CC BY
45
Викторов Виталий Васильевич - д.м.н., зав. кафедрой факультетской педиатрии с курсами педиатрии, неонатологии и симуляционным центром ИДПО ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450008, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Федоров Сергей Владимирович - д.м.н., профессор кафедры хирургии с курсом эндоскопии ИДПО ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450008, г. Уфа, ул. Ленина, 3.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белобородов, В.А. Абдоминальный компартмент-синдром: эпидемиология, этиология, патофизиология /В.А. Белобородов, А.А. Белобородов, Д.С. Бердников // Сибирское медицинское обозрение. - 2009. - №2(50). - С.100-104.
2. Райбужис, Е.Н. Внутрибрюшная гипертензия и абдоминальный компартмент-синдром: современные представления о диагностике и лечении / Е.Н.Райбужис [и др.] //Вестник анестезиологии и реаниматологии. - 2010. - Т.7, N° 4. - С.14-21.
3. Западнюк, И.П. Лабораторные животные: разведение, содержание, использование в эксперименте: учебное пособие для студентов биол. спец. вузов - 3-е изд., перераб. и доп. - Киев: Вища шк., 1983. - 383 с.
4. Плохинский, Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский. - М.: Изд-во МГУ, 1970. - 367 с.
5. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA/О.Ю. Реброва. - М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.
6. Холлендер, М. Непараметрические методы статистики / М. Холлендер. - М.: Финансы и статистика, 1983. - 518 с.
REFERENCES
1. Beloborodov, V.A. Abdominal'nyj kompartment-sindrom: ehpidemiologiya, ehtiologiya, patofiziologiya. /V.A.Beloborodov, A.A.Beloborodov, D.S. Berdnikov // Sibirskoe medicinskoe obozrenie. - 2009-№2(50). - S.100-104. [In Russ].
2. Rajbuzhis, E.N. Vnutribryushnaya gipertenziya i abdominal'nyj kompartment-sindrom: sovremennye predstavleniya o diagnostike i lechenii / E.N.Rajbuzhis [i dr.] //Vestnik anesteziologii i reanimatologii. - 2010. - T.7. - № 4. - S.14-21. [In Russ].
3. Zapadnyuk, I.P. /Laboratornye zhivotnye: razvedenie, soderzhanie, ispol'zovanie v ehksperimente: uchebnoe posobie dlya studentov biol. spec. vuzov - 3-e izd., pererab. i dop. - Kiev: Vishcha shk., 1983. - 383 s. [In Russ].
4. Plohinskij, N.A. Biometriya / N.A. Plohinskij.- M.: MGU, 1970 - 367 s. [In Russ].
5. Rebrova, O.YU. Statisticheskij analiz medicinskih dannyh. Primenenie paketa prikladnyh programm STATISTICA/O.YU. Rebrova. -Moskva: MediaSfera, 2002. - 312 s. [In Russ].
6. Hollender, M. Neparametricheskie metody statistiki / M.Hollender.- Moskva: Finansy i statistika, 1983. - 518 s. [In Russ].
УДК 615.074; 54.062; 543.062; 543.066 © Коллектив авторов, 2019
К.И. Ровкина1,2, С.В. Кривощеков1, А.М. Гурьев1, М.С. Юсубов2, Е.А. Безверхняя1,2, М.В. Белоусов1 РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ ЛИСТЬЕВ БЕРЕЗЫ
1 ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Томск 2ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский политехнический
университет», г. Томск
Природные полисахариды, обладая широким спектром физиологических эффектов, могут быть перспективными лекарственными кандидатами. Предложенные государственной фармакопеей методы для определения сахаров не во всех случаях подходят для анализа сложных полимеров. Цель данной статьи - модификация антрон-серного метода для количественного определения полисахаридов листьев березы (Betula pendula Roth., Betulapubescens Ehrh.) в субстанции. Были отработаны параметры гидролиза: предложено проводить гидролиз серной кислотой на кипящей водяной бане 98% в течение 30 минут. Ввиду особенностей состава изучаемого объекта, было предложено заменить стандартное вещество на рамнозу. Для увеличения специфичности методики перед анализом раствор полисахаридов необходимо подвергать ультрафильтрации. Установлено, что методика валидна по всем исследуемым характеристикам.
Ключевые слова: полисахариды, спектрофотометрия, Betula pendula Roth., Betula pubescens Ehrh., валидация.
K.I. Rovkina, S.V. Krivoschekov, A.M. Guriev, M.S. Yusubov, E.A. Bezverkhnyaya, M.V. Belousov DEVELOPMENT OF METHODS FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF POLYSACCHARIDES OF BIRCH LEAVES
Natural polysaccharides, possessing a wide spectrum of physiological effects, can be promising drug candidates. The methods proposed by the State Pharmacopoeia for the determination of sugars are not always suitable for the analysis of complex polymers. The purpose of this article is modification of the anthrone-sulfur method for the quantitative determination of birch leaves polysaccharides (Betula pendula Roth., Betula pubescens Ehrh.) in a substance. The hydrolysis parameters were tested: it was proposed to carry out hydrolysis for 30 minutes in a boiling water bath with 98% sulfuric acid. It is proposed to replace the standard substance by rhamnose, due to the nature of the composition of the object being studied. Ultrafiltration should be applied before analysis to increase the specificity of the method. It was established that the method is valid by all studied characteristics.
Key words: polysaccharides, spectrophotometry, Betula pendula Roth., Betula pubescens Ehrh., validation.
В последние годы интерес мирового научного сообщества обращен к растительным полисахаридам ввиду потенциала их
применения, включая разработку новых лекарственных средств [1,2]. Полисахариды растительного происхождения обладают раз-
личными терапевтическими эффектами (гепа-топротекторными, антиоксидантными, антимикробными, гастропротективными и антико-агулянтными) при низкой токсичности [3-8]. Тем не менее разработку и использование по-лисахаридных препаратов по сравнению с другими соединениями затрудняют сложные процедуры выделения, очистки, характеристики и контроля качества из-за их сложного химического состава, большого размера макромолекул и затруднённой пространственной структуры. Стандартизация фармацевтической субстанции и готовой лекарственной формы полисахаридных препаратов - одна из сложнейших задач доклинических исследований.
Группа ученых СибГМУ занимается разработкой гиполипидемического препарата на основе полисахаридов березы (Betula pendula Roth., Betula pubescens Ehrh.). Для выбора оптимальной методики количественного определения, пригодной для использования в фармацевтическом анализе и включения в нормативную документацию на разрабатываемое лекарственное средство, проведены экспериментальные исследования, а именно, показана возможность использования спектро-фотометрического метода, основанного на модифицированной фармакопейной методике определения сахаров.
Материал и методы
В качестве объекта исследования использовали воздушно-сухое сырье - листья березы (Betula pendula Roth., Betula pubescens Ehrh), собранные в окрестностях г. Томска в июне 2017 г.
Полисахариды листьев березы (ПС®) выделены по известной технологии [9]. Анализ мономерного состава проводили методом газовой хроматографии ацилированных по-лиолов [10]. Молекулярно-массовое распределение оценивали методом эксклюзионной хроматографии [11].
Для количественного определения точную навеску (100 мг) nCfB переносили в мерную колбу на 100 мл, добавляли 10 мл воды очищенной и растворяли при интенсивном перемешивании, доводили объем раствора до метки тем же растворителем. Аликвоту 1,0 мл помещали в пробирку Vivaspin Turbo 4 и центрифугировали 10 минут при 4,4*103 rpm, затем добавляли 2 мл воды и повторно центрифугировали в тех же условиях. Супернатант количественно переносили в мерную колбу на 10 мл, объем раствора доводили до метки водой (рабочий раствор nCfB, С=0,1 мг/мл).
Приготовление раствора стандартного образца (РСО) рамнозы (С=0,03 мг/мл): точ-
ную навеску (300 мг) РСО рамнозы помещали в мерную колбу на 100 мл, растворяли в 30 мл воды и доводили объем раствора до метки. Аликвоту 1,0 мл переносили в мерную колбу на 100 мл, доводили объем раствора до метки водой.
Результаты и обсуждение
Предлагаемые Государственной фармакопеей XIII 0ФС.1.2.3.0019.15 «Определение сахаров спектрофотометрическим методом» способы количественного определения сахаров: метод определения с пикриновой кислотой и метод определения с орциновым реактивом. Эти методы не нашли применения в стандартизации субстанции ПС®, так как они основаны на определении только восстанавливающих сахаров (с пикриновой кислотой) или пентоз (с орциновым реактивом). Третий метод, предлагаемый фармакопейной статьей, метод определения с антроновым реактивом также имеет недостаток: количественный расчет проводится по стандарту глюкозы, что приводит к искажению результатов анализа полисахаридов, не содержащих ее в своей структуре.
На первом этапе исследования нами подобраны условия пробоподготовки - гидролиза ПС®. Для одновременного проведения процессов гидролиза полисахаридной молекулы и окисления образующихся моносахаров до производных фурфурола чаще всего используют растворы серной кислоты (98-70%) [12]. На процесс гидролиза - окисления полисахаридов влияют следующие параметры: время гидролиза, концентрация гидролизую-щего агента и температура нагревания водяной бани. Влияние каждого параметра оценивали поэтапно.
В первую очередь определяли наиболее эффективное время гидролиза - окисления. Для этого к 3 мл раствора ПС® (С=0,1 мг/мл), охлажденного на ледяной бане, добавляли 3 мл концентрированной H2SO4 и нагревали на кипящей водяной бане в течение 5, 10, 20, 30, 40 и 50 минут. Растворы гидролизатов вновь охлаждали и добавляли по 3 мл 0,2 % антронового реактива. Содержимое пробирок перемешивали и медленно нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Оптическую плотность измеряли на приборе Unico 2800 (США) в максимуме поглощения при длине волны 625 нм.
Далее оценивали степень влияния концентрации серной кислоты (80, 90, 98 %) на процесс гидролиза - окисления при длительности инкубирования 30 минут. Концентрации ниже 80% не рассматривали в связи с вы-
падением в осадок антрона. Как видно из диаграммы (рис.1), степень гидролиза ПС® возрастает с увеличением концентрации серной кислоты, поэтому в методике следует использовать 98 % раствор.
Определение оптимального времени нагревания для проведения процесса гидролиза - окисления полисахаридов (ПС) показало, что при увеличении времени с 10 до 30 минут происходит увеличение поглощения испытуемого раствора до максимума при нагревании в течение 30 минут, а при увеличении времени до 40 минут происходит снижение оптической плотности испытуемого раствора, что объясняется деструкцией и озолением. Поэтому по данной методике рекомендовано использовать время нагревания 30 минут (рис. 1).
На последнем этапе нами установлена степень влияния температуры водяной бани на гидролиз ПС®. Изучены температуры нагревания водяной бани: 60оС, 80оС и 100оС. Полученные данные показали, что с повышением температуры степень гидролиза увеличивается, поэтому в разрабатываемой методике целесообразно использовать кипящую водяную баню.
Рис. 1. Зависимость оптической плотности комплексов гидро-лизатов ПС£В с антроном от времени нагревания, концентрации Ы2804 и температуры водяной бани
Рис. 2. Блок-схема разработанной методики количественного определения nCfB
Таким образом, нами разработаны оптимальные условия пробоподготовки ПС® для проведения количественного определения
с антроновым реактивом, алгоритм которого представлен на рис. 2.
Был проведен анализ состава ПС® (см. таблицу).
Характеристика nCfB
Таблица
Показатель Значение
Галактуроновая кислота,% 61,0±2,9
Рамноза,% 25,8±0,6
Арабиноза,% 1,3±0,1
Галактоза,% 7,5±0,4
Mw (средневесовая молекулярная масса), kDa 355,4
Mn (среднечисловая молекулярная масса), kDa 15,0
Нами получены электронные спектры продуктов реакции стандартов моносахаридов с антроном в разработанных условиях, входящих в состав ПС®. Спектры поглощения комплексов антрона с продуктами окисления рам-нозы и галактозы имели максимум поглощения при длине волны 625±2 нм, что соответствует литературным данным [13,14]. Однако на спектрах галактуроновой кислоты и арабинозы отсутствовали полосы поглощения при длине волны 625±2 нм, о чем свидетельствовало отсутствие зеленой окраски растворов.
Sample-2
500
650
700
550 600
Рис. 3. Электронные спектры модельных растворов моносахаров в количестве 1 мг/мл с антроном в разработанных условиях: 1 - рамноза; 2 - галактоза; 3 - арабиноза; 4 - галактуроно-вая кислота
Таким образом, показана возможность использования рамнозы в качестве стандартного вещества. Для расчета содержания ПС использовали формулу:
_ тньахАЬзпсГвхРхЗ
где Х% - содержание ПС® в субстанции, тщи - масса навески стандарта рамнозы; АЬ8пс£в - оптическая плотность испытуемого раствора; Р - содержание основного вещества в стандарте рамнозы; 3 - коэффициент пересчета на рамнозу; А^^а - оптическая плот-
ность стандартного раствора; тПСш - масса навески ПСШ.
Заключение
Нами разработана методика количественного определения ПС® на основе фармакопейной методики. Для дальнейшего ис-
пользования данной методики необходимо проведение ее валидации.
Работа выполнена при финансовой поддержке ГК от 28 апреля 2017 г. № 14.N08.11.0132.
Сведения об авторах статьи:
Ровкина Ксения Игоревна - аспирант Исследовательской школы химических и биомедицинских технологий ФГАОУ ВО НИ ТПУ. Адрес: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30. E-mail: rki91@bk.ru.
Кривощеков Сергей Владимирович - м.н.с. ЦНИЛ ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. Адрес: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: ksv_tsu@mail.ru
Гурьев Артем Михайлович - д.фарм.н., руководитель Центра внедрения технологий ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. Адрес: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: titan-m@mail.ru.
Юсубов Мехман Сулейман оглы - д.х.н., директор Исследовательской школы химических и биомедицинских технологий ФГАОУ ВО НИ ТПУ. Адрес: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30. E-mail: yusubov@mail.ru.
Безверхняя Екатерина Александровна - аспирант Исследовательской школы химических и биомедицинских технологий ФГАОУ ВО НИ ТПУ. Адрес: 634050, г. Томск, пр. Ленина. E-mail: katty_delicious@mail.ru.
Белоусов Михаил Валерьевич - д.фарм.н., зав. кафедрой фармацевтического анализа ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. Адрес: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: mvb63@mail.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Yapo, B.M. Pectic substances: From simple pectic polysaccharides to complex pectins-A new hypothetical model / B.M. Yapo // J. Carbohydrate Polymers. - 2011. - Vol. 86, № 2. - P. 373-385.
2. Biological activities and pharmaceutical applications of polysaccharide from natural resources: A review / Y. Yu [et al.] //J. Carbohydrate polymers. - 2018. - Vol. 183. - P. 91-101.
3. Partain E.M. Industrially important polysaccharides / E.M. Partain // Applied Polymer Science: 21st Century. - Pergamon, 2000. - P. 303-323.
4. Hepatoprotective and hypolipidemic effects of water-soluble polysaccharidic extract of Pleurotuseryngii / J. Chen [et al.] // J. Food chemistry. - 2012. - Vol. 130, № 3. - P. 687-694.
5. Antioxidant and anti-aging activities of polysaccharides from Calocybe indica var. APK2 / S. Govindan [et al.] // J. Experimental and Toxicologic Pathology. - 2016. - Vol. 68, № 6. - P. 329-334.
6. Antioxidant and antimicrobial activities of a purified polysaccharide from yerba mate (Ilex paraguariensis) / P. T. A. N. Kungel [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. - 2018. - Vol. 114. - P. 1161-1167.
7. Gastroprotective activity of a pectic polysaccharide fraction obtained from infusion of Sedum dendroideum leaves / A. F. de Oliveira [et al.] // J. Phytomedicine. - 2018. - Vol. 41. - P. 7-12.
8. Antioxidant and anticoagulant activity of polyphenol and polysaccharides from fermented Sargassum sp. / P. Shobharani [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. - 2014. - Vol. 65. - P. 542-548.
9. Компонентный состав полисахаридного комплекса листьев Crataegus sanguinea (rosaceae) из флоры республики Башкортостан / Хасанова С.Р. [и др.] // Растительные ресурсы - 2015. - Т. 51, № 3. - С. 397-406.
10. Pectic polysaccharides of the fresh plum Prunus domestica L. isolated with a simulated gastric fluid and their anti-inflammatory and antioxidant activities / S.V. Popov [et al.] // J. Food chemistry. - 2014. - Vol. 143. - P. 106-113.
11. Water-Soluble Polysaccharides of Alfalfa (Medicago sativa (Fabaceae)) of Flora of Krasnoyarsk Krai / K. I. Rovkina [et al.] // Russ. J. Bioorg. Chem. - 2018. - Vol. 44, № 7. - P. 854-859.
12. Reaction between carbohydrates and sulfuric acid: Part I. Depolymerization and sulfation of polysaccharides by sulfuric acid / K. Naga-sawa [et al.] // J. Carbohydrate Research. - 1971. - Vol. 18, № 1. - P. 95-102.
13. Bailey, R.W. The reaction of pentoses with anthrone / R.W. Bailey // Biochem. J. - 1958. - Vol. 68, № 4. - P. 669-672.
14. Sondergaard, G. Micro-method for determination of blood galactose by means of glucose oxidase (notatin) and anthrone / G. Sonder-gaard // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1958. - Vol. 10, № 2. - P. 203-210.
REFERENCES
1. Yapo, B.M. Pectic substances: From simple pectic polysaccharides to complex pectins-A new hypothetical model / B.M. Yapo // J. Carbohydrate Polymers. - 2011. - Vol. 86, № 2. - P. 373-385.
2. Biological activities and pharmaceutical applications of polysaccharide from natural resources: A review / Y. Yu [et al.] //J. Carbohydrate polymers. - 2018. - Vol. 183. - P. 91-101.
3. Partain E.M. Industrially important polysaccharides / E.M. Partain // Applied Polymer Science: 21st Century. - Pergamon, 2000. - P. 303-323.
4. Hepatoprotective and hypolipidemic effects of water-soluble polysaccharidic extract of Pleurotuseryngii / J. Chen [et al.] // J. Food chemistry. - 2012. - Vol. 130, № 3. - P. 687-694.
5. Antioxidant and anti-aging activities of polysaccharides from Calocybe indica var. APK2 / S. Govindan [et al.] // J. Experimental and Toxicologic Pathology. - 2016. - Vol. 68, № 6. - P. 329-334.
6. Antioxidant and antimicrobial activities of a purified polysaccharide from yerba mate (Ilex paraguariensis) / P. T. A. N. Kungel [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. - 2018. - Vol. 114. - P. 1161-1167.
7. Gastroprotective activity of a pectic polysaccharide fraction obtained from infusion of Sedum dendroideum leaves / A.F. de Oliveira [et al.] // J. Phytomedicine. - 2018. - Vol. 41. - P. 7-12.
8. Antioxidant and anticoagulant activity of polyphenol and polysaccharides from fermented Sargassum sp. / P. Shobharani [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. - 2014. - Vol. 65. - P. 542-548.
9. Компонентный состав полисахаридного комплекса листьев &ataegus sanguinea (rosaceae) из флоры республики Башкортостан / Хасанова С.Р. [и др.] // Растительные ресурсы - 2015. - Т. 51, № 3. - С. 397-406.
10. Pectic polysaccharides of the fresh plum Prunus domestica L. isolated with a simulated gastric fluid and their anti-inflammatory and antioxidant activities / S. V. Popov [et al.] // J. Food chemistry. - 2014. - Vol. 143. - P. 106-113.
11. Water-Soluble Polysaccharides of Alfalfa (Medicago sativa (Fabaceae)) of Flora of Krasnoyarsk Krai / K. I. Rovkina [et al.] // Russ. J. Bioorg. Chem. - 2018. - Vol. 44, № 7. - P. 854-859.
12. Reaction between carbohydrates and sulfuric acid: Part I. Depolymerization and sulfation of polysaccharides by sulfuric acid / K. Naga-sawa [et al.] // J. Carbohydrate Research. - 1971. - Vol. 18, № 1. - P. 95-102.
13. Bailey, R.W. The reaction of pentoses with anthrone / R.W. Bailey // Biochem. J. - 1958. - Vol. 68, № 4. - P. 669-672.
14. Sondergaard, G. Micro-method for determination of blood galactose by means of glucose oxidase (notatin) and anthrone / G. Sondergaard // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1958. - Vol. 10, № 2. - P. 203-210.
