CC BY
37
DEVELOPMENT OF FLAVONOIDS QUANTITATIVE DETERMINATION METHOD IN GLYCYRRHIZA PALLIDIFLORA HERB (GLYCYRRHIZA PALLIDIFLORA MAXIM.;
Pinchuk1 L.G., Maltseva1 E.M., Egorova21 I.N.
1 Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russian Federation
2The Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry of SB RAS (Institute ofHuman Ecology of the SB RAS), Kemerovo, Russian Federation
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ СОЛОДКИ БЛЕДНОЦВЕТКОВОЙ (GLYCYRRHIZA PALLIDIFLORA MAXIM.)
Пинчук1 Л.Г., Мальцева1 Е.М., Егорова21 И.Н.
1ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет», г. Кемерово, Российская Федерация 2Институт экологии человека ФИЦ УУХ СО РАН, г. Кемерово, Российская Федерация
a fV This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License ^ ^NSf by https://creativecommons.Org/licenses/by/4.0/
* i ПН RESEARCH ARTICLE | НАУЧНАЯ СТАТЬЯ ^ ©Pinchuk LG., Maltseva E.M., Egorova I.N., 2021
dj -i ) http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2021-23-5-29-34
L •ЩТ Y / Ч Принята 20.05.2021 | Accepted 20.05.2021
УДК 615.322:582.736
Abstract. The licorice genus (Glycyrrhiza L.) plants are widely used in conventional and traditional medicine in different countries around the world. The genus includes about 15 species, but only three of them - G. glabra, G. uralensis and G. inflata are well studied and included in the Europe and Asia pharmacopoeias. Pale-flowered licorice (Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.) is a perennial herbaceous plant from the false (not sweet) licorice section (Pseudoglycyrrhiza Krug.), which do not accumulate glycyrrhizin derivatives. This East Asian species grows in the Russian Far East. The distribution area of G. pallidiflora is limited. Only a few of its geographically isolated habitats are known: within the Khabarovsk city, near the Sarapulskoe village (Lower Amur) and in the Primorsky Kray on the Ryabokon Peninsula on the Lake Hanka southeastern coast. The G. pallidiflora successful introduction on the Kemerovo region-Kuzbass territory has been carried out over the past 5 years in the "Apothecary garden" territory of the Kuzbass Botanical Garden of the
Аннотация. Растения рода солодок (Glycyrrhiza L.) широко применяются в традиционной и народной медицине разных стран мира. Род насчитывает около 15 видов, но только три их них - G. glabra, G. uralensis и G. inflata хорошо изучены и включены в фармакопеи стран Европы и Азии. Солодка бледноцветковая (Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.) -многолетние травянистое растение из раздела ложных (не сладких) солодок Pseudoglycyrrhiza Krug., не накапливающих производные глицирризина. Этот восточноазиатский вид произрастает на российском Дальнем Востоке. Ареал распространения G. pallidiflora ограничен. Известно только несколько её географически обособленных местообитаний в пределах г. Хабаровска, у села Сарапульское (Нижний Амур) и в Приморском крае на полуострове Рябоконь на юго-восточном побережье оз. Ханка. Успешная интродукция G. pallidiflora на территории Кемеровской области-Кузбасса ведется на
Institute of Human Ecology, FRC UUH SB RAS, Kemerovo. Currently, the scientific literature contains limited information on the composition and quantitative content of biologically active compounds (BAC) in the aerial part of G. pallidiflora. Therefore, the main task is to conduct phytochemical studies of the main classes of BAC, which have a pronounced pharmacological activity. We have proposed the amount of flavonoids quantitative determination method in the pale-flowered licorice herb, introduced in Kuzbass, by the differential spectrophotometry method, based on aluminum (III) chloride complexation reaction. The flavonoids extraction conditions from raw materials have been studied. They depend on the ethyl alcohol concentration, the plant raw materials grinding degree, the extraction time, and the raw materials and extractants ratio. The optimal extraction conditions were selected and a quantitative determination method was developed. On the base of it was established that the amount offlavonoids content in the herb of pale-flowered licorice (Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.), in terms of rutin, is from 2.25 ± 0.38% to 2.44 ± 0, 04%. The relative error of the proposed method is ± 3.21%.
Keywords: pale-flowered licorice (Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.), flavonoids, spectrophotometry, quantitative determination.
REFERENCES
[1] Liu J.H., Yang S.S., Fu Y.Q., Yuan C.L., Liu B. Studies on chemical constituents from Glycyrrhiza pallidiflora Maxim. // Acta pharmaceutica Sinica. 1990. 25(9). P.689-93.
[2] Shults EE, Shakirov MM, Pokrovsky MA, Petrova TN, Pokrovsky AG, Gorovoy PG. Phenolic compounds from Glycyrrhiza pallidiflora Maxim. and their cytotoxic activity. // Nat Prod Res. 2017. 31(4). Р. 445-452. doi: 10.1080/14786419.2016.1188094.
[3] Russia plant resources: wild-growing flowering plants, its component composition and biological activity. V.3. Fabaceae - Apiaceae Family / Executive editor Budantsev A. L. - St. Petersburg; М.: KMK Scientific Press Ltd, 2010. p. 40 - 41.
протяжении последних 5 лет на территории «Аптекарского огорода» Кузбасского ботанического сада Института экологии человека ФИЦ УУХ СО РАН, г. Кемерово. В настоящее время в научной литературе имеются ограниченные сведения о составе и количественном содержании биологически активных соединений (БАС) в надземной части G. pallidiflora. Поэтому основной задачей является проведение фитохимических исследований основных классов БАС, обладающих выраженной фармакологической активностью. Нами предложена методика количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки бледноцветковой, интродуцированной в Кузбассе, методом дифференциальной спектрофотомерии, основанной на реакции комплексообразования с алюминия (III) хлоридом. Изучены условия извлечения флавоноидов из сырья, которые зависят от концентрации спирта этилового, степени измельчённости растительного сырья, времени экстракции, а также соотношения сырья и экстрагента. Выбраны оптимальные условия экстракции и разработана методика количественного определения, на основании которой установлено, что содержание суммы флавоноидов в траве солодки бледноцветковой (Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.) в пересчете на рутин составляет от 2,25 ± 0,38% до 2,44 ±0,04%. Относительная ошибка предложенной методики ±3,21 %.
Ключевые слова: солодка бледноцветковая (Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.), флавоноиды, спектрофотометрия, количественное определение.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Liu J.H., Yang S.S., Fu Y.Q., Yuan C.L., Liu B. Studies on chemical constituents from Glycyrrhiza pallidiflora Maxim. // Acta pharmaceutica Sinica. 1990. 25(9). P.689-93.
[2] Shults EE, Shakirov MM, Pokrovsky MA, Petrova TN, Pokrovsky AG, Gorovoy PG. Phenolic compounds from Glycyrrhiza pallidiflora Maxim. and their cytotoxic activity. // Nat Prod Res. 2017. 31(4). Р. 445-452. doi: 10.1080/14786419.2016.1188094.
[3] Растительные ресурсы России: дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т.3. Семейства Fabaceae - Apiaceae / Отв. ред. Буданцев А.Л. -СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2010. С. 40 - 41.
Authors Contribution - Pinchuk L.G. - biologically active compounds qualitative and quantitative content determination in raw materials, statistical processing of data, writing an article; Maltseva E.M. - research concept and design, writing an article; Egorova I. N. - research concept and design, raw materials samples collection, writing an article.
Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest. Pinchuk L.G. - SPIN ID: 4491-5210; ORCID ID: 0000-0002-3174-9407
Research interests, number of main publications: biochemical aspects of adaptive technologies for growing plants; research of the biologically active compounds isolation and analysis from medicinal plant raw materials, more than 180 works were published, 6 of them in Scopus, 45 n the Higher Attestation Commission.
Maltseva E.M. - SPIN ID: 1687-9895; ORCID ID: 0000-0003-4874-3420
Research interests, number of main publications: research of the isolation, analysis and antioxidant activity methods ofplant polyphenolic compounds, more than 41 works were published, 6 of them in Scopus, 1 of them in WoS, 16 in the Higher Attestation Commission.
Egorova I. N. - SPIN ID: 4409-3786; ORCID ID: 0000-0002-0559-3154
Research interests, number of main publications: Kuzbass medicinal plants research, ecological and hygienic assessment of medicinal raw materials quality in areas with increased anthropogenic stress, more than 69 works were published, 9 of them in Scopus, 1 of them in WoS, 25 in the Higher Attestation Commission.
Вклад авторов. - Пинчук Л.Г. - определение качественного и количественного содержания биологически активных соединений в сырье, статистическая обработка данных, написание статьи; Мальцева Е.М. -концепция и дизайн исследования, написание статьи; Егорова И.Н. - обзор литературы, интродукция и сбор образцов сырья, написание статьи.
Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Пинчук Л. Г. - SPIN ID: 4491-5210; ORCID ID: 0000-0002-3174-9407
Сфера научных интересов, количество основных публикаций: биохимические аспекты адаптивных технологий выращивания растений, изучение методов выделения и анализа биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья, опубликованы более 180 публикаций из них 6 в Scopus, 45 в ВАК.
Мальцева Е. М. - SPIN ID: 1687-9895; ORCID ID: 0000-0003-4874-3420
Сфера научных интересов, количество основных публикаций: изучение методов выделения, анализа и антиоксидантной активности растительных полифенольных соединений, опубликованы более 41 публикации из них 6 в Scopus, 1 в WoS, 16 в ВАК.
Егорова И. Н. - SPIN ID: 4409-3786; ORCID ID: 0000-0002-0559-3154
Сфера научных интересов, количество основных публикаций: изучение лекарственной флоры Кузбасса, эколого-гигиеническая оценка качества лекарственного растительного сырья на территории с повышенной антропогенной нагрузкой, опубликованы более 64 публикаций из них 9 в Scopus, 1 в WoS, 23 в ВАК.
For citation: Pinchuk L.G., Maltseva E.M., Egorova I.N. DEVELOPMENT OF FLAVONOIDS QUANTITATIVE DETERMINATION METHOD IN GLYCYRRHIZA PALLIDIFLORA HERB (GLYCYRRHIZA PALLIDIFLORA MAXIM.) // Medical & pharmaceutical journal "Pulse". - 2021. - Vol. 23. - №5. - С. 29-34. doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2021-23-5-29-34.
Для цитирования: Пинчук Л.Г., Мальцева Е.М., Егорова И.Н. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ СОЛОДКИ БЛЕДНОЦВЕТКОВОЙ (GLYCYRRHIZA PALLIDIFLORA MAXIM.) // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". - 2021. - Т. 23. - №5. - С. 29-34. doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2021-23-5-29-34.
Работа выполнена в рамках реализации государственного задания ФИЦ УУХ СО РАН (проект №0286-2021-0010).
Введение. Интерес исследователей к изучению растений, относящихся к роду солодок (Glycyrrhiza L.) сем. Fabaceae (бобовые), связан с накоплением ими биологически активных соединений (БАС), обладающих выраженной фармакологической активностью. Солодка бледноцветковая (Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.j произрастает на российском Дальнем Востоке и является единственный представителем рода Glycyrrhiza L. в данном регионе. Генетические исследования (Hayashi H., 1994) позволили
отнести данный вид к разделу ложных солодок Pseudoglycyrrhiza Krug. (не сладкие солодки), которые продуцируют производные
тритерпенового сапонина македонозида С и не производят глицирризин.
Первые научные публикации китайских ученых 1990-1994 гг. были посвящены изучению БАС в корнях G. pallidiflora. Liu J.H. et al. впервые обнаружили производные македониковой кислоты и изофлавона, а также новый флавоноид - паллидифлорин [1]. К настоящему времени из
корней G. pallidiflora выделено 21 фенольное соединение, включающее дигидрокоричную кислоту, изофлавоноиды, флавоноиды, куместаны, птерокарпаны, халконы, изофлаваны и изофлавены [2]. Так как G. pallidiflora формирует значительную надземную биомассу уже на второй-третий год вегетации, изучение накопления, идентификация и количественное определения БАС в траве является важной задачей. По данным [3] в листьях и цветках G. pallidiflora найдены флавоноиды (кверцетин, кемпферол, апигенин). Однако, данных о количественном содержании флавоноидов в надземной части G. pallidiflora в литературе не найдено.
Цель исследования заключалась в разработке спектрофотометрического метода
количественного определения суммы
флавоноидов в траве солодки бледноцветковой (G. pallidiflora Maxim..), выращенной на территории Кузбасского ботанического сада.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования служили образцы сырья травы солодки бледноцветковой, выращенной на опытном участке «Аптекарского огорода» Кузбасского ботанического сада. Траву заготавливали в июле в фазу цветения в 2016 -2019 гг., высушивали воздушно-теневым способом. Влажность сырья определяли на анализаторе влажности МВ23 / МВ25 (OHAUS Corporation, США).
Спектры поглощения определяли с помощью спектрофотометра СФ-2000 (Россия), оптическую плотность исследуемых растворов на спектрофотометре КФК -3 в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Все анализы выполнялись в трехкратной повторности, данные обрабатывались с использованием стандартных
статистических методов, с применением пакетов MS Excel и STATISTICA 6.0.
Результаты исследования и их обсуждение. На
первом этапе исследования были изучены спектральные характеристики комплекса 2 % спиртового раствора А1С1з с водно-спиртовым извлечением из травы солодки бледноцветковой. Сопоставление дифференциальных спектров изучаемого водно-спиртового извлечения и СО рутина показало их совпадение при длине волны 408±2нм. На основании чего в качестве стандартного образца для определения суммы флавоноидов в изучаемом растительном сырье использовали рутин.
При разработке методики
количественного определения суммы
флавоноидов в траве солодки бледноцветковой на втором этапе исследований изучали условия их экстракции в зависимости от концентрации спирта этилового, степени измельчённости растительного сырья, времени экстракции и соотношения сырья и экстрагента.
Влияние концентрации спирта этилового на сумму извлекаемых флавоноидов из травы солодки бледноцветковой определяли на образцах сырья размером частиц 0,5 см с соотношением сырьё - экстрагент 1: 50 при нагревании на водяной бане 60 минут и предварительном настаивании при комнатной температуре в течение 60 минут. Установлено, что при экстракции концентрацией этанола в интервале 30 - 90 % массовая доля суммы флавоноидов колебалась от 1,27 до 2,44 %, достигая максимума при извлечении 70 %-ным этанолом несколько снижаясь при экстракции 80 %-ным и особенно, 90 % -ным этанолом (таблица 1).
Таблица 1
Влияние концентрации спирта этилового на полноту экстракции флавоноидов из травы
солодки бледноцветковой
Концентрация спирта этилового, % Сумма флавоноидов (в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье), %
30 1,27 ± 0,01
40 1,99 ± 0,15
50 1,68 ± 0,41
60 1,61 ± 0,38
70 2,44 ± 0,04
80 2,21 ± 0,40
90 1,52 ± 0,01
Table 1
Ethyl alcohol concentration influence on flavonoid extraction completeness from pale-flowered licorice
herb
Ethyl alcohol concentration, % Amount of flavonoids (in terms of rutin and absolutely dry raw materials), %
30 1,27 ± 0,01
40 1,99 ± 0,15
50 1,68 ± 0,41
60 1,61 ± 0,38
70 2,44 ± 0,04
80 2,21 ± 0,40
90 1,52 ± 0,01
Данную закономерность зависимости выхода флавоноидов можно объяснить тем, что большая часть суммы флавоноидов травы солодки бледноцветковой представлена агликонами, плохо растворимыми в спирте этиловом низких концентраций.
При изучении зависимости выхода флавоноидов от размера частиц сырья, его просеивали через сита с диаметром отверстий от 0,5 до 5,0 мм. В извлечениях, полученных 70 % спиртом этиловым, максимальное содержание флавоноидов выявлено при измельчении травы солодки бледноцветковой до частиц размером 0,5 мм. При увеличении размера частиц до 1 мм количество извлекаемых флавоноидов уменьшилось на 40 %. Наименьшее содержание флавоноидов - 0,60 ± 0,05 % наблюдалось при измельчении частиц сырья до размера 5,0 мм.
Выход флавоноидов зависел и от времени экстракции. Максимальное извлечение было достигнуто при нагревании на водяной бане продолжительностью 60 минут с предварительным выдерживанием сырья с экстрагентом при комнатной температуре в течение 60 минут. При этом сумма извлеченных флавоноидов составила 2,44± 0,04 %. Увеличение продолжительности нагревания до 90 и 120 минут приводило к резкому снижению выхода флавоноидов 1,72± 0,19% и 1,64 ± 0,07% соответственно. Уменьшение времени экстракции до 30 минут также негативно сказывалось на содержании флавоноидов, которое составило 2,21 ± 0,15%
Зависимость выхода флавоноидов от соотношения сырья и экстрагента изучали на образцах сырья, измельченного до размера частиц 0,5 мм, экстрагент 70 % спирт этиловый, при экстракции путем нагревания на водяной бане продолжительностью 60 минут. Наибольший выход флавоноидов наблюдался при
соотношении сырьё- экстрагент 1 : 50 и составил 2,44 ±0,04%. При экстракции флавоноидов при соотношении сырья и экстрагента 1:25 и 1:30 наблюдалось снижение концентрации целевых БАС в 1,5 раза. Увеличение соотношения до 1:100 приводит к незначительной потере флавоноидов, их количество в извлечении составляет в среднем 2,18 ± 0,43%
Исходя из полученных данных оптимизирована методика количественного определения суммы флавоноидов для анализа травы солодки бледноцветковой.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки бледноцветковой. Анализируемую пробу сырья измельчали до размера частиц, отсеиваемых через сито с отверстиями диаметром 0,5 мм. 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья, помещали в колбу емкостью 250 мм, заливали 100 мл 70 % спирта этилового и выдерживали при комнатной температуре в течение 60 минут. После чего нагревали на кипящей водяной бане водяной бане с обратным холодильником 60 минут. После охлаждения фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем до метки 70 % спиртом этиловым (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл раствора А, прибавляли 5 мл 2 % спиртового раствора AlCb, объём раствора доводили до метки спиртом этиловым 96 % и перемешивали. Через 30 минут измеряли оптическую плотность полученного раствора на ФЭК КФК-3 при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 1 мл раствора А, 0,1 мл раствора уксусной кислоты ледяной, доведенный спиртом этиловым 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Раствор стандартного образца (СО) рутина готовили следующим образом: 0,05 г (точная навеска) СО рутина, доведенного до постоянной массы при температуре 130 - 135оС растворяли в 80 мл 95 % спирта этилового в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждали и доводили до метки тем же растворителем (раствор Б). Параллельно измеряли оптическую плотность раствора Б СО рутина, приготовленного в тех же условиях.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырьё, выраженное в процентах (Х%) вычисляли по формуле:
„. Ах X а0 Х100 100
Х % = -0-X- ,
А0Х а Xl (100-W) '
где Ах - оптическая плотность испытуемого раствора; а - навеска сырья, г; а0 - навеска СО рутина; W - влажность сырья, %; l - толщина поглощающего слоя, в см.
С помощью разработанной методики количественного определения суммы
флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии в траве солодки бледноцветковой были проведены независимые определения одиннадцати образцов сырья. Статистическая обработка полученных данных показала, что ошибка методики составляет ±3,21 %, при средней сумме флавоноидов 2,41 % и граничных значениях доверительного интервале среднего результата 0,07. Содержание флавоноидов в траве солодки бледноцветковой варьировало в пределах от 2,25 % до 2,64 %. Это дает основание предложить в качестве нижнего предела показатель содержания суммы флавоноидов не менее 2,0 %.
Выводы. На основании изучения условий экстракции разработана методика
количественного определения суммы
флавоноидов в траве солодки бледноцветковой в пересчете на рутин. Относительная ошибка методики составила ±3,21 %. Установлено, что образцы травы солодки бледноцветковой, интродуцированной в Кузбассе, содержат около 2,5 % флавоноидов в пересчете на рутин.
Corresponding Author: Egorova Irina Nikolayevna, Senior Researcher at the Reclamation and Biomonitoring Laboratory of Institute of Human Ecology of the Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry of Siberian Branch Russian Academy of Science
E-mail: [email protected]
Ответственный за переписку: Егорова Ирина Николаевна -кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории рекультивации и биомониторинга ИЭЧ ФИЦ УУХ СО РАН, г. Кемерово, Российская Федерация
E-mail: [email protected]
