CC BY
153
Химия растительного сырья. 2013. №2. С. 177-182. DOI: 10.14258/jcprm.1302177
УДК 615.32:547.9+543.544
РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЙКИ
© В. А. Куркин , A.C. Акушская
Самарский государственный медицинский университет, ул. Чапаевская, 89, Самара, 443099 (Россия), e-mail: [email protected]
Разработаны методики качественного анализа и количественного определения сапонинов в настойке женьшеня (Panax ginseng C.A.Meyer) методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии при аналитической длине волны 526 нм в пересчете на гинзенозид Rg1.
Ключевые слова: женьшень настоящий, Panax ginseng C.A.Meyer, настойка, сапонины, тонкослойная хроматография, спектрофотометрия, стандартизация.
Введение
Воздушно-сухие корни женьшеня настоящего (Panax ginseng C.A.Meyer) используются в Российской Федерации в качестве общетонизирующего, стимулирующего ЦНС средства, обладающего также адаптоген-ными и иммуностимулирующими свойствами [1-4]. На фармацевтическом рынке РФ доминирующими являются дорогостоящие препараты женьшеня зарубежного производства (Гинсана, Доппельгерц женьшень, Гербион женьшень, Теравит антистресс, Геримакс женьшень) и БАДы (Геримакс энерджи, Витамакс). Отечественные препараты представлены лишь настойкой женьшеня, производителями которой являются фармацевтические фабрики (Тверская, Ивановская, Тульская), ЗАО «ВИФИТЕХ», ООО «НПП Камелия» и др. [1, 5, 6].
Согласно ГФ СССР XI издания [6], контроль качества сырья женьшеня осуществляют по пробирочным реакциям и методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (раздел «Качественные реакции»), при этом условия хроматографирования не позволяют достичь четкого разделения действующих веществ - сапонинов. В качестве количественных показателей в данной фармакопейной статье предлагается определение влажности, золы и экстрактивных веществ, что не может служить надежными, объективными и достоверными показателями качества.
В Европейской фармакопее предусмотрено определение суммы гинзенозидов Rbi и Rg1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Фармакопеей США предложено определять содержание гинзенозидов Rb1 и Rg1 отдельно друг от друга также методом ВЭЖХ [7, 8].
На наш взгляд, применение метода ВЭЖХ в анализе сырья и препаратов женьшеня не оправдано, так как компонентный состав действующих веществ (гинзенозидов) может варьировать до 11, и каждый из них вносит вклад в проявление фармакологического эффекта. Кроме того, данные методики предусматривают наличие двух стандартных образцов, что значительно увеличивает стоимость анализов.
В РФ единая нормативная документация на лекарственный препарат «Женьшеня настойка» отсутст-
—---------вует. Анализ отечественных и зарубежных литера-
Куркин Владимир Александрович - заведующий
кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами турных данных показывает, что в качестве системы
фитотерапии, доктор фармацевтических наук, растворителей для ТСХ-анализа сырья и настойки
профессор, тел.: (846)Д60-33-59, используются смеси хлороформ - меганол - вода e-mail: [email protected]
Акушская Алина Сергеевна - клинический интерн, (61 : 32 : 7), «"бутанол - этанол - 25% аммиак
тел.: (846) 260-33-59, e-mail: [email protected] (10 : 4 : 4), хлороформ - метанол - вода (13 : 7 : 2),
* Автор, с которым следует вести переписку.
н-бутанол - вода - этилацетат (4 : 2 : 1), хлороформ - метанол - вода (70 : 30 : 4). В качестве проявляющего реагента используются 20% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты, 10% раствор серной кислоты, анисовый альдегид, ванилин-фосфорный реактив [9-13].
Сапонины R R1
20S-npoTO- Н Н панаксадиол
Гинзенозид aj ß-D-Glc-1^2-ß-Glc Xyl-1^4-Ar(pyr)1^6-ß-D-Glc
Гинзенозид а2 ß-D-Glc-1^2-ß-D-Glc Xyl-1^4-Ar(fur)1^6-ß-Glc
Гинзенозид Rbj ß-D-Glc-1^2-ß-D-Glc ß-D-Glc-1^6-ß-Glc
Гинзенозид Rb2 ß-D-Glc-1^2-ß-D-Glc a-L-Ar-1^6-ß-Glc
Гинзенозид Rb3 ß-D-Glc-1^2-ß-D-Glc Xyl-1^6-ß-Glc
Гинзенозид Rbc ß-D-Glc-1^2-ß-D-Glc a-L-Ar(fur)-1^6-ß-Glc
Гинзенозид Rbd ß-D-Glc-1^2-ß-D-Glc ß-Glc
Производные 208-протопанаксадиола
Сапонины 20S-npoTonaHaKcaTpnofla
Гинзенозид Re Гинзенозид Rf Гинзенозид Rgj Гинзенозид Rg2
R R1
H H
ß-D-Glc
Н
ß-D-Glc
Н
a-L-Rha-1 ^2-ß-D-Glc ß-D-Glc-1^2-ß-Glc ß-D-Glc a-L-Rha-1 ^2-ß-D-Glc
Производные 208-протопанаксатриола Сапонины (гинзенозиды, панаксозиды) корней женьшеня настоящего
Множество подходов к анализу сырья и настойки нуждаются в критическом пересмотре в плане выбора методов стандартизации настойки женьшеня. В связи с этим целью настоящего исследования является разработка методик качественного и количественного анализа настойки женьшеня, которые могут быть рекомендованы для включения в Государственную фармакопею Российской Федерации XII издания.
Экспериментальная часть
Объектами исследования служили лекарственные препараты «Женьшеня настойка» (производители ООО «Камелия НЛП», ОАО «Тверская фармфабрика» и ОАО «Ивановская фармфабрика») и «Гинсана» (эликсир, Фарматон С.А., Швейцария).
В исследовании использовали методы ТСХ, адсорбционной жидкостной колоночной хроматографии и спектроскопии в УФ- и видимой области спектра. В методе ТСХ разделение проводили на пластинках «Silufol UV 254» и «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ». Спектры регистрировали с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena) в диапазоне длин волн 190-700 нм.
На предварительном этапе было проведено исследование по выделению веществ сапониновой природы из настойки корней женьшеня настоящего методом препаративной колоночной хроматографии на силикагеле L 40/100 и рехроматографии целевых фракций на полиамиде («Woelm»). Получено вещество, которое по физико-химическим константам, данным УФ-, ЯМР- и масс-спектрам охарактеризовано как гинзенозид Rg1 (6,20-бис-ф-Э-глюкопиранозил)-(3р,6а,12р,20,$)-3,6,12,20-тетрагидроксидаммар-24-ен).
С целью определения оптимальной хроматографической системы для разделения сапонинов жень -шеня методом ТСХ были апробированы несколько систем растворителей: хлороформ - метанол - вода в соотношениях 70 : 30 : 4 (в соответствии с Немецкой Фармакопеей), 61 : 32 : 7 (в соответствии с ГФ СССР XI издания), 13 : 7 : 2 (в соответствии с Фармакопеей США), 26 : 14 : 3 (универсальная гликозидная система растворителей) и хлороформ - этанол - вода в соотношении 26 : 16 : 3. Детекцию веществ осуществляли в видимой области спектра и в УФ-свете (254 и 366 нм). После опрыскивания хроматограммы 20% спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК) и нагревания ее на плитке 3 мин при 100105 °С на хроматограмме извлечения из корней женьшеня и настойки обнаруживаются пятна красно-фиолетового цвета с диапазоном Rf от 0,1 до 0,45 (гликозиды панаксозидов) и пятно бурого цвета с Rf 0,8 (агликон) (рис. 1).
Рис. 1. ТСХ-анализ: система хлороформ - метанол - вода (26 : 14 : 3), пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ». Обозначения: 1 - извлечение из корней женьшеня на 70% этиловом спирте; 2 - настойка женьшеня; 3 - рабочий стандартный образец (PCO) гинзенозида Rgi
В результате проведенных исследований в качестве оптимальных для хроматографического разделения сапонинов при анализе настойки нами рекомендованы пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» и система растворителей «хлороформ - метанол - вода» (26 : 14 : 3). В соответствии с этим разработана методика качественного анализа сапонинов в настойке женьшеня.
Методика качественного анализа сапонинов в настойке женьшеня. На линию старта пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» наносили микропипеткой 0,02 мл извлечения и 0,05 мл раствора А рабочего стандартного образца (PCO) гинзенозида Rg1 в виде пятен диаметром 5 мм. Пластинку с нанесенной пробой помещают в вертикальную камеру, которую предварительно насыщают не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ - метанол - вода (26 : 14 : 3), и хроматографируют восходящим способом.
Когда фронт растворителей проходит около 9 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин. Хроматограмму опрыскивают раствором фосфорновольфрамовой кислоты и нагревают на плитке 3 мин при 100-105 °С. На хроматограмме обнаруживается не менее 6 пурпурно-красных пятен с Rf от 0,1 до 0,45; при этом доминирующим является пятно на уровне пятна PCO гинзенозида Rg1 с величиной Rf около 0,3. Допускается наличие других пятен.
Примечание 1: подготовка пластинок. Пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» (ТУ 26-11-17-89) разрезают поперек линий накатки соответственно на две части размером 10x5 см и перед использованием активируют в сушильном шкафу при 110 °С в течение 1 ч.
Примечание 2: приготовление раствора А PCO гинзенозида Rg1 - см. примечание 1 в «Методике количественного определения сапонинов в настойке женьшеня».
С целью разработки методики количественного определения суммы сапонинов нами проведено изучение электронных спектров. Исследование показало, что кривая поглощения настойки (рис. 2) имеет лишь один максимум (при длине волны 268+2 нм). Спиртовой раствор гинзенозида Rg1 не имеет максимумов поглощения ни в УФ-, ни в видимой области спектра, поэтому для его идентификации предложено проводить реакцию с 70% раствором серной кислоты (максимумы поглощения при длинах волн 280+2, 400+2 и 526+2 нм). Аналогичную реакцию необходимо проводить с настойкой женьшеня (максимумы поглощения при длинах волн 320+2, 390+2 и 526+2 нм), при этом содержащуюся сумму сапонинов предварительно очищать на полиамиде от сопутствующих веществ, также дающих положительную реакцию с серной кислотой (рис. 3).
Таким образом, длинноволновый максимум 526 нм можно принять за аналитическую длину волны, а стандартным образцом может служить сапонин - гинзенозида Rgl. В случае отсутствия стандарта в расчетной
формуле может быть использовано теоретическое значение удельного показателя поглощения (£1% ) - 25.
Электронный спектр поглощения настойки до (рис. 2) и после (рис. 3) очистки ее на полиамиде может являться качественной характеристикой препарата. Кроме того, данные показателя поглощения комплекса очищенной суммы сапонинов настойки с серной кислотой при 526 нм возможно использовать для количественного определения суммы действующих веществ.
[A] 2,5 2,25 2
1,75 1,5 1,25 1
0,75 0,5 0,25 0
[А] 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 О
\l
2 \
200
250 300 350 400 450 500 550 600
650 700 [пш]
Рис. 2. Электронный спектр раствора настойки из корней женьшеня
Рис. 3. Электронные спектры окрашенного продукта взаимодействия водно-спиртового извлечения из корня женьшеня, очищенного на полиамиде, с 70% серной кислотой (1) и продукта реакции гинзенозида Rb1 с 70% серной кислотой (2)
Методика количественного определения суммы сапонинов в настойке женьшеня. Испытуемый раствор А готовят следующим образом: 1 мл настойки упаривают на водяной бане досуха в фарфоровой чашке. После охлаждения сухой остаток растворяют в 2-3 мл воды, количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор А).
1 мл испытуемого раствора А вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 526 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт.
Примечание 1: приготовление раствора PCO гинзенозида Rg1. Около 0,03 г (точная навеска) гинзенозида Rgi помещают в мерную колбу на 25 мли доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 5 мл 70% серной кислоты и нагревают в течение 10 мин на кипящей водяной бане (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм. Раствором сравнения служит 95% этиловый спирт.
Примечание 2: приготовление раствора 70% серной кислоты. К 45 мл воды осторожно, при перемешивании, добавляют 60 мл серной кислоты концентрированной (ГФ XII, с. 368).
Содержание суммы сапонинов (X) в пересчете на гинзенозид Rg1 в процентах вычисляют по формуле:
D х m0 х 10 х 6 х1х100
X —-,
D0 х1х1х25 х 6
где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность PCO гинзенозида Rg1; m0 -масса PCO гинзенозида Rg1.
При отсутствии стандартного образца гинзенозида целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения - 25:
„ _ Б х 10 х 6
X —-,
1х1X25
где Б - оптическая плотность испытуемого раствора; 25 - удельный показатель поглощения () продукта взаимодействия гинзенозида с раствором серной кислоты при 526 нм.
По разработанной нами методике определено содержание суммы действующих веществ в некоторых препаратах (табл. 2).
Таблица 2. Количественное определение суммы сапонинов в препаратахженьшеня
Название лекарст- Производитель Содержание суммы сапонинов в пересчете
венного препарата на гинзенозид Rgb %
Настойка женьшеня ООО «Камелия НПП», РФ 0,50 ± 0,08
Настойка женьшеня ОАО «Тверская фармфабрика», РФ 0,61± 0,06
Настойка женьшеня ОАО «Ивановская фармфабрика», РФ 0,57± 0,05
Гинсана (эликсир) Фарматон С.А., Швейцария 0,42± 0,08
Выводы
1. Из корней женьшеня настоящего выделено индивидуальное вещество группы сапонинов, идентифицированное на основании данных УФ- и ЯМР-спектров как гинзенозид Rg1.
2. Для качественного анализа настойки женьшеня предложен метод тонкослойной хроматографии в системе «хлороформ - метанол - вода» (26 : 14 : 3) и спектроскопии нативной настойки в УФ области (максимум поглощения при 268±2) и очищенной на полиамиде суммы сапонинов после проведения цветной реакции с 70% серной кислотой (максимумы поглощения при 280+2, 400+2 и 526+2 нм).
3. Разработана методика количественного определения сапонинов в настойке женьшеня методом прямой спектрофотометрии в пересчете на гинзенозид Rg1 при аналитической длине волны 526 нм. Содержание суммы сапонинов в образцах препаратов данного растения составляет 0,42-0,61%.
Список литературы
1. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. 2011. URL: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx.
2. Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов.). 2-е изд., пере-раб. и доп. Самара, 2007. 1239 с.
3. Куркин В.А. Основы фитотерапии: учеб. пособие для студентов фармацевтических вузов. Самара, 2009. 963 с.
4. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. М., 2008. 1206 с.
5. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: справочник. М., 2011. 1728 с.
6. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2: Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М., 1990. 400 с.
7. European Pharmacopoeia. 6-th Ed. Rockville: United States Pharmacopoeial Convention. Inc., 2008. Pp. 738-739.
8. Фармакопея США: USP 29. Национальный формуляр: NF 24: в 2 т. [пер. с англ.]. М., 2009. Т. 2. С. 2226.
9. ФС 42-10675-00. Настойка женьшеня / Фармакопейный государственныйкомитет. Введ 19.01.2000. М., 2000. 5 с.
10. Глебко Л.И., Красовская Н.П., Покушалова Т.В., Ильченко Г.Я., Будина ТА. Стандартизация качества женьшеня корней и настойки по содержанию суммы гинзенозидов // Химико-фармацевтический журнал. 2004. №4. С. 20-23.
11. Japanese Pharmocopoeia. JP XIV. 2001. Pp. 927-930.
12. German Homoeopathic Pharmacopoeia. Stuttgart, 1993. Pp. 303-306.
13. Wagner H., Blads S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. Berlin; Heidelberg; New York, 1996. 348 p.
Поступило вредакцию 7 февраля 2012 г.
182
B.A. KYPKHH, A.C. AKymcKAH
Kurkin V.A.*, Akushskaya A.S. DEVELOPMENT OF METHODS OF QUALITY CONTROL OF GINSENG TINCTURA
Samara State Medical University, ul. Chapaevskaia, 89, Samara, 443099 (Russia), e-mail: [email protected]
There were developed the techniques of qualitative and quantitative analysis of ginseng tinctures (Panax ginseng C.A. Meyer).
Thin-layer chromatography (in the solvent system chloroform - methanol - water, 26 : 14 : 3; detection in the visible range after reaction with phosphowolframic acid) and UV/Visible spectroscopy of native tincture (maximum of absorption at 268±2 nm) and total saponins, purified on polyamide and reacted with 70% sulphuric acid (maximum of absorption at 280±2 nm, 400+2 nm and 526+2 nm).
The method of quantitative determination of total saponins in tinctura of ginseng by means of direct spectrophotometry (analytical wave-length at 526 nm) was developed. The contents of the total saponins are varied with 0,42% to 0,61% (calculated on ginsenoside Rgi).
Keywords: ginseng, Panax ginseng C.A. Meyer, tincture, saponins, thin-layer chromatography, spectrophotometry, standardization.
References
1. Gosudarstvennyi reestr lekarstvennykh sredstv [State register of medicines]. 2011. URL: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx. (in Russ.).
2. Kurkin V.A. Farmakognoziia: Uchebnik dlia studentov farmatsevticheskikh vuzov (fakul'tetov). [Pharmacognosy: A textbook for students of pharmaceutical schools (faculties)]. Samara, 2007, 1239 p. (in Russ.).
3. Kurkin V.A. Osnovy fitoterapii: Uchebnoe posobie dlia studentov farmatsevticheskikh vuzov. [Fundamentals of Herbal Medicine: Textbook for students of pharmaceutical universities]. Samara, 2009, 963 p. (in Russ.).
4. Mashkovskii M.D. Lekarstvennye sredstva: v 2 t. [Medications: in 2 vol]. Moscow, 2008, 1206 p. (in Russ.).
5. Spravochnik Vidal'. Lekarstvennye preparaty v Rossii: Spravochnik. [On the main page. Medications in Russia: A Handbook]. Moscow, 2011, 1728 p. (in Russ.).
6. Gosudarstvennaia farmakopeia SSSR. Vyp. 2: Obshchie metody analiza. Lekarstvennoe rastitel'noe syr'e. 11-e izd. [State Pharmacopoeia of the USSR, Vol. 2. Common methods of analysis. Herbal drugs. 11th ed.]. Moscow, 1990, 400 p. (in Russ.).
7. European Pharmacopoeia. 6-th Ed. Rockville: United States Pharmacopoeial Convention. Inc., 2008, pp. 738-739.
8. Farmakopeia SShA: USP 29. Natsional'nyi formuliar: NF 24: v 2 t. [United States Pharmacopoeia: USP 29. National Formulary: NF 24: in 2 vol.]. Moscow, 2009, vol. 2, p. 2226. (in Russ.).
9. FS 42-10675-00. Nastoika zhen'shenia/Farmakopeinyi gosudarstvennyi komitet. [FA 42-10675-00. Ginseng tincture / State Pharmacopoeia Committee.]. Moscow, 2000, 5 p. (in Russ.).
10. Glebko L.I., Krasovskaia N.P., Pokushalova T.V., Il'chenko G.Ia., Budina T.A. Khimiko-farmatsevticheskii zhurnal, 2004, no. 4, pp. 20-23. (in Russ.).
11. Japanese Pharmocopoeia. JP XIV. 2001, pp. 927-930.
12. German Homoeopathic Pharmacopoeia, Stuttgart, 1993, pp. 303-306.
13. Wagner H., Blads S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. Berlin; Heidelberg; New York, 1996, 348 p.
Received February 7, 2012
* Corresponding author.
