CC BY
10ISBN 0869-7922. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК. № 4 июль-август 2007. УДК 616.697-02:615.9
А.А.Масленников
РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ ХИМИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА
Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии, Волгоград
Субхроническое (3 недели) внутрибрюшинное введение крысам-самцам триметилфосфата на уровне 1/50 DL50 вызывает 100% стерильность. В реализации индуцируемого веществом мужского бесплодия ведущее место занимает мутагенный фактор.
Ключевые слова: мужское бесплодие, гонадотоксичность, мутагенность.
Введение. В течение последних десятилетий нарушения репродуктивной функции у человека, возникающие под воздействием различных факторов, являются достаточно значимой медико-социальной проблемой.
Одной из сторон практической реализации указанной патологии является проблема бесплодных браков. На сегодняшний день по статистике из 100 супружеских пар 15 оказываются бесплодными [1].
Общеизвестно, что до недавнего времени «виновником» бесплодных браков в основном считалась женщина. Однако учёными многих стран доказано проявление стерильности у мужчин (до 40% бесплодных браков) [2].
Среди причин, способствующих возникновению и развитию данного вида нарушений генеративной функции, немаловажную роль играет химический фактор [3-5].
Несмотря на обширность сведений о химической природе повреждений половой функции, патогенез последних в большинстве случаев остается невыясненным, что затрудняет разработку лечебно-профилактических рекомендаций. В этой связи цель работы заключалась в создании экспериментальной модели химически индуцированной патологии мужской репродуктивной функции с установленным механизмом гонадоповреждающего действия.
Материалы и методы исследования. В качестве модельного вещества использован триме-тилфосфат (ТМФ), известный своими гонадо-повреждающими свойствами [6, 7]. Рабочие растворы ТМФ готовили ex tempore с применением дистиллированной воды.
Исследования выполнены на половозрелых белых беспородных 316 крысах (138 самок и 178 самцов) с исходной массой тела — 180—220 г.
При проведении исследований тестируемое вещество вводили лабораторным животным вну-трибрюшинно, что позволяет в случае применения лекарственных средств, направленных на ку-
пирование данного вида патологии, использовать иные пути их поступления (например, per os).
Самцы контрольной группы на протяжении всего эксперимента получали адекватные объёмы дистиллированной воды.
При выборе методических подходов исходили из положения о том, что вредное влияние любого химического вещества может быть обусловлено его воздействием как на гормональную функцию гонад, которая является отражением нейрогуморальной регуляции в системе «гипота-лямус — аденогипофиз — семенники» [8, 9], так и на генеративный эпителий семенников и функциональную активность зрелых половых клеток, вследствие цитотоксических и мутагенных проявлений.
Основываясь на данных позициях, специфические эффекты воздействия на гонады исследуемого соединения определяли по трем группам показателей [10, 11].
1-ю группу составляли показатели, опосредованно отражающие влияние химического вещества на репродуктивную функцию через ней-рогуморальную систему, которую оценивали по способности самцов к спариванию. 2-я группа содержала тесты по оценке состояния семенников, развивающихся гамет и активности сперматозоидов. Наряду с перечисленным, в данной группе оценивали способность самцов к репродукции и анализировали плоды на наличие тератогенных эффектов. В 3-ю группу включен комплекс методов по изучению мутагенной активности вещества.
Полученные в процессе исследований результаты, в зависимости от вида эмпирического распределения изучаемых признаков, обрабатывали с применением стандартного критерия t-Стьюдента-Фишера, метода Даннета, ф-Фишера [12].
Статистическая группа животных была не менее 8-ми особей, плодного материала — 110—130. Различия считали достоверными при р < 0,05.
Результаты и обсуждение. Исходя из необходимости использования в дальнейших экспериментах долевых среднесмертельных значений ТМФ, на начальной стадии исследований предстояло определить параметры его острой смертельной токсичности.
Основываясь на данных литературы [6 7], проведен ряд опытов при внутрибрюшинном пути поступления вещества в дозе 1200—1700 мг/кг. Исследования выполнены на 48 самцах крыс с массой тела 200—220 г. Расчёт доз ТМФ проводили с учётом его удельного веса и содержания действующего начала. Изучаемое соединение вводили внутрибрюшинно из расчета (100 мкл на 100 г массы тела). Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней.
Результаты, полученные в процессе выполнения экспериментов, позволили рассчитать уровень ВЬ50, который составил 1500 мг/кг.
Основываясь на полученных данных, изучение способности самцов к спариванию, оплодотворению, а также состояния их гонад и гамет при воздействии ТМФ проводили в трёх сериях подострых экспериментов.
В первой серии крысам самцам в течение четырёх недель внутрибрюшинно вводили триме-тилфосфат на уровнях 1/10, 1/50 и 1/100 БЬ50.
Схема проведения исследований в данной и последующих сериях была универсальной и сводилась к следующему. За 3 дня до окончания периода воздействия самцов всех групп, с целью определения способности к спариванию и оплодотворению, индивидуально подсаживали к ин-тактным самкам, находившимся в фазе эструс, в соотношении 1:2. Замену самок проводили ежедневно до полной комплектации статистических групп (11—12 крыс в группе). На 21-ый день установленного срока беременности самок умерщвляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных жи-
вотных», утверждёнными МЗ РФ от 12.08.77, № 755. После этого вскрывали брюшину, извлекали плоды для дальнейшего обследования на наличие дефектов развития.
Самцов по завершении периода спаривания умерщвляли, извлекали семенники с хвостовой частью придатков с целью последующего анализа функционального состояния сперматозоидов и морфоструктур их гонад.
В процессе проведения исследований установлено, что, формирование групп оплодотворённых крыс проходило во всех группах практически в равные сроки, что свидетельствует об отсутствии нарушений со стороны половой активности самцов.
В то же время вскрытие самок на 21-ый день беременности показало, что длительное воздействие соединения в дозах 1/10 и 1/50 БЬ50 привело к абсолютной стерильности самцов, о чём свидетельствовало 100% отсутствие беременных животных.
Однако поступление соединения в дозе на уровне 1/100 БЬ50 не нарушало способности самцов к полноценному оплодотворению самок (табл. 1). Расчёт в данной группе индексов оплодотворения, средней численности плодов, приходящихся на одну самку, их массы и длины, а также анализ плодного материала, на установление возможного тератогенного эффекта не выявил статистически значимых межгрупповых отличий.
При характеристике спермограммы установлено, что субхроническое воздействие вещества только в большей дозе приводило к угнетению функциональной активности сперматозоидов подопытных животных (табл. 1).
Анализ гистоструктур гонад показал, что к концу периода поступления в дозах 1/10 и 1/50 БЬ50 соединение вызывало статистически значимое увеличение численности канальцев с 12-ой стадией мейоза (табл. 1).
Таблица 1
Некоторые показатели состояния репродуктивной функции самцов крыс после четырёхнедельного
внутрибрюшинного воздействия триметилфосфата
Показатель, единицы измерений Уровень воздействия вещества Контроль
1/10 dl5O 1/50 DL50 1/100 DL50
Индекс оплодотворения,% 0,0 0,0 91,7 91,7
Время подвижности гамет, мин. 45,6±2,2* 57,5+8,6 54,0+2,7 59,8+3,0 (42,8 + 76,8)
Осмотическая резистентность гамет, %№С1 2,51+0,12* 3,05+0,11 3,03+0,14 3,01+0,12 (2,33 + 3,69)
Кислотная резистентность гамет, рН 6,95+0,07* 6,81+0,05 6,84+0,08 6,71+0,07 (6,31 + 7,11)
Канальцы с 12 стадией мейоза,% 1,05+0,14* 1,00+0,11* 0,80+0,15 0,51+0,10 (-0,06 + 1,08)
Примечание: в этой и последующих таблицах знаком * отмечены статистически значимые отличия от контроля
Таблица 2
Некоторые показатели состояния репродуктивной функции самцов крыс после трёхнедельного внутрибрюшинного воздействия триметилфосфата
Показатель, единицы измерений Уровень воздействия вещества Контроль
1/10 dl50 1/50 DL50 1/75 DL50
Индекс оплодотворения,% 0,0 0,0 91,7 100,0
Время подвижности гамет, мин. 50,2±3,2* 57,4+5,4 58,8+3,8 62,3+4,1 (39,1-85,5)
Кислотная резистентность гамет, рН 6,91+0,04* 6,78+0,04 6,72+0,06 6,74+0,06 (6,40-7,08)
Численность сперматозоидов в 50 мг ткани придатка, млн 15,69+1,72* 18,69+1,92 19,84+1,95 20,41+1,16 (13,84-26,98)
Канальцы с 12 стадией мейоза, % 1,03+0,16* 0,74+0,18 0,80+0,12 0,62+0,08 (0,17-1,07)
Таким образом, в проведённых исследованиях был установлен факт стерильности самцов под воздействием тестируемого ксенобиотика. В то же время не определена минимальная продолжительность воздействия триметилфосфата.
С учётом изложенного, исследования были продолжены во второй серии опытов. Вещество вводили крысам-самцам в дозах 1/10 и 1/50 ВЬ50 в течение 3-х недель.
Кроме того, поиск минимально действующей дозы вещества при заданной продолжительности воздействия проводили на уровне 1/75 БЬ50.
Принимая во внимание отсутствие изменений у потомства подопытных самцов в первой серии опытов, в настоящих исследованиях их обследование не проводили.
Анализ исследований свидетельствует о том, что поступление тестируемого вещества в организм подопытных самцов не нарушало у них способности к спариванию.
В то же время установлено, что длительное воздействие соединения в дозах 1/10 и 1/50 БЬ50 привело к 100% стерильности самцов.
Кроме того, поступление соединения в большей дозе изменяло отдельные показатели спер-мограммы и сперматогенеза животных (табл. 2).
Следует отметить, что воздействие вещества в дозе 1/75 БЬ50 не вызывало у подопытных крыс
каких-либо изменений в состоянии репродуктивной функции, вследствие чего данный уровень воздействия был исключён из дальнейших исследований.
С учётом изложенного поиск минимальной продолжительности воздействия вещества в уровнях 1/10 и 1/50 БЬ50 был продолжен в третьей серии опытов.
Исходя из полученных данных, соединение вводили в дозе 1/10 БЬ50 в течение одной и двух недель, в дозе 1/50 БЬ50 — только двух недель.
В процессе проведения опытов установлено, что только двух недельное воздействие соединения в дозе 1/10 БЬ50 вызывало стерильность у самцов, о чём свидетельствовало 100% отсутствие беременных самок.
Отмеченный эффект проявлялся на фоне отдельных изменений показателей спермограммы крыс (табл. 3).
Обобщая результаты проведённых исследований, можно отметить следующее.
Субхроническое (3 недельное) поступление ТМФ в дозе 1/50 БЬ50 вызывает абсолютную стерильность самцов, проявляющуюся на фоне отсутствия изменений половой активности животных и функционального состояния их гамет.
С учётом отмеченного рассматриваемый уровень воздействия с указанной продолжительно-
Таблица 3
Некоторые показатели состояния репродуктивной функции самцов крыс после одно- и двухнедельного
внутрибрюшинного воздействия триметилфосфата
Показатель Уровень и продолжительность воздействия вещества Контроль
1/10 DL50 1/10 DL50 1/50 DL50
I неделя II недели
Индекс оплодотворения, % 100,0 0,0 100,0 100,0
Время подвижности гамет, мин 51,3+7,1 42,6+4,5* 59,8+4,4 59,7+4,7 (33,1-86,3)
Кислотная резистентность гамет, рН 6,68+0,05 6,88+0,04* 6,80+0,06 6,70+0,04 (6,47-6,92)
стью является наиболее предпочтительным при обосновании экспериментальной модели нарушений мужской репродуктивной функции.
С целью установления механизма токсического действия соединения проведён анализ возможных причин формирования выявленной патологии.
Учитывая, что вещество при его 3 недельном поступлении не изменяло функциональную активность сперматозоидов, не угнетало способность самцов к спариванию (отсутствие цито-токсического эффекта и влияния на гормональный статус), естественно предположить, что реализация стерилизующего эффекта осуществляется за счёт мутагенного фактора. На это косвенно указывает увеличение численности канальцев с 12 стадией мейоза (2 метафаза).
Исследование мутагенных свойств триметил-фосфата показало следующее.
При испытании в тесте Эймса соединение в концентрации 100 и 1000 мкг/пробу вызывало достоверное превышение численности бактерий линии ТА-98 (табл. 4).
Тестирование вещества в микроядерной пробе показало, что его внутрибрюшинное поступление в уровнях 1/10 и 1/100 БЬ50 (по 6 самцов в группе) приводило к статистически значимому увеличению в костном мозге подопытных особей численности полихроматофильных эритроцитов с экс-трануклеарными включениями (табл. 4).
Следует отметить, что зарегистрированные нарушения не сопровождались токсическим влиянием на процессы митотического деления развивающихся клеток, что отрицает проявление цитотоксического эффекта [11].
При выполнении метода доминантных ле-талей установлено, что субхроническое внутри-брюшинное введение препарата в дозе 1/100 БЬ50 приводило к достоверному увеличению эмбриональной гибели на постимплантационной стадии развития (табл. 4).
По существующим представлениям отмеченный факт однозначно свидетельствует о способности вещества оказывать токсическое воздействие на половые клетки самцов крыс вследствие генетической активности.
Таблица 4
Характеристика мутагенных свойств зомана
Показатель Наличие эффекта
Тест Эймса +
Микроядерная проба +
Метод доминантных деталей +
Следовательно, тестируемый химагент проявил мутагенные свойства, зафиксированные во всех тестах. С учётом данного обстоятельства
можно сделать вывод о том, что триметилфосфат является универсальным мутагеном.
Исходя из представленных данных, следует, что основу развития мужского бесплодия индуцируемого триметилфосфатом составляет генетический фактор.
Общеизвестно, что в процессе оплодотворения гаметы с искаженным генетически кодом, доходя до яйцеклетки, образуют зиготу с изменённой наследственной информацией, в результате чего может наблюдаться снижение фер-тильности самок, повышенная гибель эмбрионов и/или проявляться тератогенный эффект. Не случайно экспертами ВОЗ подтверждается факт наличия у детей врождённых пороков развития, обусловленных контактом их родителей с мутагенами [13].
В заключение необходимо отметить, что 3-х недельное введение самцам крыс триметилфос-фата в дозе 1/50 DL50 обеспечивает надёжную модель абсолютной стерильности животных с установленным механизмом гонадоповреждаю-щего действия.
Наличие данной модели позволит вести целенаправленный поиск лекарственных средств в процессе проведения лечебно-профилактических мероприятий, направленных на купирование исследуемой патологии.
Выводы. 1. Трёхнедельное внутрибрюшинное введение триметилфосфата в дозе 1/50 DL50 вызывает у самцов крыс стойкий воспроизводимый эффект стерильности.
2. Индуцируемое веществом бесплодие обусловлено мутагенным фактором.
3. Разработанная модель мужского бесплодия может быть использована при скрининге и апробации новых лекарственных препаратов.
Список литературы
1. Масmерc У.Г., Джонсон В.Э., Колодни Р.К. Основы сексологии. Пер. с англ. — М.: Мир, 1998. — 692 с.
2. Апполинариев С.А. Общие аспекты мужского бесплодия и современный взгляд на проблему. — М, 2003.
3. Yassi. Annalee Basic Environmental Health. — Oxford, New York: Oxford University Press, 2001. — 230p.
4. Аналитический обзор состояния здоровья населения РФ и территорий с неблагополучной экологической обстановкой. — М.: ЭКОАССПРОФ, 1994. — 28 с.
5. Величковский Б.Т., Суравегина И. Т., Ци-плёнкова Т.Т. Здоровье и окружающая среда. — М.: Экология и образование, 1992. — 158 с.
6. Hanna P.J., Kerr J.B. Antifertility activity of trimethylphosphate in male rats // Experienta, 1987. — V. 37. — № 9. — P. 999-1001.
7. Harbison R.D., Dwivedi C., Evans M. A proposed mechanism for TMPh induced sterility // Toxicol. and Pharmacol., 1976. - V. 35. - № 3. - P. 481-490.
8. Габер Е.С., Данилова А.В., Князева Е.Ф. и др. Сперматогенез и его регуляция. - М.: Наука, 1983. - 232 с.
9. Науменко Е.В., Осадчук А.В., Серова Л.И. и др. Генетико-физиологические механизмы регуляции функции семенников. - Новосибирск: Наука, 1983. - 195 с.
10. Саноцкий И.В., Фоменко В.Н. Отдалённые последствия влияния химических соединений на ор-
ганизм. — М.: Медицина, 1979. — 232 с.
11. Меркурьева Р.В., Судаков К.В., Бонашев-ская Т.И. и др. Медико-биологические исследования в гигиене. — М.: Медицина, 1986. — 272 с.
12. Статистика. Учебное пособие / Под ред. проф. М.Р.Ефимовой. — М.: ИНФРА, 2003. — 336с.
13. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. № 155. Биомаркёры и оценка риска: концепции и принципы. — Женева: МПХБ, ВОЗ, 1996. — 96 с.
Материал поступил в редакцию 18.09.06.
A.A.Maslennikov MODELING OF MALE STERILITY OF CHEMICAL GENESIS
Research Institute of Hygiene,Toxicology Vand, Occupational Pathology, Volgograd
Subchronic (3 weeks) intraperitoneal administration of trimethylphosphate at a level of 1/50 LD50 to male rats induces 100% sterility. The mutagenic factor plays a crucial part in the development of male sterility.
УДК 615.849.5+546.49/612.67+577.861[575.113+616.36]615.9:599.323.4
С.Д.Иванов1, М.П.Собуцкий2*, Е.Г.Кованько1, С.И.Лютинский2
ВОЗРАСТНЫЕ И ПОЛОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ В ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ И ГЕПАТОТОКСИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ У КРЫС ПОСЛЕ НИЗКИХ ДОЗ РАДИАЦИОННО-РТУТНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ
1ФГУ Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт
Росздрава,
2ФГОУВПО Государственная Академия ветеринарной медицины, С.-Петербург
Молодые (4—5 мес.) и пожилые (15—18 мес.) крысы обоих полов получали с питьевой водой соль ртути в течение 3 мес. до и 1 мес. после однократного рентгеновского облучения. Молодые самки в ранние сроки проявили чувствительность к радиационно-ртутному воздействию, но затем показали лучшее восстановление в сравнении с молодыми самцами и пожилыми самками. Пожилые самцы оказались наиболее резистентными.
Ключевые слова: молодые и пожилые крысы, самцы и самки, радиационно-ртутное воздействие в малых дозах, ге-нотоксические эффекты в лейкоцитах, АЛТсыворотки крови.
Введение. Значительная часть населения мегаполисов и промышленно-загрязненных регионов подвергается различным повреждающим воздействиям в относительно невысоких дозах. Так как патогенные факторы редко носят изолированный характер, то, как правило, человек подвергается действию комплекса вредных агентов, в частности, химических токсикантов (в том числе, тяжелых металлов), различных физических воздействий (электромагнитного, ионизи-
* Фрагмент диссертационной работы
рующего излучения), патогенных микроорганизмов и т. д. При этом организмы человека и животных разного возраста и пола по разному могут реагировать на такие повреждающие воздействия факторов окружающей среды и их сочетаний. На основании оценки генотоксических реакций известно, например, что с увеличением возраста у млекопитающих ухудшается репарация ДНК после окислительного стресса [1, 2, 4, 6 и др.]. Вместе с тем, менее изученной и неоднозначной остается роль половых различий при окислительном стрессе, в частности, при дей-
