CC BY
43
УДК 615.07:543.544.5.068.7
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-2-5-10
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОМЕКАИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ МЕТОДОМ ВЭЖХ-УФ
Саидов2 Н.Д., Карпенко1 Ю.Н., Малкова1 Т.Л.
1ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», Пермь, Российская Федерация 2Таджикский национальный университет, г. Душанбе, Республика Таджикистан
METHOD DEVELOPMENT FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF MONOMECAINE IN BLOOD PLASMA BY HPLC-UV
Saidov2 N.D., Karpenko1, Yu.N., Malkova1 T.L.
1Perm State Pharmaceutical Academy, 614990, Perm, Russian Federation 2Tajik National University, Pharmaceutical faculty, Dushanbe, Republic of Tajikistan
Аннотация. В данной статье представлены результаты исследований по разработке методики количественного определения нового антиаритмического средства мономекаина в плазме крови. Извлечение биологически активного соединения осуществляли путем жидкость-жидкостной экстракции хлороформом. Для анализа экстрагированного мономекаина использовали обращено-фазный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием элюента на основе фосфатного буфера (рН 3) и ацетонитрила. Мономекаин и внутренний стандарт (лидокаин) детектировали при 210 нм. Разработанная методика специфична, линейна в диапазоне от 0,09 до 5,3 мкг/мл. Коэффициент вариации результатов анализа образцов контроля качества на всех уровнях концентраций не превышал 7,14%, относительная погрешность результатов находилась в пределах от - 2,22 до 3,70%. Проведенная валидационная оценка разработанной методики подтвердила ее пригодность для использования в фармакокинетических исследованиях мономекаина. Ключевые слова: антиаритмические препараты, мономекаин, высокоэффективная жидкостная хроматография, фармакокинетика, валидация методик Annotation. This article presents the results of studies on the development of a method for the quantitative determination of a new antiarrhythmic drug monomecaine in blood plasma. Extraction of the biologically active compound was carried out by liquid-liquid extraction with chloroform. For analysis of extracted monomecaine, a reversed-phase version of high performance liquid chromatography was used using an eluent based on phosphate buffer (pH 3) and acetonitrile. Monomecain and internal standard (lidocaine) were detected at 210 nm. The developed technique is specific, linear in the range from 0.09 to 5.3 ¡xg / ml. The coefficient of variation of the results of the analysis of quality control samples at all concentration levels did not exceed 7.14%, the relative error of the results was in the range from - 2.22 to 3.70%. A validation assessment of the developed methodology confirmed its suitability for use in pharmacokinetic studies of monomecaine. Keywords: antiarrhythmic drugs, monomecaine, high performance liquid chromatography, pharmacokinetics, validation ofmethods.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК [1] Рудакова И.П., Гашкова О.В., Чекрышкина Л.А. Исследование аритмогенного действия нового производного орто-толуидида диэтиламино-уксусной кислоты, проявившего антиаритмическую активность // Научно- REFERENCES [1] Rudakova I.P., Gashkova O.V., Chekryshkina L.A. Issledovanie aritmogennogo dejstvija novogo proizvodnogo orto-toluidida dijetilamin-ouksusnoj kisloty, projavivshego antiaritmich-eskuju aktivnost' // Nauchno-proizvodstvennyj
—--—
~ 5 ~
ИгЧ
"Medical & pharmaceutical journal "Pulse" | "Медико-фармацевтический журнал "Пульс"
производственный журнал. Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2015. -№2(11). - С. 204-208.
[2] Рейхарт, Д. В., Чистяков В. В. Анализ лекарственных средств при фармакокинетических исследованиях (обзор) / / Казанский мед. журн. - 2010. - Т. 91, № 4. - С. 532-536.
[3] Гугля, Е. Б. Применение жидкостной хромато-масс-спектрометрии в доклинических исследованиях лекарственных средств // Вестник РГМУ. - 2014. - № 1. - С. 65-71
[4] Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К. 2012._
Мономекаин (2-метиланилид-^^ди-этиламиноэтановой кислоты нитрат) - антиаритмическое средство, синтез которого осуществлен в Пермской государственной фармацевтической академии под руководством профессора Панцуркина В.И. В сравнении с лидо-каином мономекаин обладает более выраженным антиаритмическим действием и проявляет меньшую токсичность [1]. В настоящее время биологически активное соединение проходит доклинические исследования, одним из этапов которых является изучение его фармакокинетики.
При проведении фармакокинетических исследований наиболее востребованным методом определения лекарственных средств является высокоэффективная жидкостная хроматография. К основным преимуществам метода можно отнести его высокую чувствительность, экспрессность, возможность анализа термолабильных и нелетучих соединений. В качестве способов пробоподготовки плазмы крови широко используются преципитация белков плазмы осаждающими агентами, варианты жидкость - жидкостной и твердофазной экстракции [2,3].
Целью настоящего исследования явилась разработка методики количественного определения антиаритмического средства мономекаина в плазме крови с перспективой дальнейшего использования для оценки фармакокинетических свойств соединения.
Экспериментальная часть. В процессе разработки и валидации методики использовалась субстанция мономекаина, синтезированная в Пермской государственной
zhurnal. Razrabotka i registracija lekarstvennyh sredstv. - 2015. - №2(11). - S. 204-208.
[2] Rejhart, D. V., Chistjakov V. V. Analiz lekarstven-nyh sredstv pri farmakokineticheskih issledo-vanijah (obzor) / / Kazanskij med. zhurn. - 2010. - T. 91, № 4. - S. 532-536.
[3] Guglja, E. B. Primenenie zhidkostnoj hromato-mass-spektrometrii v doklinicheskih issledo-vanijah lekarstvennyh sredstv // Vestnik RGMU. - 2014. - № 1. - S. 65-71
[4] Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskih is-sledovanij lekarstvennyh sredstv. Chast' per-vaja. - M.: Grif i K. 2012.
фармацевтической академии (содержание действующего вещества 99,89%). В качестве внутреннего стандарта апробирована субстанция лидокаина гидрохлорида моногидрата (LGC Standards, CAS Number: 6108-05-0).
ВЭЖХ - анализ проводили на жидкостном хроматографе «LC-20 Prominence» (Shimadzu) с диодноматричным детектором SPD-M20A. Разделение осуществляли с использованием изократического режима элюи-рования на хроматографической колонке «Luna 5ц C18(2) 100A (Phenomenex). Скорость потока элюента состава фосфатный буфер (рН 3) - ацетонитрил составила 1 мл/мин, длина волны детектирования - 210 нм.
Приготовление исходных растворов, калибровочных стандартов, образцов контролей качества. Исходный раствор мономекаина с концентрацией 10 мг/мл готовили путем растворения точной навески субстанции в метаноле. Рабочие растворы мономекаина получали из исходного раствора разбавлением метанолом до необходимых концентраций. Для проведения валидации разработанной методики были приготовлены модельные смеси плазмы крови с известным содержанием мо-номекаина. Концентрации калибровочных стандартов составили 0,09; 0,53; 1,06; 2,65; 3,98; 5,30 мкг/мл; образцов контроля качества - 0,09; 0,27; 2,18; 4,36 мкг/мл.
Методика пробоподготовки плазмы крови к хроматографическому исследованию. 250 мкл плазмы помещали в центрифужную пробирку типа Эппендорф, добавляли 50 мкл раствора внутреннего стандарта (раствор ли-докаина гидрохлорида в метаноле с
—--—
~ 6 ~
ИгЧ
"Medical & pharmaceutical journal "Pulse" | "Медико-фармацевтический журнал "Пульс"
концентрацией 50 мкг/мл), 50 мкл водного раствора гидроксида аммония (10%), 1000 мкл хлороформа. Содержимое пробирки встряхивали на лабораторном шейкере со скоростью 1500 об/мин в течение 5 минут, затем центрифугировали 5 минут при 10 000 об/мин. Отбирали 800 мкл хлороформного экстракта и переносили в хроматографическую виалу. Экстракт выпаривали в токе азота, сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы. Объем вводимой пробы - 25 мкл.
Валидацию методики количественного определения мономекаина проводили по следующим параметрам: специфичность, линейность, предел количественного определения, правильность и прецизионность.
Результаты и обсуждение. Разработка метода ВЭЖХ-УФ. В процессе разработки хроматографической методики были исследованы различные условия, влияющие на удерживание мономекаина и лидокаина (внутреннего стандарта) в обращенно-фазном варианте ВЭЖХ. Было установлено, что оптимальное разделение соединений наблюдается при использовании элюента фосфатный буфер (рН 3) - ацетонитрил в соотношении 80:20. Времена удерживания мономекаина и лидока-ина составили 6,8 и 8,1 мин. соответственно. Хроматограмма стандартного метанольного раствора мономекаина и лидокаина представлена на рисунке 1.
21Qnm4nm (1.QQ) Л
У V-J,
J '[■- 'í
Рисунок 1 - Хроматограмма стандартного метанольного раствора (концентрация анали-
тов 25 мкг/мл)
Длительность хроматографического анализа составляет 10 минут. Попытка оптимизации методики по времени за счет увеличения доли ацетонитрила в подвижной фазе повлекла за собой ухудшение разрешения пиков.
Валидация методики. Специфичность методики оценивали при исследовании извлечений «холостых» образцов
плазмы, полученных от лабораторных животных (кроликов, крыс), и человеческой плазмы. Установлено отсутствие посторонних пиков со временами удерживания, соответствующими мономекаину и лидокаину. Пример хромато-граммы «холостой» плазмы приведен на рисунке 2.
1Q.Q
mAU
-21Qnm4nm (1.QQ)
7.5-5.Q-2.5
Рисунок 2 - Хроматограмма экстракта из «холостой» плазмы кролика
Q
3.5
4.Q
4.5
5.Q
5.5
6.Q
6.5
7.Q
7.5
8.Q
8.5
Q.Q
Q.Q
1.Q
2.Q
3.Q
4.Q
5.Q
6.Q
7.Q
8.Q
9.Q
—--—
~ 7 ~
Линейность методики количественного определения мономекаина доказывали с использованием модельных смесей (калибровочных стандартов) в диапазоне
концентраций вещества от 0,09 до 5,3 мкг/мл. Исходные данные для построения калибровочного графика представлены в таблице 1.
Таблица 1
Данные для построения калибровочного графика количественного определения мономекаина в плазме крови методом ВЭЖХ
Концентрация калибровочного стандарта, мкг/мл Соотношение площадей пиков (среднее 3 измерений)
0,09 0,0075
0,53 0,0421
1,06 0,0945
2,65 0,2278
3,98 0,3329
5,30 0,4472
Уравнение калибровочного графика (рис. 3) имеет вид У = 0,0846808хС (где У - соотношение площадей пиков мономекаина и внутреннего стандарта, С - концентрация мономекаина]. Линейность отклика детектора от
концентрации мономекаина в плазме подтверждает рассчитанный коэффициент корреляции, который составил 0,999. Примеры хро-матограмм извлечений из калибровочных стандартов представлены на рисунке 4.
Рисунок 3 - Калибровочный график методики количественного определения мономека-
ина в плазме крови
—--—
~ 8 ~
mAU
а
mAU
б
Рисунок 4 - Хроматограммы извлечений из калибровочных стандартов с концентрацией мономекаина 0,09 мкг/мл (а) и 2,65 мкг/мл (б)
Правильность и прецизионность разработанной методики определяли с помощью анализа образцов контроля качества с концентрацией 0,09 мкг/мл (НПКО); 0,27 мкг/мл (низкий
уровень); 2,18 мкг/мл (средний уровень); 4,36 мкг/мл (высокий уровень). Результаты вали-дации представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Правильность и прецизионность методики количественного определения мономекаина
в плазме крови методом ВЭЖХ (n=6)
Концентрация мономекаина в модельной смеси, мкг/мл Рассчитанная концентрация, мкг/мл X ср. ± SD RSD (%) e (%)
0,09 0,084 0,088± 0,004 4,SS -2,22
0,091
0,087
0,084
0,089
0,093
0,27 0,29 0,28± 0,02 7,14 3,70
0,26
0,31
0,26
0,25
0,29
—--—
~ 9 ~
2,18 2,33 2,15 2,29 2,13 2,21 2,19 2,22± 0,08 3,60 1,83
4,36 4,48 4,38± 0,19 4,34 0,46
4,38
4,60
4,11
4,50
4,22
Рассчитанные величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (£,%) не превышают 15%, что свидетельствует о соответствии требованиям, которые предъявляются к биоаналитическим методикам [4].
Выводы. Разработана методика количественного определения мономекаина в плазме крови методом ВЭЖХ. Результаты ва-лидации продемонстрировали специфичность предложенных хроматографических условий, а также приемлемые показатели линейности, правильности и прецизионности методики.
—--—
~ 10 ~
