CC BY
31
2. ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 632.22/.28:636.082.454:619:615.28
РАЗРАБОТКА, МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТИВОМИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА «ФЕРТИЛИФИЛ К» ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ОПЛОДОТВОРЯЕМОСТИ КОРОВ
О. Н. КУХТИНА, Г. Ф. МЕДВЕДЕВ, Н. И. ГАВРИЧЕНКО
УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия», г. Горки, Республика Беларусь, 213407
А. А. СИВАКОВ
ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования» г. Минск, Республика Беларусь, 220013
(Поступила вредакцию 21.10.2013)
Резюме. Разработан препарат «Фертилифила К» для включения в состав разбавителя для спермы быков и повышения оплодотворяемости коров при осеменении. В состав препарата включены четыре антибиотика. Экспериментальные серии препарата выпущены по 0,375 г (одна доза), или 1,5 г (4 дозы) во флаконах емкостью 10 мл. Срок хранения не менее 2-х лет. Разработан аналитический метод определения подлинности и массовой концентрации антибиотиков. Микроорганизмы, выделенные из матки повторяющих половую охоту коров, были высокочувствительны к препарату.
При включении в состав разбавителя «Фертилифила К» (опыт) или «Полигена» (контроль) после оттаивания замороженных образцов спермы в них содержалось 40 % подвижных сперматозоидов, а после инкубации в течение 5 ч - соответственно 22±0,3 % и 20±0,3 % (P<0,01). Рост на агаре колоний в опыте в 6 пробах из 22, в контроле - во всех 22.
После введения препарата низко плодовитым коровам при осеменении оплодотворяемость составила 35,1 %. Высокий результат получен при применении препарата в третью охоту (77,7 %) и достаточнохороший - в четвертую охоту (50 %).
Ключевые слова: препарат, Фертилифил К, коровы, оплодотворяемость, микроорганизмы, сперма, качества.
Summary. Preparation «Fertilifil К» has been developed to integrate into bull semen diluent and increase conception rate while inseminating cows. Four antibiotics are integrated into the preparation. Experimental batch of the preparation was produced in 0.375 g (one dose) or 1.5 g (4 doses) in 10-ml-bottles.Shelf life is at least 2 years. Analytical method for identification of antibiotics and determination of their mass concentration has been developed. Microorganisms isolated from the uterus of cows in repeated estrus were highly sensitive to the preparation.
When «Fertilifil K»(experiment) or «Poligen» (control) was added to the diluent after thawing of the frozen semen samples there was 40 % of active sperm, and after 5-hour incubation - 22±0.3 % and 20±0.3 % (P<0,01) respectively. In the experiment colonies grew on agar culture medium in 6 samples of 22, in the control - in all 22 samples.
After administration of the preparation while inseminating the cows having low reproductive rate the conception rate was 35.1 %. The high result was obtained after the preparation was administered to the cows in the third estrus (77.7 %) and good enough one - in the fourth estrus (50 %).
Key words: preparation, Fertilifil K, cows, conception rate, microorganisms, semen, quality.
Введение. Проблема оплодотворения отдельных коров существовала всегда. При естественном осеменении в стадах с выходом телят 95-97 на 100 коров после 1-3-го осеменения приносили приплод 91,6 % животных [5]. Следовательно, 8,4 % животных приходилось осеменять более трех раз. При искусственном осеменении 30 коров из 100 необходимо осеменять дважды, 9 - три раза и 2-3 коровы -4 раза [9]. В стадах с оплодотворяемостью после первого осеменения 50 % или ниже число неоплодо-творенныхживотных после третьего осеменения достигает 12,5 % и после четвертого - 6,2 % [7].
Животных, не оплодотворившихся после третьего или четвертого осеменения и не проявляющих инфекционных заболеваний или явно выраженных патологических изменений в половых органах, относят в категорию с синдромом «повторения половой охоты». Основная причина отсутствия оплодотворения - неблагоприятная среда в матке вследствие патологических изменений в эндометрии в результате хронического воспаления, ослабления функции желтого тела или ненормального преову-ляторного периода.
Анализ источников. В зависимости от условий хозяйствования у ряда животных проблема оплодотворения возникает как после проявления воспалительных процессов в половых путях, так и с нормальным отелом и послеродовым периодом [6]. В двух опытах после третьего осеменения не оп-лодотворялось 5,8-6,1 %, а после четвертого - 1,6-2,1 % коров; способ содержания незначительно
влиял на частоту проявления синдрома. В этих опытах при бактериологическом исследовании в маточном содержимом у животных, переболевших эндометритом, выявлялись микроорганизмы. При своевременном и эффективном лечении коров с метритным комплексом частота проявления синдрома не увеличивалась [2].
При гистологическом исследовании у длительно бесплодных коров в эндометрии выявлялись патологические изменения (увеличение диаметра маточных желез, разрастание соединительной ткани вокруг них, повреждение покровного эпителия или почти полное отсутствие его, появление гранулем в компактном слое идр.) [3].
Связь хронических патологических изменений в эндометрии и низкой оплодотворяемости в значительной мере обусловлена бактериальной инфекцией в матке. В ряде работ указывается на высокую частоту выделения микроорганизмов из вагинальной слизи у повторяющих охоту коров [10].
Для восстановления плодовитости коров с синдромом «повторения половой охоты» важно знать причины развития патологии и иметь специфические лекарственные средства и методы, применение которых может существенным образом изменить состояние среды в матке таких животных.
Цель работы - разработать состав, методы контроля и определить эффективность антибиотического препарата для повышения оплодотворяемости коров и в качестве санирующего средства в разбавителях для спермы быков.
Материал и методика исследований. При разработке состава препарата был учтен мировой опыт использования в разбавителях для спермы быков различных антибактериальных веществ и их сочетаний, оказывающих губительное действие на наиболее часто встречающиеся как в сперме, так и в матке популяции микроорганизмов.
При использовании комплекса антибиотических веществ в составе разбавителей для спермы обычно каждое антибиотическое вещество хранится по отдельности, а перед употреблением проводится смешивание растворенных частей их в соответствующей пропорции, и необходимое количество раствора вносится в разбавитель. Это делается для увеличения срока хранения химически чистых субстанций [4, 11]. Препарат «Фертилифил-К» является сложным порошком, включающим комплекс субстанций. Поэтому необходимо было определить срок хранения препарата, при котором были бы исключены потери активности каждого компонента. Потребовалась разработка методики лабораторного исследования препарата для определения подлинности и массовой концентрации всех антибиотических веществ на протяжении срока хранения.
В качестве средства измерений был выбран жидкостной хромато-масс-спектрометр «Agilent 1200/6410» с дегазатором, системой градиентного элюирования, устройством автоматического ввода пробы, термостатом колонок, термостатом образцов, диодно-матричным детектором, тандемным масс-спектрометром. Вспомогательные устройства - колонка хроматографическая ZORBAX SB C18 2,1x30 мм, размером частиц 3,5 мкм производства Agilent Technologies и Микрошейкер IKA.
Растворитель готовили следующим образом: смешивали элюент A и элюент B в пропорции 95^5 (об./об.). Элюент A: 5,0 см3 муравьиной кислоты смешивали с 995 см3 дистиллированной воды; раствор готовили перед началом исследований. Элюент B - ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ.
Для приготовления исходных растворов были приобретены химически чистые субстанции антибиотических веществ, входящих в состав препарата. Навеску каждого вещества 0,050 г растворяли в воде и разбавляли до 50 см3 тем же растворителем. Полученный раствор хранили в холодильнике не более суток при температуре 3-8 °С.
После подготовки измерительной аппаратуры и испытания пригодности хроматографической системы выполняли измерения и учитывали результаты.
Для выяснения присутствия, видового состава и свойств микроорганизмов в матке коров, повторяющих половую охоту, было использовано в опытах 14 животных. Смывы брали из рогов матки в различные сроки полового цикла с помощью одноразовых полистироловых пипеток, соединенных с одноразовыми шприцами. Бактериологическое исследование проводили в Могилевской областной ветеринарной лаборатории. При выделении из проб микроорганизмов определялась их чувствительность к различным антибиотикам, а также к препарату «Фертилифил К».
Для оценки эффективности «Фертилифила К» в разбавителе для спермы быков был проведен опыт в Могилевском госплемпредприятии. Использовали препарат в качестве санирующего средства при разбавлении 22 дуплетных эякулятов от 16 быков. После оценки качества свежеполученной спермы эякуляты делили на 2 неравные части. Большую часть разбавляли стандартным разбавителем с добавлением «Полигена», а меньшую часть - тем же разбавителем с добавлением «Фертилифила К». До и после замораживания проводили оценку качества спермы с использованием программы
SpermVision. Для бактериологических исследований делали посев на поверхность ГРМ агара в бактериологических пробирках. Выдерживали в термостате при 37,5±0,5 °С.
Так как применение препарата животным было намечено приурочивать ко времени их осеменения, причем вводить в матку в более высоких концентрациях, чем в разбавитель, необходимо было исключить возможное токсическое действие его на сперматозоиды. Для этого сначала были проведены опыты по выяснению влияния «Фертилифила К» на сперматозоиды in vivo, а затем изучено влияние его на оплодотворяемость при повторных осеменениях коров.
В первых двух опытах использовано 14 коров, не оплодотворившихся после 3-6 осеменений. Десяти животным за 1 ч до осеменения вводили в тело матки одну дозу препарата (объем 25 мл). Затем животных осеменяли, вводя сперму в переднюю часть шейки матки. Извлекали сперматозоиды через 18 ч после осеменения из того рога матки, на стороне которого в яичнике пальпировался крупный фолликул. В качестве промывной жидкости использовали 2,9 %-ный раствора натрия цитрата (5 мл). Вводили раствор полистироловой пипеткой, соединенной со шприцем. После осторожного массажа матки, не смещая пипетки, отсасывали доступную часть раствора. Затем извлекали инструмент из матки, измеряли полученное количество жидкости и под микроскопом определяли с помощью счетной камеры количество сперматозоидов, а в мазке - процент подвижных клеток [1, 8].
Во втором опыте четырем коровам, которые не были оплодотворены после 5-6 осеменений, препарат вводили за 15 мин. до введения спермы. Извлечение сперматозоидов проводили, как и в первом опыте через 18 ч.
В КСУП «Козенки-агро» 51 коровам, которые повторили охоту 1-7 раз, за 15 мин. до осеменения вводили однократно одну дозу препарата. В РУП «Учхоз БГСХА» препарат вводили за 1 ч до осеменения. В школе-ферме использовано в опыте 32 первотелки, которые повторяли охоту 2-7 раз (соот-ветственно n = 9, 14, 5, 1, 2 и 1 голова, в среднем 4,7±0,3 осеменений). На ферме «Паршино» в опыт было включено 8 коров после 1-6 неплодотворных осеменений (соответственно n = 1, 1, 2, 3, 0 и 1 голова, в среднем 4,7±0,3 осеменений).
Биометрическая обработка данных проведена на ПК ЭВМ с использованием стандартных программ Microsoft Excel.
Результаты исследований и их обсуждение. В состав «Фертилифила К» включены линкомицин, спектиномицин, тилозин и гентамицин. Экспериментальные серии препарата выпущены по 0,375 г (одна доза) или 1,5 г (4 дозы) во флаконах емкостью 10 мл. К четырем флаконам с одной дозой придается один флакон емкостью 100 мл с водой очищенной для инъекций в качестве растворителя.
Обычно для исследования однокомпонентных препаратов пригодны аналитические методы, применяемые для анализа субстанций, которые описаны в ГФ РБ, EuPh и других фармакопеях. В случае «Фертилифила К» задача оказалась более сложной. Препарат содержит четыре субстанции: линкоми-цина гидрохлорид, спектиномицина гидрохлорид, тилозина тартрат и гентамицина сульфат. Кроме того, субстанции гентамицина и тилозина не являются индивидуальными веществами, а представляют собой смеси, содержащие от четырех до пяти индивидуальных веществ. В такой ситуации подход с использованием фармакопейных методик выглядел нецелесообразным, поскольку предполагал разработку метода определения на каждую субстанцию и требовал применения жидкостной и газовой хро -матографии с различной конфигурацией детекторов. Близкие физико-химические свойства субстанций не позволяли надеяться на то, что фармакопейные методы будут иметь приемлемую специфичность.
Нами был разработан простой и специфичный мультиметод, позволяющий определять в одном «заколе» все действующие вещества, входящие в состав препарата. Метрологические характеристики разработанной методики представлены в табл. 1.
Таблица 1. Предварительные нормативы внутреннего контроля
Компонент Ед. измер. Диапазон применения Правильность, % Повторяемость, % Внутрилабораторная точность, %
Гентамицина сульфат МЕ/ флакон 36500-109500 1 2 3
Линкомицина гидрохлорид Г/ флакон 0,0375-0,1125 1 2 3
Спектиномицина гидрохлорид МЕ/ флакон 47500-142500 1 1 2
Тилозина тартрат МЕ/ флакон 10000-30000 2 3 4
Растворы сравнения готовили вместе с испытуемыми растворами и поочередно подвергали хрома-тографическому анализу не менее 5 раз. Использовали жидкостной хроматограф: модульная система Agilent 1200, аналитическая колонка ZORBAX SB C18 2,1x30 мм; температура колонки 30 °C; мобильная фаза: А - 5,0 см3 муравьиной кислоты смешивают с 995 см3 дистиллированной воды, В -ацетонитрил (MeCN); поток: 0,3 mL/min; градиент:
Время, мин. Элюент А, % Элюент В, %
0 95 5
10 40 60
11 95 5
15 95 5
Объем инжекции: 0,5 цЬ; термостат образцов: 10 °C.
Аналитические сигналы регистрировали при помощи масс-спектрометрического детектора с источником ионизации электроспрей (ESI) в режиме SIM. Температура осушающего газа 300 °C, поток 7 L/min, распылитель 30 psig, напряжение капилляра +2000 V, время задержки 100 msec.
Компонент Полярность Фрагментор, V Регистрируемый ион Ион, m/z
Гентамицин Положительная 113 [M+H]+ 464,3
Линкомицин Положительная 133 [M+H]+ 407,2
Спектиномицин Положительная 143 [M+H3O]+ 351,2
Тилозин Положительная 40 [M+H]+ 916,5
Обработку ионных хроматограмм и интегрирование площадей пиков выполняли при помощи программы «Workstation». Количественный расчет проводили методом внешнего стандарта.
Для подтверждения подлинности раствор сравнения и испытуемый раствор анализировали в условиях количественного определения в режиме MRM. Масс-спектры субстанций присутствующие в испытуемом растворе должны совпадать со спектрами субстанций из раствора сравнения. Настройки масс-спектрометра, родительские и дочерние ионы представлены ниже:
Компонент Формула Масса Родительский ион, m/z Дочерний ион, m/z Фрагментор, V Ячейка, V
Гентамицин C20H41N5O7 463,3 464,3 42 113 114
100 50
112 38
322 8
Линкомицин C18H34N2O6S 406,21 407,2 41 133 94
42 102
82 98
126 18
Спектиномицин C14H24N2O7 332,16 351,2 41 143 70
42 66
44 62
70 46
Тилозин C46H77NO17 915,52 916,5 43 40 82
88 82
174 38
Применение методики определения антибиотиков, входящих в состав «Фертилифила К», для изучения стабильности препарата подтвердило ее воспроизводимость. Нормативы внутреннего контроля, установленные при валидации МВИ, выдерживаются.
Стабильность препарата подтверждена испытаниями образцов двух экспериментальных серий. Содержание действующих веществ находилось в пределах, установленных техническими условиями. Образцы выдерживали экспериментальный срок хранения, что соответствует заявленному сроку хранения - 2 года.
Результаты испытаний по стабильности препарата «Фертилифил К» серии № 12042011, изготовленной 12.04.2011 г., приведены в табл. 2.
Таблица 2. Результаты испытаний стабильности «Фертилифил К» при хранении
Наименование показателя Критерии испытаний Спецификация Период контроля, мес.
Содержание: ТУ BY 700189441. 044-2013 Диапазон 1 12 24
спектиномицина в дозе препарата, МЕ Те же 75 000-115 000 95 520 94 250 93 800
гентамицина в дозе препарата, МЕ Те же 58 000-88 000 75 130 73 950 72 870
линкомицина гидрохлорида в дозе препарата, г Те же 0,06-0,09 0,078 0,075 0,073
тилозина в дозе препарата, МЕ Те же 15 000-25 000 21 050 20 730 20 015
Подлинность спектиномицина, гентамицина, линкомицина и тилозина Те же должен выдерживать испытания испытания выдерживает испытания выдерживает испытания выдерживает
При включении в состав разбавителя «Фертилифила К» было наморожено с каждого эякулята по 14-50 доз спермы с содержанием около 37,5 млн. сперматозоидов. После оттаивания в образцах спермы опытном и контрольном содержалось 40 % подвижных сперматозоидов, а после инкубации в течение 5 ч - соответственно 22±0,3 % и 20±0,3 % (P<0,01).
При бактериологическом исследовании разбавленной спермы с включением «Фертилифила К» из 22 посевов в 16 роста микроорганизмов не выявлено. В остальных шести количество колоний колебалось от одной до 10 (в среднем 1,3). При использовании «Полигена» рост колоний (от 3 до 10, в среднем 5,7) отмечался во всех пробах.
Полученные данные указывают на более благоприятное действие «Фертилифила К» по сравнению с «Полигеном» на сперматозоиды при длительной инкубации их при высокой температуре. Результаты использования опытных образцов спермы в хозяйствах оцениваются.
При бактериологическом исследовании смывов из матки от 14 подопытных коров у одной был выделен Staph. aureus, у 11 - кишечная палочка, причем у двух животных не патогенная, а у двух других - E. Coli типов 0117 и 0103. Только у двух животных микроорганизмов не было выделено. Причем у этих животных первичная причина отсутствия оплодотворения не была связана с послеродовым воспалительным процессом в матке.
Все выделенные патогенные и недифференцированные непатогенные микроорганизмы проявляли высокую чувствительность к препарату «Фертилифил К».
При введении «Фертилифила К» животным в тело матки за 1 ч до осеменения живые сперматозоиды обнаруживались в рогах матки через 18 чу 8 из 10 животных. Подвижность их составила в среднем 19,6 %. После введения препарата в матку за 15 мин. до введения спермы живые сперматозоиды обнаружены у всех животных. Подвижных клеток в среднем было 31,5 %.
Наличие подвижных сперматозоидов спустя 18 ч после введения спермы указывает на благоприятные условия среды в матке для половых клеток. При осеменении животных интактных, сперматозоиды могут сохраняться и дольше - в течение 46-56 ч. Но обычно уже через 18 ч многие клетки оказываются поврежденными или погибшими. Сохранение подвижности многими сперматозоидами (от 10,8 % до 51,8 %) в течение этого периода указывает на возможность применения препарата для подавления действия микроорганизмов в матке за 15 мин.-1 ч до осеменения.
Оплодотворяемость у многократно повторяющих половую охоту животных, при осеменении которых был применен «Фертилифил К», показана в табл. 3.
Таблица 3. Эффективность применения «Фертилифила К» коровам в зависимости от срока введения перед осеменением и числа неплодотворных осеменений
Сельскохозяйственная организация Осеменено коров после введения «Фертилифила К» в половую охоту (по счету)
ВТО рую третью четвертую пятую-в осьмую
n % n | % n | % n 1 %
КСУП «Козенки-агро»: осеменено коров из них плодотворно Введение фертилифила Кза 15 мин до осеменения
4 7,8 24 47,0 14 27,4 9 17,6
0 0 9 37,5 3 21,4 3 33,3
РУП «УчхозБГСХА» Школа- осеменено коров ферма: из них плодотворно Введение фертилифила Кза 1 ч до осеменения
- - 9 28,1 14 43,7 9 28,1
- - 7 77,7 7 50,0 1 11,1
Паршино: осеменено коров из них плодотворно 1 0 12,5 0,0 1 0 12,5 0,0 2 1 25,0 12,5 4 1 50,0 12,5
Всего, осеменено коров 5 5,5 34 37,3 30 32,9 22 24,1
из них плодотворно 0 0,0 16 47,0 11 36,6 5 22,7
В КСУП «Козенки-агро» из 51 коров, которым за 15 мии. до осеменения вводили одну дозу препарата, оплодотворилось 15 животных (29,4 %). Лучшие результаты получены при введении препарата в третью охоту (37,5 %). В школе-ферме из 32 животных, которым препарат вводили за 1 ч до осеменения, оплодотворилось 15 животных (46,8 %). Очень высокий результат получен при применении препарата в третью охоту (77,7 %) и достаточно хороший - в четвертую охоту (50 %). На ферме «Паршино» из 8 коров оплодотворились две (25,0 %), а в последующую охоту еще 2 коровы и одна корова после четвертого осеменения. Две были выбракованы, одна осталась нестельной.
В целом из 91 коровы после введения препарата оплодотворилось 32 (35,1 %). Результат является обнадеживающим, так как в стадах, где проводились опыты, оплодотворяемость после первого осеменения была низкой. Для достижения высокой оплодотворяемости препарат следует применять при третьем или четвертом осеменении за час до его проведения.
Заключение. Разработан препарат «Фертилифила К» для включения в состав разбавителя для спермы быков и повышения оплодотворяемости коров при осеменении. В состав препарата включены линкомицин, спектиномицин, тилозин и гентамицин. Экспериментальные серии препарата выпущены по 0,375 г (одна доза) или 1,5 г (4 дозы) во флаконах емкостью 10 мл.
Разработан аналитический метод определения подлинности и массовой концентрации антибиотиков, входящих в состав «Фертилифила К». Использована жидкостная хромато-масс-спектрометрия. При исследовании образцов препарата двух экспериментальных серий точность компонентного состава и стабильности препарата подтверждалась. Образцы выдерживали экспериментальный срок хранения, что соответствует заявленному сроку хранения - 2 года.
При бактериологическом исследовании смывов из матки от 14 коров у одной был выделен Staph. aureus, у 11 - кишечная палочка. Только у двух животных в исследуемых пробах микроорганизмы отсутствовали. Все выделенные микроорганизмы были высокочувствительны к препарату.
При включении в состав разбавителя «Фертилифила К» (опыт) или «Полигена» (контроль) после оттаивания замороженных образцов спермы в них содержалось 40 % подвижных сперматозоидов, а после инкубации в течение 5 ч - соответственно 22±0,3 % и 20±0,3 % (P<0,01). В разбавленной сперме с включением «Фертилифила К» из 22 посевов в 16 роста микроорганизмов не выявлено. В остальных шести количество колоний колебалось от одной до 10 (в среднем 1,3). При использовании «Полигена» рост колоний (от 3 до 10, в среднем 5,7) отмечался во всех пробах.
После введения препарата низкоплодовитым коровам при осеменении оплодотворяемость составила 35,1 %. Высокий результат получен при применении препарата в третью охоту (77,7 %) и достаточно хороший - в четвертую охоту (50 %).
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Том 1 - Минск: «МГПТК полиграфии», 2006.
2. Медведев, Г. Ф. Влияние заболеваний метритного комплекса на частоту синдрома «повторение половой охоты» у коров / Г. Ф. Медведев, Н. И. Гавриченко // Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных: материалы межд. науч.-практ. конференции, посвященной 85-летию со дня рождения Г. А. Черемисино-ва и 50-летию создания Воронежской школы ветеринарных акушеров 18-19 октября 2012 г. - Воронеж, 2012. - 332-338.
3. Медведев, Г. Ф. Воспроизводительная функция коров и телок в зависимости от состояния половых органов и метаболического профилякрови: диссертациядоктора вет. наук: 16.00.07 / Г. Ф. Медведев. - Львов, 1989. - С. 157-159, 174.
4. Медведев, Г. Ф. Накопление в рогах матки сперматозоидов быка, их выживаемость и оплодотворяющая способность в зависимости от разбавителя спермы и времени осеменения коров в течение охоты / Г. Ф. Медведев, Е. Ю. Гумин-ская // Вестник Белорусской государственной сельскохозяйственной академии. - 2005. - № 4. - С. 66-69.
5. Солсбери, Г. У. Теория и практика искусственного осеменения коров в США / Г. У. Солсбери, Н. Л. Ван Демарк перевод с англ. Под ред. и с предисловием В. К. Милованова // М., изд-во «Колос», 1966. - С. 394.
6. Способы повышения воспроизводительной способности коров с синдромом «повторной охоты» / Н. И. Гавриченко [и др.] // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства: сб. науч. тр. / Белорус.гос. с.-х. академия; гл. ред. А.П. Курдеко. - Горки, 2009. - Вып. 12. - Ч. 2. - С. 406-414.
7. СТБ 1435-2005 Производство лекарственных средств. Надлежащая производственная практика (GMP).
8. Arthur s Veterinary Reproduction and Obstetrics. Edited David E. Noakes, Timothy J. Parkinson, Gary C.W. England. Eighth Edition. 2001. W.B. Saunders Comp. Ltd. 868 p. (Reprinted 2007), p. 461-464.
9. Bail, P. J. H. Reproduction in cattle. Third edition / P. J. H. Bail and A. R. Peters // Blackwell publishing, 2004. - P. 178, 216-217.
10. Veterinary Reproduction and Obstetrics. Ninth Edition. Edited by David E. Noakes, Timothy J. Parkinson, Gary C. W. England. 2009. W. B. Saunders Elsevier. Ltd. - P. 463-465.
11. The artificial insemination and Embryo transfer of dairy and beef cattle (including information pertaining to goats, sheep, horses, swine, and other animals). A handbook and laboratory manual for students, herd operators, and persons involved in genetic development. Jere R. Mitchell, Gordon A. Doak. Copyright 2004 by Pearson Education, 387 p.
