CC BY
12
УДК 577.29:615
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДСТВЕННЫХ ПРИМЕСЕЙ В СУБСТАНЦИИ НОВОГО СОЕДИНЕНИЯ С АНТИАРИТМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ АЛМ-802
Л.Н. Грушевская, В.В. Аджиенко, М.С. Сергеева, Л.М. Гаевая, М.Е. Дуденкова, Е.Д. Денисенко, Н.И. Авдюнина, С.В. Минаев, Г.В. Мокров
ФГБНУ «Национальный научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»,
опытно-технологический отдел
Разработана методика определения родственных примесей в субстанции нового соединения с антиаритмической активностью - АЛМ-802. Разделение АЛМ-802 и примесей проведено методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке BDS Hypersil 150 х 4,6 мм, 5 мкм (Thermo Scientific) в градиентном режиме элюирования. В качестве подвижной фазы использованы смеси 0,02 М раствора калия дигидрофосфата, метанола и ацетонитрила. Детектор спектрофотометрический, аналитическая длина волны 205 нм. В экспериментальном образце субстанции АЛМ-802 обнаружен ряд неидентифицированных примесей, продукта синтеза, 2,3,4-триметоксибензальдегида, обнаружено не было.
Ключевые слова: АЛМ-802, родственные примеси, высокоэффективная жидкостная хроматография.
DOI 10.19163/1994-9480-2019-4(72)-77-80
DEVELOPMENT OF THE TECHNIQUE FOR DETERMINATION OF IMPURITIES IN SUBSTANCE OF THE NEW COMPOUND WITH AN ANTIARRHYTHMIC ACTIVITY - ALM-802
L.N. Grushevskaja, V.V. Adzhienko, M.S. Sergeeva, L.M. Gaevaja, M.E. Dudenkova, E.D. Denisenko, N.I. Avdjunina, S.V. Minaev, G.V. Mokrov
FSBSI «National Research Institute of Pharmacology named after V. V. Zakusov», experimental-technological department
A technique for determining related impurities in the substance of a new compound with antiarrhythmic activity -ALM-802 has been developed. Separation of ALM-802 and impurities was carried out by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) on a BDS Hypersil 150 x 4.6 mm, 5 jm column (Thermo Scientific) in gradient elution mode. Mixtures of a 0,02 M potassium dihydrogen phosphate solution, methanol and acetonitrile were used as the mobile phase. Spectrophotometric detector, analytical wavelength 205 nm. A number of unidentified impurities were found in the experimental sample of ALM-802, the synthesis product, 2,3,4-trimethoxybenzaldehyde, was not found. Key words: ALM-802, related impurities, high-performance liquid chromatography.
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в результате исследований, направленных на поиск и создание новых лекарственных средств с антиаритмической активностью, было получено новое соединение АЛМ-802, представляющее собой тригидрохлорид N^(2,3,4-триметоксибензил)-^-{2-[(2,3,4-триметоксибензил) амино]этил}-1,2-этандиамина (рис. 1).
В исследованиях на лабораторных животных (крысах) новое соединение проявило выраженную антиаритмическую и антиишемическую активность, что свидетельствовало о перспективности дальнейшей разработки лекарственного средства на его основе [1, 2, 5].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Разработка методики определения родственных примесей в субстанции АЛМ-802, проведенной в рамках фармацевтической разработки нового лекарственного препарата.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проведены на экспериментальном образце субстанции АЛМ-802, синтезированном в отделе химии лекарственных средств ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».
н
OCH3 OCH3
С24Н4оС1з^Об х Н2О
Рис. 1. Тригидрохлорид М1-(2Д4-триметоксибензил)-1\12-{2-[(2,3,4-триметоксибензил)амино]этил}-1,2-этандиамина (АЛМ-802)
В нашем распоряжении также имелся образец исходного продукта синтеза АЛМ-802 - 2,3,4-триметоксибензальдегид ^дта^пс^ 152099).
Разработка проведена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе Beckman System Gold со спектрофотометрическим детектором. Ячейка детектора стандартная, с длиной оптического пути 10 мм, объем петли дозатора 20 мкл.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
УФ-спектр АЛМ-802 в воде очищенной в диапазоне длин волн от 200 до 350 нм имеет три максимума поглощения: (269 ± 2); (267 ± 2) и (205 ± 2) нм, наиболее выраженным из которых является максимум при 205 нм. УФ-спектр 2,3,4-триметокси-бензальдегида в том же диапазоне длин волн имеет максимумы при (284 ± 2); (232 ± 2) и (209 ± 2) нм.
Поскольку продукты деградации АЛМ-802 с высокой вероятностью также будут поглощать электромагнитное излучение в области 200-220 нм, длина волны 205 нм была выбрана нами в качестве аналитической.
Хроматографическое разделение было решено проводить на сорбенте С18, в качестве подвижных фаз были использованы смеси ацетони-трила, метанола и растворов калия гидрофосфата и калия дигидрофосфата в воде.
Оптимальных результатов удалось добиться с применением колонки BDS Hypersil 150x4,6 мм, 5 мкм (Thermo Scientific) в градиентном режиме хроматографирования.
Подвижная фаза А (ПФ А) представляла собой смесь 0,02М раствора калия дигидрофосфата (рН 2,8, доведен до нужного значения фосфорной кислотой концентрированной), ацетонитрила и метанола в соотношении 200:25:25 соответственно, по объему. Подвижная фаза Б (ПФ Б) состояла из 0,02М с рН 2,8, ацетонитрила и метанола в объемном соотношении 100:50:50 соответственно. Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин. Профиль градиента представлен в табл. 1.
Таблица 1
Профиль градиентного элюирования
при определении родственных примесей в субстанции АЛМ-802
бензальдегида была подтверждена в диапазоне концентраций от 0,001 до 0,1 мг/мл (рис. 2).
Время, мин ПФ А, % ПФ Б, %
0-1 100 0
1-20 От 100 до 25 От 0 до 85
20-21 25 85
21-26 От 25 до 100 От 85 до 0
26-30 100 0
В указанных условиях время удерживания АЛМ-802 составляло около 8 мин, а время удерживания 2,3,4-триметоксибензальдегида - около 16 мин (относительное время удерживания 1,96).
Линейная зависимость площади пика от концентрации растворов АЛМ-802 и 2,3,4-триметокси-
Рис. 2. Зависимость площади пика от концентрации растворов АЛМ-802 и 2,3,4-триметоксибензальдегида (ТМБА)
Пределы обнаружения и количественного определения были определены экспериментально, исходя из соотношения сигнал/шум, и составили для АЛМ-802 - 0,003 мкг и 0,01 мкг соответственно и для 2,3,4-триметоксибензальдегида -0,006 мкг и 0,02 мкг соответственно.
Из полученных данных видно, что при концентрации испытуемого раствора субстанции АЛМ-802 1 мг/мл примесь 2,3,4-триметоксибензальдегида можно будет обнаружить в содержании 0,05 % и даже несколько менее.
Хроматограмма испытуемого раствора субстанции АЛМ-802 (концентрация 1 мг/мл) представлена на рис. 3.
2 4 6 S 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 м
Рис. 3. Хроматограмма раствора АЛМ-802 (1 мг/мл)
Примеси 2,3,4-триметоксибензальдегида в испытуемом растворе обнаружено не было, однако в нем присутствовали неидентифицированные примеси.
Нами были предприняты попытки оптимизации хроматографических условий с целью уменьшения времени анализа, однако сокращение времени градиента приводило к ухудшению разрешения неидентифицированных примесей между собой, а все опробованные изменения состава подвижных
фаз приводили к ухудшению разрешения пиков неидентифицированных примесей как между собой, так и с пиком АЛМ-802.
В результате проведенных исследований было решено использовать для определения примесей в субстанции АЛМ-802 указанные выше хромато-графические условия.
В рамках валидации разработанной методики мы провели оценку правильности и прецизионности определения примеси 2,3,4-триметоксибензальде-гида в разработанных условиях на модельных смесях с субстанцей АЛМ-802 в содержании 0,05; 0,1 и 0,2 % от концентрации испытуемого раствора АЛМ-802.
Для приготовления испытуемых растворов предварительно готовили растворы 2,3,4-три-метоксибензальдегида в подвижной фазе А с концентрациями 0,005; 0,01 и 0,02 мг/мл. Затем в три мерные колбы вместимостью 10 мл помещали 10 мг субстанции АЛМ-802, приливали по 1 мл полученных растворов 2,3,4-триметоксибензальдегида, прибавляли 5 мл подвижной фазы А, встряхивали содержимое колбы до растворения и доводили объем раствора в колбе до метки подвижной фазой А.
Для расчета содержания 2,3,4-триметокси-бензальдегида в испытуемых растворах готовили раствор для определения поправочного коэффициента с концентрациями АЛМ-802 и 2,3,4-три-метоксибензальдегида 0,01 мг/мл. Рассчитанный коэффициент составлял 2,25.
Результаты изучения правильности и прецизионности методики представлены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты определение содержания примеси 2,3,4-триметоксибензальдегида в модельных смесях
Таким образом, было показано, что доверительный интервал среднего значения включает 100 % и значения вычисленного коэффициента Стьюдента (/выч.) не превышают табличные (/табл), а следовательно, полученные результаты не отягощены
систематической ошибкой. Разработанная методика правильна [3, 4]. Величина относительной ошибки единичного определения не превышает 6 %, а также значение коэффициента вариации RSD не превышает 5 %, что свидетельствует об удовлетворительной сходимости результатов.
Для оценки пригодности хроматографической системы было предложено готовить два раствора: раствор для проверки чувствительности методики (раствор АЛМ-802 с концентрацией 0,0005 мг/мл) и раствор для проверки разделительной способности системы (раствор АЛМ-802 и 2,3,4-три-метоксибензальдегида с концентрациями каждого из соединений 0,01 мг/мл).
Высота пика АЛМ-802 на хроматограммах раствора для проверки чувствительности хромато-графической системы должна превышать расчетную величину шума базовой линии (сигнал/шум) не менее чем в 3 раза.
Результаты хроматографирования раствора для проверки разделительной способности системы представлены в табл. 3.
Таблица 3
Результаты определения и критерии пригодности хроматографической системы
Результаты определения параметров пригодности хроматографической системы
Число теоретических тарелок для пика АЛМ-802, N Коэффициент ас и мм етрии по п ику АЛМ-802, ЛБ RSD площадей пиков АЛМ-802 Rs пиков АЛМ-802 и 2,3,4- триметокси-бензальдегида
24183±442 1,85 ± 0,07 1,41 ± 0,08 % 38,5 ± 0,5
Критерии приемлемости
Не менее 23000 Не более 2,0 Не более 2 % Н е менее 37,0
В результате проведенных испытаний были установлены следующие критерии пригодности хроматографической системы: число теоретических тарелок - не менее 23000; коэффициент асимметрии пика АЛМ-802 - не более 2; относительное стандартное отклонение результатов отдельных измерений площадей пика АЛМ-802 - не более 2 %, Rs пиков АЛМ-802 и 2,3,4-триметоксибензальдегида -не менее 37,0.
С помощью разработанной методики было определено содержание родственных примесей в экспериментальном образце субстанции АЛМ-802. Как уже было указано, примеси 2,3,4-триметокси-бензальдегида в субстанции обнаружено не было, однако в ней присутствовали неидентифицирован-ные примеси: примесь со временем удерживания о коло 3 мин (/¿т. 0,43) в содержании 3,02 %, а также четыре других неидентифицированных примеси в содержании 0,04 % (/отн 0,50), 0,07 % (/отн 0,65), 006 % (/отн. 1,50) и 0,06 % (/отн. 1,55).
Содержание в % от концентрации исп. раствора Взято*, Найдено, Абсолютная ошибка (А), (т2 - тЛ) Относительная ошибка Найдено, % Метрологические
мг (т0 мг (т2) (б) А х 100/т1 характеристики
0,5 0,0515 0,0509 - 0,0006 1,17 98,83 Хср =
0,5 0,0495 0,0507 +0,0012 2,42 102,42 99,93
0,5 0,0505 0,0509 +0,0004 0,79 100,79 Б = 2,85
0,2 0,0206 0,0201 -0,0005 2,43 97,57 RSD = 2,85 % ДХ = 2,24 £ = 2,24% /выч. = 0,07
0,2 0,0198 0,0196 -0,0002 1,01 98,99
0,2 0,0202 0,0208 +0,0006 2,97 102,97
0,1 0,0103 0,0107 +0,0004 3,88 103,88
0,1 0,0099 0,0094 -0,0005 5,05 94,95 ¿табл. =
0,1 0,0101 0,0100 -0,0001 0,99 99,01 2,36
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований нами была разработана методика определения содержания родственных примесей в субстанции АЛМ-802 с помощью ВЭЖХ.
Разработанная методика валидирована в соответствии с требованиями ГФ РФ XIV издания и в дальнейшем может быть использована для определения содержания родственных примесей в фармацевтической субстанции АЛМ-802.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барчуков В.В., Цорин И.Б., Вититнова М.Б. и др. Изучение противоишемической активности представителя ряда а,и>-диарилметильных производных бис-(ш-аминоалкил)аминов - соединения АЛМ-802 на модели острой эндокардиальной ишемии миокарда у крыс с эндо-телиальной дисфункцией // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2018. - Т. 81 (1). - С. 23.
2. Мокров Г.В., Лихошерстов А.М., Барчуков В.В. и др. Исследование влияния положения метокси-группы на кар-диотропную активность соединения АЛМ-802 // Фармако-кинетика и фармакодинамика. - 2019. - № 1. - С. 6-11.
3. 0ФС.1.1.0013.15. Статистическая обработка результатов химического эксперимента // Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания. -2018. - Т. 1. - С. 289-318.
4. 0ФС.1.1.0012.15. Валидация аналитических методик // Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания. - 2018. - Т. 1. - С. 276-288.
5. Середенин С.Б., Мокров Г.В., Крыжановский С.А. и др. Бис(метоксибензиламиноалкил)амины, обладающие кардиотропной активностью. Патент РФ 2624438. -Бюл. изобрет. № 19. - 2017.
REFERENCES
1. Barchukov V.V., Corin I.B., Vititnova M.B. i dr. Izuchenie protivoishemicheskoj aktivnosti predstavitelja rjada a,u>-diarilmetN'nyh proizvodnyh bis-(u>-aminoalkil)aminov -soedinenija alm-802 na modeli ostroj jendokardial'noj ishemii miokarda u krys s jendotelial'noj disfunkciej [Study of the anti-ischemic activity of a representative of a series of a , u>-diarylmethyl derivatives of bis (w-aminoalkyl) amines -ALM-802 compounds in a model of acute endocardial myocardial ischemia in rats with endothelial dysfunction]. Jeksperimental'naja i klinicheskaja farmakologija [Experimental and Clinical Pharmacology], 2018, Vol. 81 (1), pp. 23. (In Russ.; abstr. in Engl.).
2. Mokrov G.V., Lihosherstov A.M., Barchukov V.V. i dr. Issledovanie vlijanija polozhenija metoksi-gruppy na kardio-tropnuju aktivnost' soedinenija ALM-802 [Investigation of t h e influence of the position of the methoxy group on the cardiotropic activity of the ALM-802 compound]. Farmakokinetika i farmakodinamika [Pharmacokinetics and Pharmacodynamics], 2019, no. 1, pp. 6-11. (In Russ.; abstr. in Engl.).
3. 0FS.1.1.0013.15. Statisticheskaja obrabotka rezul'ta-tov himicheskogo jeksperimenta [Statistical processing of the results of a chemical experiment]. In Gosudarstvennaja Farmakopeja Rossijskoj Federacii XIV izdanija [State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIV edition]. 2018. Vol. 1. P. 289-318.
4. 0FS.1.1.0012.15. Validacija analiticheskih metodik [Validation of analytical methods]. In Gosudarstvennaja Farmakopeja Rossijskoj Federacii XIV izdanija [State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIV edition]. 2018. Vol. 1. P. 276-288.
5. Seredenin S.B., Mokrov G.V., Kryzhanovskij S.A. i dr. Bis(metoksibenzilaminoalkil)aminy, obladajushhie kardiotropnoj aktivnost'ju [Bis (methoxybenzylaminoalkyl) amines with cardiotropic activity]. Patent RF 2624438. Bjul. izobret. № 19. 2017.
Контактная информация Гаевая Людмила Михайловна - д. фарм. н., ведущий научный сотрудник химико-технологической лаборатории опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», e-mail: otopharm@mail.ru
