограниченное развитие боковых побегов томата, нами проведена разработка ДНК-маркеров для ПЦР-идентификации его мутантных аллелей ls1 и ls2 [2].
Мутация ls1 вызвана обширной делецией приблизительно 1,5 т.п.о., в результате чего у мутантных форм происходит потеря функциональной активности регуляторного белка семейства VHIID, что негативно сказывается на активности меристем в пазухах побега.
Условия амплификации ДНК с используемыми праймерами
№ Этап Температура, °С Время, с
1 Денатурация 95 900
2 Денатурация 35х 99 1
3 Отжиг 49-56 30
4 Элонгация 72 30-120
5 Элонгация 72 300
6 Охлаждение 16 300
3 LA3761 LA3133 LA3541 LA3802
--■ ■-: М -,-
Рис. 1. Результаты амплификации ДНК коллекционных образцов томата с праймерами spF/spR и последующей
рестрикции эндонуклеазой MvaI
Мутация ls2 вызвана заменой нуклеотидной последовательности ЦААЦАГЦГ в позиции 203-210 на последовательность ТАААА-АЦГГАА. В результате транзиции Ц на Т в позиции 203 у мутантного аллеля появляется стоп-кодон, что в свою очередь приводит к преждевременной терминации трансляции и образованию неактивного белка. Кроме того, в нуклеотидной последовательности ¿^-мутантного аллеля появляется дополнительный сайт рестрикции для эндонуклеазы Trull.
На основании ДНК-последовательности хромосомы (AJ303345), информации о расположении гена Ls и расположении мутации ls1 был разработан SCAR-маркер (lsl-3512F/ ls1-5347R): ls1-3512F ATCTCAACCCTAATGAGTGA ls1-5347R CCGATAAATACCAACACTCT. В результате амплификации с праймерами ls1-3512F/ls1-5347R синтезировался фрагмент длиной 1836 п.о. у растений дикого типа и размером 287 п.о. у растений, несущих мутантный аллель ls1. На рис. 2 представлены электрофореграммы разделения полученных ПЦР-продуктов в агарозном геле. Нами об-
наружены два коллекционных образца Центра генетических ресурсов томата - LA2892 и LA3761 - с мутантным аллелем Ь1, что подтверждает эффективность использования разработанного маркера.
Е
.с
о СП ОТ ^ см
Е ё ё ¡5! со
5 1_Л32441_Л27061_Л39033 3|-Л0709 -А0980 -Л34511 3 1-Л3901 3
I-.-¡1-II-: М I I *-I <1
5 LA3761 LA3133 LA3541 LA3802
-1 — M
Я ПО:—
1000 П:0: — 500 П:0: —
300 П.0.—
Рис. 2. Результаты амплификации ДНК коллекционных образцов томата с праймерами ls1-3512F/ls1-5347R
На основании ДНК-последовательности мРНК (AF098674) гена Ls и информации о локализации и характере мутации у аллеля ls2 разработан CAPS-маркер (ls2-123F/ls2-582R): ls2-123F TGAATGATATGTTAGGATCC ls2-582R TGAGTAAACCTTATGAAAGG. В результате амплификации с указанным маркером синтезируется фрагмент длиной около 460 п.о. После рестрикции амплифицируемого фрагмента эндонуклеазой Tru1l у образцов, несущих мутантный аллель ls2, происходит расщепление ампликона на два фрагмента размером 380 п.о. и 81 п.о. У растений дикого типа не происходит уменьшение длины ПЦР-продукта.
На рис. 3 представлены результаты апробации разработанного маркера на коллекционных образцах Центра генетических ресурсов томата. Согласно полученным данным, у образца LA3901 идентифицирован мутантный аллель ls2.
Разработка молекулярных маркеров для ДНК-типирования гена Blind
Известно, что ген Blind кодирует фактор транскрипции MYB, контролируя тем самым образование боковых меристем у растений томата. Мутации в данном гене вызывают
потерю активности регуляторного белка, тем самым блокируя формирование боковых меристем и образование боковых побегов. На данный момент в литературе имеется описание трех мутаций гена Blind:
а) мутация bl-1, вызванная делецией размером 37 п.о. в позиции 427-463 на кДНК дикого аллеля Blind (AF426174);
б) мутация bl-2 (to-2), вызванная делецией размером 34 п.о. в позиции 395-428 на кДНК дикого аллеля Blind (AF426174);
в) мутация to-1 вызванная делецией в 1 п.о. в позиции 820 на кДНК дикого аллеля Blind (AF426174) [3].
На основании нуклеотидной последовательности мРНК гена Blind (AF426174) и информации о расположении мутации bl-1 нами был разработан SCAR-маркер bl1-397F/bl1-575R:
bl1-397F CTCAAGAAAAAGCTCATGGG
bl1-575R GCTGGAATAATAATGGGCTG.
В результате ПЦР с указанными праймерами у растений дикого типа амплифицируется фрагмент длиной 179 п.о., у растений с мутантным аллелем bl-1 - 142 п.о. На рис. 4 представлены результаты ДНК-типирования образцов коллекции Института генетики и цитологии и
3 LA3761 LA3133 LA3541 LA3802
1 . 1 : • М : К '
•
Рис. 3. Результаты амплификации ДНК коллекционных образцов с праймерами ls2-123F/ls2-582R и последующей рестрикции эндонуклеазой Tru1l
контрольных образцов коллекции Центра генетических ресурсов томата (Калифорния). Показано, что у гибридов первого поколения, полученных при скрещивании с образцом Мо 516, несущим мутантный аллель bl1, разработанный маркер позволяет выявлять мутантный аллель bl-1 в гетерозиготном состоянии.
На основании ДНК-последовательности AF426174 (мРНК гена Blind) и информации о расположении мутации bl-2 (to-2) разработанный SCAR-маркер (bl2-321F/bl2-451R): bl2-321F AAGCAGGTGGTCAATTATAGCG bl2-451R AAGAAGAAGAAGAATTGT. Данный маркер позволил идентифицировать мутантный аллель bl-2 (to-2) в исследуемой коллекции. У растений дикого типа синтезировался фрагмент длиной 131 п.о., у образцов с аллелем bl-2 (to-2) - размером 97 п.о. Полученные результаты подтвердили наличие образца LA0980, содержащего мутантный аллель bl-2 (to-2) (рис. 5).
Для разработки SCAR-маркера (to1-785F/to1-895R) к участку делеции мутации to-1 использовалась информация о ДНК-последовательности
CQ U-F U-F U-F U-F LlF LlF сц ^ S ^ О
м—::—■.—.—г-. ■-м-■—1—.—1— 5т
Рис. 4. Результаты амплификации ДНК коллекционных образцов томата с праймерами bl1-397F/bl1-575R
200 п.о.— 150 п.о.— 100 п.о.—
LA3761 LA3133
LA3541 LA3802
200 п.о.— 150 п.о.— 100 п.о.—
—131 п.о.
Рис. 5. Результаты амплификации ДНК коллекционных образцов томата с праймерами bl2-321F/ bl2-451R
мРНК гена Blind (AF426174). С применением программы Vector NTI Suite 7.0 были подобраны следующие последовательности праймеров, фланкирующие участок однонуклеотидной делеции: to1-785F TTATGAGTTTTGGTGGTCATC to1-895R AACTTGTAGCAATCTCCTGC. Ожидалось, что в результате проведения ПЦР с этими праймерами у образцов с диким аллелем будет синтезироваться фрагмент длиной 111 п.о. и размером 110 п.о. - у растений с мутантным аллелем to-1. В результате проведения амплификации и разгонки продукта ПЦР на секвена-торе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) было выявлено, что ни одна из протестированных коллекционных линий томата не содержала мутантный аллель to-1, у всех протестированных линий синтезировался фрагмент амплификации размером 111 п.о. (рис. 6).
Таким образом, в результате проведенного исследования разработаны праймеры и подобраны оптимальные условия для амплифи-
OS.Isa Об EXAMPLE
0__100__200_
12000-600Û■■ 4000■■
cl—i-à—&!) -
iiiml
< I ; ^_
06.1» 06 EXAMPLE 0__100__200_
12000 0000 400001—4-1-"-
|я iiiJ-сГП
07.1» 07 EXAMPLE
0__100__200_
20000-10000-
ni_k_1_U-
[se llOJll
0№i OS EXAMPLE
0__100__200_
зоооо) 1 ' ' '
20000-■
10000-
„I-i-,- ß -
kiiiO-Oil
Рис. 6. Результаты амплификации ДНК коллекционных образцов томата с праймерами to1-785F/to1-895R
кации мутантных аллелей генов Self-pruning (Sp), Lateral suppressor (Ls) и Blind (Bl), определяющих тип роста и развития побегов.
Заключение
Разработаны молекулярные маркеры, позволяющие выявлять полиморфизм генов, контролирующих тип роста и развитие боковых меристем:
• CAPS-маркер к мутантному аллелю sp гена Self-pruning, детерминирующему тип роста главного побега;
• SCAR-маркер и CAPS-маркер к мутантным аллелям ls1, ls2 гена Lateral suppressor, контролирующим ограниченное развитие боковых побегов;
• SCAR-маркеры к мутантным аллелям bl-1, bl-2 (to-2), to-1 гена Blind, детерминирующим развитие боковых меристем томата.
В результате проведенного ДНК-типирования среди коллекционных образцов и гибридов Fj выявлены образцы линий с ценными мутант-ными аллелями sp, ls1, ls2, bl-1 и bl-2 (to-2) в гомо- и гетерозиготном состоянии.
Методологические основы ДНК-идентификации мутантных аллелей, детерминирующих тип роста и развитие боковых меристем, рекомендованы для ускоренного подбора селекционного материала при создании гибридов томата с пониженным пасынкообразованием.
Список использованных источников
1. The SELF-PRUNING gene of tomato regulates vegetative to reproductive switching of sympodial meristems and is the ortholog of CEN and TFL1 / L. Pnueli [et al.] // Development. -1998 Jun. - Vol. 125(11). - P. 1979-1989.
2. The Lateral suppressor (Ls) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein family / K. Schumacher [et al.] // Plant Biology. - 1999. - Vol. 96. - P. 290-295.
3. The tomato Blind gene encodes a MYB transcription factor that controls the formation of lateral meristems / G. Schmitz [et al.] // PNAS. -2002. - Vol. 99. - P. 1064-1069.
4. Разработать технологии ДНК-типирова-ния генов высокого качества плодов и создать с их применением гетерозисные гибриды томата: отчет о НИР (заключ.) / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, рук. А.В. Кильчевский. - Минск, 2011. - 115 с. - № ГР 20110123.
Дата поступления статьи 9 августа 2015 г.
