CC BY
634
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Для корреспонденции
Боков Дмитрий Олегович - лаборант-исследователь лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», ассистент кафедры фармакогнозии ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-57-36 E-mail: [email protected]
Боков Д.О.1, 2, Хромченкова Е.П.1, Сокуренко М.С.1, 2, Васильев А.В.3, Бессонов В.В.1
Разработка методики определения инулина в цикории растворимом натуральном после ферментативного гидролиза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
1 ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва
2 ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
3 ООО «Славкофе», городской округ Щербинка по г. Москве
1 Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Foоd Safety, Moscow
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University
3 «Slav^ffee», Shcherbinka City District, Moscow
Разработана высокоспецифичная методика оценки содержания инулина в растворимом натуральном цикории, которая базируется на определении фруктозы после ферментативного гидролиза амилоглюкозидазой и инулина-зой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с рефрактометрическим детектированием. Определение содержания инулина проводили с использованием системы для высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent 1260 Series с рефрактометрическим детектором на колонке Waters Sugar-Pak 10 мкм х 6,5 мм х 300 мм: элюирование в изократическом режиме (подвижная фаза - вода) со скоростью 0,5 см3/мин, температура колонки -80 °С, объем вводимой пробы - 10 мкл. Содержание инулина в образцах растворимого натурального цикория колеблется в пределах от 4 до 25%. Показано, что разработанная методика может использоваться для контроля качества продуктов, используемых для приготовления напитков из растворимого натурального цикория.
Ключевые слова: инулин, фруктоза, инулиназа, высокоэффективная жидкостная хроматография, цикорий растворимый натуральный
Для цитирования: Боков Д О., Хромченкова Е.П., Сокуренко М.С., Васильев А.В., Бессонов В.В. Разработка методики определения инулина в цикории растворимом натуральном после ферментативного гидролиза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 5. С. 50-55.
Статья поступила в редакцию 26.06.2017. Принята в печать 08.09.2017.
For citation: Bokov D.O., Khromchenkova E.P., Sokurenko M.S., Vasilev A.V., Bessonov V.V. Development of a technique for the determination of inulin in natural instant chicory after enzymatic hydrolysis by high-performance liquid chromatography. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (5): 50-5. (in Russian)
Received 26.06.2017. Accepted for publication 08.09.2017.
Development of a technique for the determination of inulin in natural instant chicory after enzymatic hydrolysis by high-performance liquid chromatography
Bokov D.O.1- Khromchenkova E.P.i, Sokurenko M.S.1- Vasilev A.V.3, Bessonov V.V.1
A highly specific technique for estimating inulin content in natural instant chicory based on the determination of fructose after enzymatic hydrolysis with amyloglucosidase and inulinase by high-performance liquid chromatography with refractometric detection has been developed. Determination of inulin content was carried out by a system for high performance liquid chromatography Agilent 1260 Series with a refractometer, Waters Sugar-Pak column of 10 pm x 6.5 mm x 300 mm: isocratic elution mode (mobile phase - water) with a flow rate of 0.5 ml/min, column temperature - 80 °C, injected sample volume -10 pl. Inulin content in samples of soluble natural chicory ranges from 4 to 25%. It has been shown that the developed technique can be applied in the quality control of products used for the preparation of soluble natural chicory beverages.
Keywords: inulin, fructose, inulinase, high-performance liquid chromatography, natural instant chicory
Цикорий растворимый натуральный (ЦРН) - это высушенный водный экстракт измельченных обжаренных корней цикория обыкновенного (Cichorium intybus L.) семейства Астровые (Asteraceae Bercht. & J. Presl), который предназначен для быстрого приготовления холодных и горячих напитков, пригодных для непосредственного употребления в пищу как взрослыми, так и детьми (старше 3 лет) [1-3].
В настоящее время для контроля качества ЦРН применяется ГОСТ Р 55512-2013 «Цикорий натуральный растворимый. Технические условия» [1], в котором указаны требования по органолептическим, физико-химическим, микробиологическим показателям, по содержанию токсичных элементов и содержанию углеводов. Согласно стандарту, необходимо определять массовую долю свободных углеводов [фруктозы (5,0-20,0%), глюкозы (2,0-5,0%) и сахарозы (2,0-5,0%)], связанных углеводов [глюкозы (5,0-10,0%) и фруктозы (40,0-60,0%)], содержание которых устанавливают после кислотного гидролиза, а также инулина (не менее 30%) [1].
Наибольший интерес представляет показатель, регламентирующий содержание инулина в конечном продукте. Инулин - это полифруктозан, состоящий из 30-35 остатков фруктозы в фуранозной форме; при гидролизе под действием фермента инулиназы образует D-фруктозу и незначительное количество глюкозы [3]. Инулин является одним из основных компонентов ЦРН, относится к группе растворимых пищевых волокон и применяется в качестве пребиотика, входит в состав функциональных пищевых продуктов [3-5], используется в комплексной терапии синдрома раздраженного кишечника [6], сахарного диабета 2 типа [7] и др. Инулин применяется также в качестве агента, препятствующего окислению липидного компонента при производстве мучных кондитерских изделий [8]. Адекватный уровень потребления инулина (полифруктозаны и др.) [9] составляет 5-10 г/сут, в случае превышения (более 20 г/сут) возможно развитие нежелательных побочных эффектов со стороны желудочно-кишечного тракта [10].
Следует отметить, что метод определения инулина, изложенный в ГОСТ Р 55512-2013, отличается низкой специфичностью (кислотному гидролизу подвергаются все полисахариды), а также, как показала практика, невысокой межлабораторной воспроизводи-
мостью. Существуют методы оценки содержания инулина в растительном сырье (лопуха большого, подсолнечника однолетнего, девясила высокого) [11-13], основанные на прямом спектрофотометрическом определении по-лифруктозанов после их кислотной трансформации в окрашенные продукты [5-гидроксиметилфурфурол (HMF)]. Окрашивание обусловлено способностью углеводов (сахарозы, фруктозы) при нагревании с концентрированными кислотами к образованию продуктов, имеющих поглощение в области 200-380 нм [14]. Эти неспецифичные косвенные методы также дают завышенные результаты и не могут служить для точной количественной оценки. Наиболее перспективными являются методы, основанные на ферментативном гидролизе инулина, с последующим определением высвободившихся моносахаров [15].
Цель работы - разработка высокоспецифичной методики определения содержания инулина в растворимом натуральном цикории с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с рефрактометрическим детектированием (ВЭЖХ-РД) для определения моносахаров после ферментативного гидролиза полифруктозана.
Материал и методы
Анализ проводили с использованием хроматогра-фической системы, состоящей из прибора Agilent 1260 Series («Agilent Technologies», США), насоса (обеспечивает подачу 4 растворителей одновременно), устройства для автоматического ввода проб (автосемп-лера) с термостатом, термостата хроматографических колонок, рефрактометрического детектора Agilent 1260 Infinity Refractive Index Detector (RID) под управлением программного обеспечения для обработки хроматогра-фических данных ChemStation (ver. B.01); неподвижная фаза - колонка хроматографическая для ВЭЖХ Waters Sugar-Pak («Waters», США), длиной 300 мм и внутренним диаметром 6,5 мм, наполненная микрокристаллическим катионообменным гелем в кальциевой форме с размером пор 10 мкм. Условия проведения хроматографических измерений: элюент - вода по ГОСТ ISO 3696, 2-й степени чистоты; режим элюирования - изократи-
ческий; температура колонки - 80±5 °С; детектирование рефрактометрическое; скорость потока подачи элю-ента - 0,5 см3/мин; объем пробы - 10 мкл.
Для ферментативного гидролиза применяли амило-глюкозидазу («Sigma-Aldrich», США), инулиназу («Sigma-Aldrich», США). В качестве стандартных образцов использовали фруктозу (>99,0%, «Sigma-Aldrich», США) и инулин (>95,0%, «Sigma-Aldrich», США).
В качестве анализируемых проб выступали промышленные образцы цикория натурального растворимого, реализуемые в магазинах и торговых сетях Москвы и Московской области, российских и зарубежных фирм-производителей: ОАО «Русский Продукт», ООО «НоваПродукт АГ», ООО «Штраус», ЗАО «Еремеевское», ООО «Кофейная компания "Вокруг света"», ЗАО «Кофе-цикорный комбинат «АРОНАП», Leroux Fabrique (Франция).
Метод определения инулина базируется на существующем методе определения простых сахаров (фруктозы и др.), изложенном в ГОСТ 31669-2012 [16].
Подготовка проб заключалась в растворении навески образца ЦРН, разведении и ферментативном гидролизе.
Навеску образца 0,5 г (взвешивают с точностью до 0,1 мг) помещают в стакан объемом 100 см3. При постоянном перемешивании добавляют 10 см3 кипящей воды и сразу же проверяют значение рН, оно должно находиться в пределах от 6,5 до 8,0. В случае несоответствия устанавливают значение pH на уровне 4,5±0,2 путем добавления 0,1 М раствора соляной кислоты либо 0,1 М раствора калия гидроокиси. Продолжают измерение и регулирование значения рН до того момента, пока навеска полностью не растворится. Затем промывают электрод кипящей водой. Количественно переносят раствор в мерную колбу объемом 50 см3, промывают стакан кипящей водой. Помещают колбу на водяную баню и выдерживают в течение 10 мин при 85±2 °С, непрерывно перемешивая.
Раствор охлаждают до комнатной температуры, гомогенизируют, доводят водой до 50 см3. Затем переносят раствор в стакан и продолжают интенсивно перемешивать с помощью магнитной мешалки. Отбирают алик-воту 15 см3 для гидролиза.
На первом этапе гидролиза аликвоту объемом 15 см3 помещают в колбу (50 см3) и добавляют такое же количество ацетатного буфера (pH 4,5). Проверяют значение рН раствора, которое должно находиться в пределах 4,5±0,05. В случае несоответствия корректируют зна-
чение рН путем добавления 0,1 М раствора соляной кислоты либо 0,1 М раствора калия гидроокиси. Затем добавляют 50 мкл амилоглюкозидазы (>260 Ед/мл). Закрывают алюминиевой фольгой, выдерживают смесь в течение 60 мин на водяной бане при температуре 40±2 °С при постоянном слабом перемешивании. Затем остужают до комнатной температуры (20±2 °С).
На втором этапе гидролиза из первого гидролизата отбирают аликвоту 10 см3, добавляют 100 мкл раствора инулиназы (>280 Ед/мл). Закрывают алюминиевой фольгой, снова выдерживают в течение 30 мин на водяной бане при температуре 40±2 °С при постоянном слабом перемешивании. Отсчет времени начинают с того момента, когда температура реакционной смеси достигнет 40 °С. Затем остужают до комнатной температуры (20±2 °С).
Результаты и обсуждение
Модификации, которые были произведены в процессе разработки метода определения инулина, заключались в изменении подготовки пробы к анализу и не затрагивали метрологических характеристик метода определения простых сахаров.
При этом в эксперименте была произведена оптимизация условий проведения гидролиза инулина. Оптимизации были подвергнуты следующие параметры: рН и температура реакционной смеси, содержащей субстрат и ферменты. С учетом полученных экспериментальных данных (см. таблицу), а также принимая во внимание данные литературы [16], установлены оптимальные значения проведения гидролиза инулина: рН 4,5 и температура 40 °С.
Для количественного определения используют метод абсолютной калибровки (площадь пика или его высоту). Линейность устанавливают на рабочих стандартных растворах фруктозы [17]. Анализ проводят, последовательно измеряя концентрацию сахара в образце и в рабочем стандартном растворе сахара. Типичные примеры ВЭЖХ-РД-хроматографического анализа образца ЦНР представлены на рисунке.
Для расчета содержания инулина определяют содержание фруктозы, выделившейся в результате гидролиза, за вычетом свободной фруктозы, с применением программного комплекса СИет^аНоп.
Методика для определения инулина в ЦРН прошла предварительные валидационные испытания по параметрам специфичность, линейность, правильность (методом добавок стандартных образцов инулина). Следующим этапом разработки настоящего метода является валидация в соответствии с протоколами 1СН, проведение широкомасштабного межлабораторного испытания.
В ходе анализа серий образцов ЦРН с применением разработанного метода было установлено, что содержание инулина в образцах колеблется в пределах от 4 до 25%. Перспективным является изучение
Высвобождение фруктозы из инулина в зависимости от условий гидролиза
Условия проведения гидролиза Высвобождение фруктозы, %
амилоглюкозидаза инулиназа
t=40 °C При pH 4,5 10,4 12,1
t=60 °C 5,3 6,2
pH 4,5 При t=40 °C 9,6 12,3
pH 7,0 4,8 5,9
Величина сигнала, мВ
Время удерживания, мин
А
Величина сигнала, мВ
Время удерживания, мин
Б
Высокоэффективная жидкостная хроматограмма с рефрактометрическим детектированием образца цикория растворимого натурального: А - до гидролиза; Б - после второго гидролиза Ориентировочное время удерживания фруктозы - 11,5 мин.
зависимости содержания инулина в сырье (корнях цикория) от степени его обжаривания. Этот этап является одним из важнейших в технологии производства напитков из цикория, в процессе которого протекает целый ряд физико-химических и пиролитических процессов, влияющих на содержание инулина в конечном продукте.
На сегодняшний день строгое соблюдение стандартов качества и безопасности пищевых продуктов и напитков можно гарантировать только в случае использования
надежных современных приборов и валидированных методов. Эти приборы и методы должны соответствовать всем требованиям современной нормативной документации. ЦРН представляет собой сложную, многокомпонентную систему, качество которой зависит от свойств сырья и совокупности изменений при технологической обработке и последующем хранении. Разработка современного инструментального физико-химического метода является важным этапом на пути создания современной нормативной документации.
В результате проведенного исследования показана возможность применения методики оценки содержания инулина, основанной на определении фруктозы методом обращенно-фазовой ВЭЖХ-РД после ферментативного гидролиза инулина амилоглюкозидазой и инулиназой, в ЦРН, который поступает на российский рынок. Применение данного метода в контроле качества ЦРН позво-
ляет гарантировать соблюдение оптимального содержания инулина в продукте, обеспечение высокой пищевой ценности и сохранности функциональных свойств ЦРН, поступающего к потребителю.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Боков Дмитрий Олегович - лаборант-исследователь лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», ассистент кафедры фармакогнозии ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России E-mail: [email protected]
Хромченкова Елена Петровна - научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва) E-mail: [email protected]
Сокуренко Мария Сергеевна - лаборант-исследователь лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», аспирант кафедры фармацевтической технологии ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России E-mail: [email protected]
Васильев Алексей Вячеславович - кандидат технических наук, менеджер по качеству ООО «Славкофе» (городской округ Щербинка по г. Москве) E-mail: [email protected]
Бессонов Владимир Владимирович - доктор биологических наук, заведующий лабораторией химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва) E-mail: [email protected]
Литература
ГОСТ Р 55512-2013 «Цикорий натуральный растворимый. Техни- 9. ческие условия (с поправкой)». Дата введения 2015-01-01. Конь И.Я., Тоболева М.А., Сафронова А.И., Елезова Л.И., Алешина И.В., Гурченкова М.А. Изучение переносимости и эффек- 10. тивности применения растворимого сублимированного цикория в питании детей дошкольного и школьного возраста // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № Б2. С. 194-195. 11.
Лузина Е.В. Пищевая ценность цикория // Вопр. питания. 2013. Т. 82, № 2. С. 62-65.
Бычков И.Н., Рябкина Е.А. Иоактивные метаболиты растений: 12. возможности применения в составе функциональных продуктов питания для коррекции метаболических нарушений // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № Б2. С. 134-135.
Королев А.А., Корнева Л.Я., Коптяева И.С., Фазулина О.Ф., Лын- 13. дина М.И. Разработка пищевых концентратов для рационов здорового питания // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № Б2. С. 195. Пилипенко В.И., Теплюк Д.А., Шаховская А.К., Исаков В.А., Воробьева В.М., Воробьева И.С. и др. Использование многоком- 14. понентного функционального пищевого продукта у больных с синдромом раздраженного кишечника с запорами: результаты сравнительного контролируемого исследования // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 2. С. 84-91. 15. Малкина В.Д., Балуян Х.А., Жиркова Е.В., Мартиросян В.В. Хлебобулочные изделия антидиабетического действия // Вопр. 16. питания. 2015. Т. 84, № Б5. С. 52.
Сидорова Л.Н., Байков В.Г., Бессонов В.В., Скобельская З.Г. Влияние 17. пищевых волокон на сохранность липидного компонента мучных кондитерских изделий // Вопр. питания. 2007. Т. 76, № 3. С. 78-81.
Методические рекомендации МР 2.3.1.1915-04 «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ».
Оробинская В.Н., Писаренко О.Н. Инулин, левулин и олигофрук-тоза - пребиотики XXI века // Перспективы науки. 2015. № 2 (65). С. 18-23.
Копытько Я.Ф. Количественное определение суммы углеводов в пересчете на фруктозу в соке лопуха после конверсии в фураны // Хим.-фарм. журн. 2017. Т. 51, № 4. С. 39-41. Пшукова И.В., Коновалов Д.А., Карпенко В.А., Лигай Л.В., Кулешова С.А. Фитохимическое и фармакологическое изучение корней подсолнечника однолетнего // Химия растительного сырья. 2014. № 2. С. 189-194.
Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Исследование колориметрической реакции инулина с резорцином в зависимости от условий ее проведения // Химия растительного сырья. 2008. № 1. С. 81-87.
Руководство Р. 4.1. 1672-03 «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» / Минздрав России. М. : Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 240 с. Prosky L., Hoebregs H. Methods to determine food inulin and oligofructose // J. Nutr. 1999. Vol. 129, N 7. P. 1418-1423. Rocha J.R. et al. Design and characterisation of an enzyme system for inulin hydrolysis // Food Chem. 2006. Vol. 95, N 1. P. 77-82. ГОСТ 31669-2012 «Продукция соковая. Определение сахарозы, глюкозы, фруктозы и сорбита методом высокоэффективной жидкостной хроматографии».
References
GOST R 55512-2013 «Natural instant chicory. Specifications (with 2. Amendment)». Date of introduction 01.01.2015. (in Russian)
Kon' I.Ya., Toboleva M.A., Safronova A.I., Elezova L.I., Aleshina I.V., Gurchenkova M.A. Study of the transparency and effectiveness
3
4
5
6
7
EOKOB fl.O., XpoMHeHKOBa E.n., CoKypeHKO M.C. u gp.
of instant sublimated chicory application in nutrition of children 10. of preschool and school age. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (S2): 194-95. (in Russian)
3. Luzina E.V. Food value of cichorium intybus. Voprosy pitaniia [Prob- 11. lems of Nutrition]. 2013; 82 (2): 62-5. (in Russian)
4. Bychkov I.N., Ryabkina E.A. loactive metabolites of plants: the possibility of application in the composition of functional food products
for the correction of metabolic disorders. Voprosy pitaniia [Prob- 12. lems of Nutrition]. 2016; 85 (S2): 134-5. (in Russian)
5. Korolev A.A., Korneva L.Ya., Koptyaeva I.S., Fazulina O.F., Lyndina M.I. Development of food concentrates for healthy diets. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (S2): 195. (in Russian) 13.
6. Pilipenko V.l., Teplyuk D.A., Shakhovskaya A.K., Isakov V.A., Voroby-ova V.M., Vorobyova I.S., et al. Using a multicomponent functional food in IBS patients with constipation: a comparative controlled study. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (2): 84-91. 14. (in Russian)
7. Malkina V.D., Baluyan Kh.A., Zhirkova E.V., Martirosyan V.V. Bakery products of antidiabetic action. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (S5): 52. (in Russian)
8. Sidorova L.N., Baykov V.G., Bessonov V.V., Skobelskaya Z.G. The 15. influence of dietary fiber on preservation of lipid component in flour confectionery. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2007; 76 (3): 16. 78-81. (in Russian)
9. Methodical recommendations MP 2.3.1.1915-04 «Recommended 17. levels of consumption of food and biologically active substances»
(in Russian)
Orobinskaya V.N. , Pisarenko O.N. Inulin, levulin and oligofructose -prebiotics of the 21st century. Perspektivi nauki [Science Prospects]. 2015; 2 (65): 18-23. (in Russian)
Kopytko Ya.F. Determination of total carbohydrates (recalculated for fructose upon conversion to furans) in burdock juice. Khimiko-farmacevticheskiy zhurnal [Pharmaceutical Chemistry Journal]. 2017; 51 (4): 39-41. (in Russian)
Pshukov I.V., Konovalov D.A., Karpenko V.A., Ligay L.V., Kuleshova S.A. Phytochemical and pharmacological studying of roots of common sunflower. Khimiya rastitel'nogo syr'ia [Chemistry of Plant Raw Material]. 2014; (2): 189-94. (in Russian) Olennikov D.N., Tankhaeva L.M. Investigation of the colorimetric reaction of inulin with resorcinol, depending on the conditions of its conduct. Khimiya rastitel'nogo syr'ia [Chemistry of Plant Raw Material]. 2008; (1): 81-7. (in Russian)
Guidance R. 4.1. 1672-03 «Manual on methods for quality control and safety of biologically active food supplements». In: Ministry of Health of Russia. Moscow: Federal Center for State Sanitary and Epidemiological Supervision of the Russian Ministry of Health; 2004: 240 p. (in Russian)
Prosky L., Hoebregs H. Methods to determine food inulin and oligofructose. J Nutr. 1999; 129 (7): 1418-23. Rocha J.R., et al. Design and characterisation of an enzyme system for inulin hydrolysis. Food Chem. 2006; 95 (1): 77-82. GOST 31669-2012 «Juice products. Determination of sucrose, glucose, fructose and sorbite by high performance liquid chromatogra-phy (HPLC)». Date of introduction 07.02.2013. (in Russian)
