CC BY
32
DOI: 10.21055/0370-1069-2020-3-139-145
УДК 616.98:579.842.23
Е.В. сазанова, Т.А. малюкова, Ю.А. Попов, м.н. ляпин
разработка методических подходов и критериев для отнесения учебных штаммов yersinia pestis к iii группе патогенности (опасности)
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация
цель исследования - выбор критериев и методических подходов для перевода авирулентных штаммов возбудителя чумы из I группы патогенности (опасности) в III группу. материалы и методы. Проанализированы отечественные и зарубежные нормативные, методические документы, научные публикации в области лабораторной диагностики чумы и обеспечения биобезопасности работ с патогенными биологическими агентами. результаты и обсуждение. Обоснован комплекс критериев для перевода штаммов Y. pestis из I группы в III группу патогенности, а также определены методы их оценки. Установлено наличие оснований для перевода в III группу патогенности ряда авирулентных штаммов Y. pestis, которые включены в учебный набор, сформированный для освоения модуля «Микробиология и лабораторная диагностика чумы». Продемонстрирована целесообразность комбинирования регламентированных методов оценки патогенных свойств чумного микроба с дополнительными, в частности, изучением цитотоксичности штаммов Y. pestis в отношении лейкоцитов цельной крови человека in vitro. оценка вирулентности штамма Y. pestis должна опираться на комплексную характеристику основных факторов патогенности с помощью современных молекулярно-генетических методов исследования, данных о фенотипи-ческих проявлениях их функционирования, а также степени патогенности для чувствительных лабораторных животных. Актуальной задачей является пересмотр используемых количественных показателей для дифференциации штаммов чумного микроба по вирулентности с учетом показателя LD50 штамма Y. pestis EV НИИЭГ.
Ключевые слова: возбудитель чумы, группы патогенности (опасности), биологическая безопасность, учебные штаммы.
Корреспондирующий автор: Сазанова Елена Владимировна, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
Для цитирования: Сазанова Е.В., Малюкова Т.А., Попов Ю.А., Ляпин М.Н. Разработка методических подходов и критериев для отнесения учебных штаммов Yersinia рestis к III группе патогенности (опасности). Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 3:139-145. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-3-139-145
Поступила 21.11.19. Отправлена на доработку 09.01.20. Принята к публ. 16.01.20.
E.V. Sazanova, T.A. Malyukova, Yu.A. Popova, M.N. Lyapin
Development of Methodological Approaches and Criteria to Classify Yersinia pestis Training Strains as an Agent of Pathogenicity (Hazard) Group III
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Abstract. Objective of the study was to select the criteria and methodological approaches to reclassify avirulent strains of plague agent from pathogenicity (hazard) group I into pathogenicity group III. Materials and methods. We have reviewed domestic and foreign normative, methodological documents, scientific publications in the field of laboratory diagnostics of plague and biosafety provision while working with pathogenic biological agents. Results and discussion. A complex of criteria for reclassification of Y. pestis strains from hazard group I into hazard group III has been substantiated; the methods for their assessment identified. Validation has revealed the grounds for reassignment of a number of avirulent Y. pestis strains included into the training kit which is compiled for mastering the training module "Microbiology and laboratory diagnostics of plague" into pathogenicity group III. We have demonstrated the feasibility of combining the structured methods of assessment of pathogenic properties in plague microbe with additional informative ones; in particular, evaluation of cytotoxicity of Y. pestis strains in relation to leucocytes of whole human blood in vitro. Analysis of a strain virulence should be built on complex characterization of major pathogenicity factors using advanced molecular-genetic research methods, the data on phenotypic manifestations of their functioning, as well as the level of pathogenicity for sensitive laboratory animals. The review of the utilized quantitative indicators for differentiation of plague microbe strains by virulence taking into account LD50 values for Y. pestis EV NIIEG strain is a relevant task. It is practical to supplement the complex approach with informative research methods, notably, characterization of strain cytotoxicity which shows high correlation with virulence criterion LD50.
Key words: plague agent, pathogenicity (hazard) groups, biological safety, strains used for training.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Elena V. Sazanova, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
Citation: Sazanova E.V., Malyukova T.A., Popova Yu.A., Lyapin M.N. Development of Methodological Approaches and Criteria to Classify Yersinia pestis Training Strains as an Agent of Pathogenicity (Hazard) Group III. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; 3:139-145. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2020-3-139-145
Received 21.11.19. Revised 09.01.20. Accepted 16.01.20.
Sazanova E.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9140-3910
Malyukova T.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5629-4111
Popova Yu.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7641-6334
Одним из основных методов получения информации при эпидемиологическом мониторинге 11 природных очагов чумы на территории Российской Федерации, согласно действующим нормативно-методическим документам по санитарной охране территории МУ 3.1.3.2355-08 и профилактике чумы СП 3.1.7.3465-17, является лабораторное исследование носителей и переносчиков чумного микроба, больных людей, животных и объектов окружающей среды. В соответствии с национальной «Классификацией биологических агентов, вызывающих болезни человека, по группам патогенности», представленной в санитарно-эпидемиологических правилах по безопасности работ с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности) СП 1.3.3118-13, возбудитель чумы отнесен в I группу патогенности (опасности). Персонал лабораторий, выполняющий индикацию и идентификацию чумного микроба, должен иметь допуск к работе с микроорганизмами данной группы. Одним из основных условий допуска является прохождение профессиональной переподготовки с освоением методов безопасной работы. При обучении микробиологическим методам лабораторной диагностики чумы используют штаммы Y pestis с различной вирулентностью, в том числе высоковирулентный Y. pestis 231(708), что повышает вероятность инфицирования обучающихся. вместе с тем в Указе Президента российской Федерации от 11 марта 2019 г. № 97 одним из приоритетных направлений государственной политики в области обеспечения биобезопасности на период до 2025 г. и дальнейшую перспективу является исключение или максимальное снижение использования в технологических процессах патогенных микроорганизмов. Задача актуальна и при обучении специалистов лабораторной диагностике особо опасных инфекций.
в настоящее время для освоения учебного модуля «микробиология и лабораторная диагностика чумы» применяют лишь один авирулентный штамм чумного микроба - Y pestis EV НИИЭГ. Данный штамм используется для вакцинации людей; в соответствии с национальной классификацией отнесен к III группе патогенности, то есть характеризуется средней степенью опасности и в обычных условиях не представляет угрозы для работников лабораторий и населения. Другие штаммы Y pestis, в том числе природные с установленными авирулентными свойствами и генно-инженерно-модифицированные, лишенные ведущих факторов патогенности, продолжают находиться в I группе патогенности [1, 2]. необходимо заметить, что в российской Федерации подход к дифференцировке штаммов микроорганизмов одного вида по группам патогенности регламентирован (СП 1.3.3118-13) только для вакцинных штаммов I-III групп патогенности (опасности) и отдельных штаммов Vibrio cholerae и Escherichia coli. При этом отсутствуют критерии и подходы, позволяющие отнести некоторые авирулентные (кроме вакцинных) штаммы Y. pestis к III группе патогенности.
Цель исследования - выбор критериев и методических подходов для перевода авирулентных штаммов возбудителя чумы из I группы патогенно-сти (опасности) в III группу.
Материалы и методы
Проанализированы отечественные и зарубежные нормативные и методические документы, а также научные публикации в области лабораторной диагностики чумы и обеспечения биобезопасности работ с патогенными биологическими агентами.
Результаты и обсуждение
В процессе анализа действующих санитарно-эпидемиологических правил по безопасности работ с ПБА I-II групп СП 1.3.3118-13, ряда зарубежных руководств и научных публикаций по обеспечению биобезопасности работ с микроорганизмами в лабораториях обнаружены данные об отнесении штаммов микроорганизмов одного вида к разным группам патогенности (табл. 1) [3-5], а также алгоритм изменения группы патогенности, в частности по причине снижения вирулентности или утраты известных генов вирулентности [6].
В действующей на территории Российской Федерации классификации ПБА для аттенуиро-ванных штаммов микроорганизмов I-II групп па-тогенности предусмотрен отдельный подход. При паспортизации их включают в III группу патогенно-сти. Реально это используют для вакцинных штаммов Y pestis EV НИИЭГ, Brucella abortus 19 ВА, Francisella tularensis 15 НИИЭГ, Bacillus anthracis СТИ-1, но не распространяют на другие авирулент-ные штаммы данных видов.
Следует отметить, что в санитарно-эпидемиологических правилах СП 1.3.3118-13 приведены критерии, которые могут быть основанием для пересмотра классификации биологических агентов, а именно новые научные данные относительно па-тогенности, путей передачи, круга хозяев, методов, а также средств профилактики и лечения. Вместе с тем из установленных критериев преимущественно учитывают риск заражения человека, пути и вероятность передачи возбудителя инфекции от больного человека или объектов окружающей среды, тяжесть клинических проявлений, вероятность летального исхода, а также наличие эффективных мер и средств защиты, профилактики и лечения. При этом, в отличие от зарубежных документов [3, 6], не учитывают современные характеристики конкретных штаммов по основным факторам патогенности. Исключением являются некоторые штаммы Vibrio cholerae и Escherichia coli. В частности, критериями для отнесения штаммов Vibrio choleraе к более безопасной (III) группе патогенности является отсутствие продукции токсина ctx (СП 1.3.3118-13), штаммов Escherichia coli - отсутствие продукции веротоксина
Таблица 1 / Table 1
отнесение штаммов микроорганизмов одного вида к группам патогенности (опасности) Assignment of microorganism strains of the same species to pathogenicity (hazard) groups
Название вида Species Группа патогенности (опасности) Pathogenicity (hazard) group
Российская Федерация [СП 1.3.3118-13] * Russian Federation [Sanitary Regulations (SR) 1.3.3118-13] * NIH [3] * UK [6] *
Yersinia pestis I группа - штаммы Y pestis Group I - Y. pestis strains 3** группа - штаммы Y. pestis (кроме включенных во 2-ю группу) Group 3** - Y. pestis strains (excluding strains from Group II) 3** группа - штаммы Y pestis Group 3** - Y. pestis strains
III группа - штамм Y. pestis EV НИИЭГ Group III - Y. pestis EV NIIEG strain 2** группа - штаммы Y. pestis pgm- (лишенные области пигментации 102 kb) и штаммы lcr- (лишенные плазмиды LCR) Group 2** - Y. pestis strains pgm- (deprived of pigmentation region of 102kb) and lcr- strains (deprived of LCR plasmid)
Vibrio cholerae II группа - V. cholerae токсигенный, rtx B+ Group II - toxigenic V. cholerae, ctxB+ 2** группа - штаммы V. cholerae Group 2** - V. cholerae strains 2** группа - штаммы V. cholerae токсигенные (включая El Tor) Group 2** - V. cholerae strains
III группа - V. cholerae О1 не токсигенный; V. cholerae non О1(О139) не токсигенный Group III - non-toxigenic V. cholerae О1; non-toxigenic V. cholerae non О1(О139)
Brucella II группа - В. melitensis, abortus, suis, ovis, neotomae, canis, ceti, pinnipedialis, microti Group II - В. melitensis, abortus, suis, ovis, neotomae, canis, ceti, pinnipedialis, microti 3** группа - Brucella, включая abortus, canis, suis Group 3** - Brucella, including abortus, canis, suis 3** группа - штаммы B. abortus, canis, suis, me-litensis Group 3 - B. abortus, canis, suis, melitensis strains
III группа - B. abortus 19 BA Group III - B. abortus 19 BA
Francisella tula-rensis II группа - штаммы F. tularensis Group II - F. tularensis strains 3** группа - штаммы F. tularensis (кроме включенных во 2-ю группу) Group 3** - F. tularensis strains (except for strains included in Group 2) 3** группа - штаммы F. tularensis тип А Group 3** - F. tularensis type A strains
III группа - штамм F. tularensis 15 НИИЭГ Group III - F. tularensis 15 NIIEG strain 2** группа - F. tularensis ssp. novicida штамм Utah 112; F. tularensis ssp. holarctica штамм LVS; F. tularensis bv. tularensis штамм В-38 Group 2** - F. tularensis ssp. novicida strain Utah 112; F. tularensis ssp. holarctica strain LVS; F. tularensis bv. tularensis strain В-38 2** группа - штаммы F. tularensis тип В Group 2** - F. tularensis type B strains
Escherichia coli II группа - штаммы E. coli O157:H7, 0104:H4 и другие серотипы - продуценты веротоксина Group II - E. coli strains O157:H7, 0104:H4 and other serotypes - producers of verotoxin 2** группа - все энтеропатогенные, энтеротоксигенные, энтероинвазивные штаммы, включая E. coli O157:H7 и штаммы с К1 Group 2** - all enteropathogenic, enterotoxigenic, entroinva-sive strains, including E. coli O157:H7 and strains with К1 3** группа - штаммы E. coli O157:H7, 0103 -продуценты веротоксина Group 3** - E. coli O157:H7, 0103 strains - producers of verotoxin
IV группа - штаммы E. coli Group IV - E. coli strains 1** группа - штамм E. coli К-12, если (1) не обладает полным ЛПС (т.е. не содержит O-антигена); (2) не содержит активных факторов вирулентности (например, токсинов) или факторов колонизации и генов, кодирующих эти факторы Group 1** - E. coli strains K-12, if (1) does not have complete LPS (i.e. does not contain O-antigen); (2) does not have active virulence factors (for instance, toxins) or colonization factors and genes encoding these factors 2** группа - E. coli, кроме непатогенных штаммов Group 2** - E. coli, except for non-pathogenic strains
Bacillus anthracis II группа - штаммы B. anthracis Group II - B. anthracis strains 2** группа - штаммы B. anthracis Group 2** - B. anthracis strains 3** группа - штаммы B. anthracis Group 3** - B. anthracis strains
III группа - штамм B. anthracis СТИ-1 Group III - B. anthracis STI-1 strain
* - ссылки на источники литературы.
** - нумерация групп патогенности, принятая ВОЗ и рядом зарубежных стран.
* - references.
** - numbering of pathogenicity groups adopted by WHO and a some foreign states.
или факторов колонизации или генов, их кодирующих, а также полного ЛПС [СП 1.3.3118-13, 3, 6]. Однако в отечественных нормативно-методических документах и литературных источниках не обнаружено критериев для изменения группы патогенности
авирулентных штаммов возбудителя чумы. Вместе с тем за рубежом имеется опыт перевода в другую группу патогенности штаммов Y pestis, лишенных области пигментации 102 т.п.н. (pgm-) и плазмиды pCad (lcrV-) [3].
В настоящее время накоплены обширные научные данные, позволяющие на уровне генома оценить вирулентные свойства штаммов Y pestis. Как известно, вирулентность - индивидуальный признак отдельного штамма, а мера ее проявляется в способности микроорганизма проникать в органы и ткани, размножаться в них, вырабатывать вещества, которые могут подавлять защитные силы макроорганизма [7]. Присутствие всего комплекса продуцируемых факторов и генов, их кодирующих, свидетельствует о потенциально высокой вирулентности штамма микроорганизма. Отсутствие одного или нескольких факторов приводит к снижению или авирулентности штаммов.
ведущее значение в реализации вирулентных свойств Y. pestis имеют гены, локализованные на плаз-миде pCad и хромосомной «области пигментации». отсутствие в геноме хотя бы одной из основных детерминант патогенности (плазмиды pCad или области pgm) приводит к авирулентности штамма [8-12].
Для выявления факторов патогенности используют микробиологический, молекулярно-гене-тические и биологический методы, регламентированные в МУ 4.2.2940-11. Микробиологический метод обеспечивает возможность фенотипически выявить функционирование основных факторов па-тогенности. культивирование штаммов Y. pestis на магниево-оксалатном агаре позволяет оценить наличие плазмиды кальцийзависимости (Cad-фенотип) в геноме возбудителя чумы, установить ее функционирование и, как следствие, дифференцировать потенциально вирулентные штаммы (Cad+) от авирулентных (Cad). Потенциально вирулентные штаммы демонстрируют рост клеток чумного микроба только при 28 °C, авирулентные - при 37 °C. Выявление признака пигментсорбции (Pgm-фенотип) косвенно свидетельствует о наличии и функционировании генов hms оперона. Потенциально вирулентные штаммы Y. pestis проявляют способность формировать при культивировании на питательной среде с геми-ном (среда Джексона-Берроуза) мелкие пигментированные колонии (Pgm+), а авирулентные - более крупные, бесцветные (Pgm).
Современные молекулярно-генетические методы позволяют получать информацию о генах, кодирующих биологические свойства [13]. В лабораторной диагностике чумы широко практикуют ПЦР, результаты которой дают возможность установить наличие или отсутствие генов, ассоциированных с вирулентностью и, как следствие, дифференцировать штаммы на потенциально вирулентные или авирулентные [14]. Такими ДНК-мишенями ПЦР-анализа являются гены ybt-региона, irp2 - острова HPI; lcrV - плазмида pCad, которая кодирует и другие факторы патогенности, в том числе эффекторные белки Yops [15-16].
однако подтвердить вирулентность штамма и дать ее количественную оценку возможно только применяя биологический метод исследования с использованием высокочувствительных лабораторных
животных [17]. Штаммы основного подвида Y pestis subsp. pestis обладают высокой вирулентностью и эпидемическим потенциалом для людей и грызунов, к ним одинаково чувствительны морские свинки и белые мыши. Штаммы Y pestis неосновных подвидов (ulegeica, hissarica, altaica, caucasica) проявляют избирательную вирулентность - вирулентны для мышей, авирулентны для морских свинок [18]. В настоящее время в Российской Федерации вирулентность характеризуют в соответствии с количественными критериями, полученными при подкожном заражении белых мышей: высоковирулентные штаммы -LD50 от 5 до 10 м.к., слабовирулентные штаммы -LD50 более 1105 м.к., авирулентные штаммы - LD50 более 1-106 м.к. [17].
Принимая во внимание молекулярно-генетические основы вирулентности штаммов Y. pestis, фе-нотипические проявления функционирования основных факторов патогенности, количественное определение вирулентных свойств штаммов с использованием высокочувствительных биопробных животных и требования санитарных правил СП 1.3.3118-13 и МУ 3.4.2552-09, нами был предложен комплекс критериев для отнесения штамма Y pestis к III группе патогенности. А именно:
- авирулентность для белых мышей при подкожном заражении (LD50 более или равна 107 КОЕ). вирулентность штамма не должна превышать LD50 штамма Y pestis EV НИИЭГ, включенного в III группу патогенности, следовательно, в соответствии с действующими МУ 3.31.1113-02 должна быть более или равна 107 КОЕ;
- отсутствие генов, ответственных за выработку основных факторов патогенности (рСаd, область pgm), или одного из них;
- отсутствие фенотипических проявления in vitro продукции основных факторов патогенности (Pgm-, Саd-);
- наличие чувствительности к антибактериальным препаратам, регламентированным (МУ 3.4.255209) для экстренной профилактики и лечения чумы.
Таким образом, предлагаемый методический подход включает комплексное исследование штамма чумного микроба для выявления генов, кодирующих основные детерминанты патогенности, фенотипиче-ских проявлений функционирования данных генов, а также оценку показателя вирулентности (LD50) для белых мышей при подкожном заражении.
разработанный подход апробирован нами на наборе штаммов, сформированном сотрудниками отдела образовательных программ и подготовки специалистов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» для освоения учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика чумы» [19]. В проведенных ранее исследованиях выбор штаммов Y. pestis осуществляли в соответствии с перечнем критериев, обусловленных учебными планами, необходимыми профессиональными компетенциями и правилами обеспечения биобезопасности. Одним из основных критериев,
актуальным для индивидуальной работы слушателей курсов на практических занятиях, обозначена авирулентность. Биологические свойства штаммов
Y pestis учебного набора охарактеризованы с помощью регламентированных методов и зарегистрированных медицинских изделий для in vitro диагностики (табл. 2). В качестве штаммов сравнения использовали вакцинный штамм Y pestis EV НИИЭГ и высоковирулентный штамм Y pestis 231 (708).
в учебный набор входят восемь авирулентных штаммов чумного микроба, у которых по генетическим и фенотипическим характеристикам отсутствуют плазмида рCаd и/или «остров высокой патоген-ности» в составе pgm области хромосомы, а LD50 для белых мышей составляет более 108 КОЕ, а также
Y pestis 652 «Гризель», включающий оба фактора па-тогенности и имеющий LD50, равный 2,15-106 КОЕ. основанием для включения последнего штамма в данный набор явились действующие количественные показатели вирулентности для белых мышей, согласно которым штамм при значении LD50 более
106 КОЕ является авирулентным [18]. До настоящего времени окончательную оценку вирулентности штаммов Т pestis проводят по показателю LD50. Анализ научных публикаций и методических документов выявил отсутствие единых количественных критериев для дифференциации штаммов Т pestis по вирулентности (табл. 3). В то же время результаты определения LD50 зависят от многих факторов - метода заражения, вида животного, его возраста, веса, упитанности и других причин. В связи с этим следует отметить актуальность пересмотра формализованных критериев для дифференциации штаммов чумного микроба по вирулентности с использованием лабораторных животных [17, 18].
В результате оценки 9 авирулентных штаммов чумного микроба, включенных в учебный набор, с применением комплекса критериев для отнесения к III группе патогенности установлено, что:
- критерию «авирулентность для белых мышей» соответствуют 8 штаммов, исключение составил Т pestis 652 «Гризель»;
Таблица 2 / Table 2
результаты оценки патогенных свойств штаммов Y. pestis учебного набора [20] Results of assessment of pathogenic properties in Y. pestis strains from the training kit [20]
Свойства штаммов Штамм Y pestis Y. pestis strain
Properties of strains 231(708) ЕV НИИЭГ EV NIIEG 707 «Касуга» 707 "Kasuga" 521 (2101) А-819 100P6 (36М5) М-1813 КМ 260 (12) КМ-130 (3) 707 «Гризель» 707 "Grizel"
Наличие генов Presence of genes
Генетические особенности Genetic peculiarities pla cafl lcrV hmsH irp2 область 3a (3a region) pla cafl IcrV область 3a (3a region) pla cafl hmsH irp2 область 3a (3a region) pla cafl IcrV область 3a (3a region) caf1 область 3a (3a region) pla cafl IcrV область 3a (3a region) pla cafl IcrV область 3a (3a region) hmsH irp2 область 3a (3a region) cafl область 3a (3a region) cafl hmsH irp2 IcrV область 3a (3a region)
Отсутствие генов Absence of genes
- hmsH irp2 IcrV hmsH irp2 hmsH irp2 IcrV pla hmsH irp2 hmsH irp2 lcrV pla cafl hmsH irp2-IcrV pla pla
LD50 для белых мышей, КОЕ LD50 for white mice, CFU 12,5 КОЕ 12,5 CFU >109 1109 >109 >109 1,47-108 1108 >109 >109 2,15106
Способность к пигментсорбции Pigment sorption capacity Pgm+ Pgm- Pgm+ Pgm- Pgm- Pgm- Pgm- Pgm+ Pgm- Pgm+
Зависимость роста штаммов от ионов кальция Calcium-dependence Cаd+ Cаd+ Cаd- Cаd+ Cаd- Cаd+ Cаd+ Cаd- Cаd- Cаd+
Цитотоксическое воздействие штаммов на лейкоциты цельной крови человека, % Cytotoxic effect of strains on leucocytes of whole human blood, %
91,33±4,56 24±0,19 44,33±7,35 2,66±0,33 49±2,94 30,33±1,73 41,66±5,07 18±2,35 10±3,27 76,66±7,65
Таблица 3 / Table 3 Дифференциация штаммов Y. pestis по вирулентности Differentiation of Y. pestis strains by virulence
Вирулентность штамма Strain virulence LD50, м.к. (microbe cells)
[20]* [18]* [17]*
Высоковирулентный Highly virulent 10 от 1 до 100 от 5 до 10
Вирулентные Virulent - от 101 до 1000 -
Средневирулентные Moderately virulent - от 1001 до 10000 -
Слабовирулентный Slightly virulent > 105 > 105 > 105
Авирулентным Avirulent > 106 - > 106
* - ссылки на источники литературы.
* - references.
- критерию «отсутствие генов, кодирующих основные факторы патогенности» - 8 штаммов (оба фактора - 2, pCad - 2, pgm - 4), исключение составил Y pestis 652 «Гризель»;
- критерию «отсутствие фенотипических проявлений продукции обоих или одного из основных факторов патогенности» - 8 штаммов (6 штаммов -(Pgm-), 4 - (Cad-)), исключение составил Y pestis 652 «Гризель»;
- критерию «наличие чувствительности к антибактериальным препаратам» - 9 штаммов.
Таким образом, в результате анализа показано, что штамм Y pestis EV НИИЭГ соответствует всем предложенным критериям. Для семи авирулентных штаммов Y. pestis, включенных в учебный набор, установлено наличие оснований для отнесения к III группе патогенности: Y pestis: 707 «Касуга», 521 (2101), А-819, 100Р6 (36М5), КМ-130 (3), КМ 260 (12), М-1813.
для характеристики патогенных свойств наряду с данными регламентированных методов были использованы результаты оценки in vitro интенсивности цитотоксического воздействия штаммов чумного микроба на лейкоциты цельной крови человека, имеющие высокую корреляцию с биологическим методом (r=0,9 - для авирулентных штаммов; r=0,7 - для вирулентных штаммов) [21]. Отмечено, что вирулентные штаммы Y pestis (рСаd+, pgm+) обладали более выраженным повреждающим эффектом на лейкоциты цельной крови человека (гибель более 80 % клеток в исследуемом образце крови) в условиях in vitro (табл. 2). Штаммы, утратившие оба (рСаd, область pgm) или один из основных факторов патогенности и по значению LD50, характеризовавшиеся авирулентностью, не индуцировали массивную гибель лейкоцитов (гибель менее 50 % клеток) Исключение составил штамм Y pestis 652 «Гризель» (LD50 равно 2,15 106 КОЕ), имевший высокий показатель цитотоксичности (76,77±7,65 %). Возможно, это объясняется наличием в геноме обязательных де-
терминант патогенности (рСаd+, pgm+). Полученные молекулярно-генетические характеристики основных факторов патогенности и цитотоксичности данного штамма свидетельствуют о нецелесообразности отнесения его к группе авирулентных, несмотря на формальное соответствие критерию LD50 более 106 м.к.
Таким образом, оценка вирулентности штамма Y. pestis должна опираться на комплексную характеристику основных факторов патогенности с помощью современных молекулярно-генетических методов исследования, данных о фенотипических проявлениях их функционирования, а также степени патогенности для белых мышей. Данный подход в перспективе позволит избежать многократных пассажей культуры чумного микроба на лабораторных животных с целью доказательства отсутствия реверсии в вирулентную форму и получения сравнимых данных.
Актуальной задачей является пересмотр используемых количественных показателей для дифференциации штаммов чумного микроба по вирулентности с учетом показателя LD50 штамма Y. pestis EV НИИЭГ, который в соответствии с действующими МУ 3.31.1113-02 должен быть не менее 107 КОЕ.
Целесообразно дополнять комплексный подход информативными методами исследования, в частности характеристикой цитотоксичности штамма, продемонстрировавшей высокую корреляцию с критерием вирулентности LD50.
Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
Список литературы
1. Дроздов С.Г., Гарин Н.С., Джиндоян Л.С., Тарасенко В.М. Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях. АМН СССР. М.: Медицина; 1987. 255 с.
2. Зверев В.В., Быков А.С., редакторы. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник. М.: Медицинское информационное агентство; 2016. С. 394-5.
3. NIH Guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. 2019. [Электронный ресурс]. URL: https://osp.od.nih.gov/wp-content/uploads/NIH_Guidelines.html (дата обращения 24.06.19).
4. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, fifth edition. [Электронный ресурс]. URL: https://www.cdc.gov/ labs/pdf/CDC-BiosafetyMicrobiologicalBiomedicalLaboratories-2009-P.PDF (дата обращения 25.06.19).
5. Tian D., Zheng T. Comparison and Analysis of Biological Agent Category Lists Based On Biosafety and Biodefense. PLoS One. 2014; 9(6):e101163. DOI: 10.1371/journal.pone.0101163.
6. The Approved List of biological agents. HSE Books; 2013. 35 р. [Электронный ресурс]. URL: https://www.hse.gov.uk/PuBns/ misc208.pdf (дата обращения 24.06.19).
7. Покровский В.И., Пак С.Г., Брико Н.И., Данилкин Б.К. Инфекционные болезни и эпидемиология: учебник. 2-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2008. С. 192-3.
8. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2002; 3:3-23.
9. De Almeida, A.M. Guiyole A., Guilvout I., Iteman I., Baranton G., Carniel E. Chromosomal irp 2 gene in Yersinia: distribution, expression, deletion and impact on virulence. Microb. Pathog. 1993; 14(1):9-21. DOI: 10.1006/mpat.1993.1002.
10. Iteman I., Guiyole A., De Almeida A.M., Guilvout I., Barangton G., Carniel E. Relationship between loss of pigmentation and deletion of the chromosomal ironregulated irp2 gene in Yersinia
pestis: evidence for separate but related events. Infect. Immun. 1993; 61(6):2717-22. PMID: 8500913. PMCID: PMC280907.
11. Nakajima R., Brubaker R.R. Association between virulence of Yersinia pestis and suppression of gamme interferon and tumor necrosis factor alpha. Infect. Immun. 1993; 61(1):23-31. PMID: 8418045. PMCID: PMC302683.
12. Ракин А. Остров «высокой патогенности»: продукция металлофора йерсиниобактина, интегративность, мобильность. Бактериология. 2017; 2(4):7-16. DOI: 10.20953/2500-1027-20174-7-16.
13. Краснов Я.М., Гусева Н.П., Шарапова Н.А., Черкасов А.В. Современные методы секвенирования ДНК (обзор). Проблемы особо опасных инфекций. 2014; 2:73-9. DOI: 10.21055/0370-1069-2014-2-73-79.
14. Попов Ю.А., Ерошенко Г.А., Булгакова Е.Г., Смирнова Н.И. Разработка комплексного алгоритма генотипирования и методов оценки генетического разнообразия природных штаммов возбудителей чумы и холеры. Проблемы особо опасных инфекций. 2009; 4:5-10. DOI: 10.2105570370-1069-2009-4(102)-5-10.
15. Куклев В.Е., Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. Набор и способ для ускоренной идентификации чумного микроба с одновременной дифференциацией вирулентных и авиру-лентных штаммов Y. pestis, определением их плазмидного профиля. Патент РФ № 2473701, опубл. 27.01.2013. Бюл. № 3.
16. Leal N.C., Almeda A.M. Diagnosis of plague and identification of virulence markers in Yersinia pestis by multiplex-PCR. Rev. Inst. Med. Trop. Sao. Paulo. 1999; 41(6):339-42. DOI: 10.1590/ s0036-46651999000600002.
17. Онищенко Г. Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.
18. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы: руководство. Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та; 1989. 89 с.
19. Сазанова Е.В., Малюкова Т.А., А.В. Бойко, Н.И. Вахрушина, Ю. А. Попов. Набор учебных штаммов для освоения лабораторной диагностики чумы. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2017; 5(22):22-7.
20. Burrows T.W. Virulence of pasteurella pestis and immunity to plague. Ergeb. Mikrobiol. Immunitatsforsch. Exp. Ther. 1963; 37:59-113. DOI: 10.1007/978-3-662-36742-1 2.
21. Сазанова Е.В., Шмелькова Т.П., Кравцов А.Л., Малюкова Т.А., Попов Ю.А. Проточно-цитофлуориметрический анализ цитотоксичности штаммов Yersinia pestis. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 6:3-9. DOI: 10.36233/0372-9311-2017-6-3-9.
References
1. Drozdov S.G., Garin N.S., Dzhindoyan L.S., Tarasenko V.M. [Basic Principles of Occupational Safety in Microbiological and Virological Laboratories]. Academy of Medical Sciences of USSR. M.: "Meditsina"; 1987. 255 p.
2. Zverev V.V., Bykov A.S., editors [Medical Microbiology, Virology and Immunology: Study Guide]. M.: "Medical Information Agency"; 2016. P. 394-5.
3. NIH Guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. 2019. (Cited 24 June 2019). [Internet]. Available from: https://osp.od.nin.gov/wp-content/uploads/NIH_ Guidelines.html.
4. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, fifth edition. (Cited: 25 June 2019). [Internet]. Available from: https:// www.cdc.gov/labs/pdf/CDC-BiosafetyMicrobiologicalBiomedicalL aboratories-2009-P.PDF.
5. Tian D., Zheng T. Comparison and Analysis of Biological Agent Category Lists Based On Biosafety and Biodefense. PLoS One. 2014; 9(6):e101163. DOI: 10.1371/journal.pone.0101163.
6. The Approved List of biological agents. HSE Books; 2013. 35 p. (Cited 24 June 2019). [Internet]. Available from: https://www. hse.gov.uk/PuBns/misc208.pdf.
7. Pokrovsky V.I., Pak S.G., Briko N.I., Danilkin B.K. [Infectious Diseases and Epidemiology: Textbook, 2nd edition]. M.: "GEOTAR-Media"; 2008. P. 192-3.
8. Anisimov A.P. [Yersinia pestis factors, assuring circulation and maintenance of the plague pathogen in natural foci ecosystems. Report 1]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2002; 3:3-23.
9. De Almeida, A.M. Guiyole A., Guilvout I., Iteman I., Baranton G., Carniel E. Chromosomal irp 2 gene in Yersinia: distribution, expression, deletion and impact on virulence. Microb. Pathog. 1993; 14(1):9-21. DOI: 10.1006/mpat.1993.1002.
10. Iteman I., Guiyole A., De Almeida A.M., Guilvout I., Barangton G., Carniel E. Relationship between loss of pigmentation and deletion of the chromosomal ironregulated irp2 gene in Yersinia pestis: evidence for separate but related events. Infect. Immun. 1993; 61(6):2717-22. PMID: 8500913. PMCID: PMC280907.
11. Nakajima R., Brubaker R.R. Association between virulence of Yersinia pestis and suppression of gamme interferon and tumor necrosis factor alpha. Infect. Immun. 1993; 61(1):23-31. PMID: 8418045. PMCID: PMC302683.
12. Rakin A. ["High pathogenicity" island: yersiniabactin metallophore production, integration, mobility]. Bakteriologiya [Bacteriology]. 2017; 2(4):7-16. DOI: 10.20953/2500-1027-20174-7-16.
13. Krasnov Y.M., Guseva N.P., Sharapova N.A., Cherkasov A.V. [Modern Methods of DNA Sequencing (Scientific Review)]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2014; (2):73-9. DOI: 10.21055/0370-10692014-2-73-79.
14. Popov Yu.A., Eroshenko G.A., Bulgakova E.G., Smirnova N.I. [Development of Complex Genotyping Algorithm and Methods of Evaluation of the Genetic Diversity of Plague and Cholera Agents Natural Strains]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infect ions]. 2009; 4(102):5-10. (In Russ.) DOI: 10.21055/0370-1069-2014-2-73-79.
15. Kuklev V.E., Osina N.A., Bugorkova T.V., Kutyrev V.V.
e microbe with . pestis strains,
with determination of their plasmid profile]. RF Patent No 2473701, published on January 27, 2013. Bulletin No 3.
16. Leal N.C., Almeda A.M. Diagnosis of plague and identification of virulence markers in Yersinia pestis by multiplex-PCR. Rev. Inst. Med. Trop. Sao. Paulo. 1999; 41(6):339-42. DOI: 10.1590/ s0036-46651999000600002.
17. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Infectious Diseases. Practice Guidelines]. M.: "Shiko' CJSC; 2013. 560 p.
18. Aparin G.P., Golubinsky E.P. [Microbiology of Plague: Guidelines]. Irkutsk: Irkutsk University Publishing House; 1989. 89 p.
19. Sazanova E.V. Malyukova T.A. Boyko A.V., Vakhrushina N.I., Popov Yu.A. [A kit of practice strains for mastering laboratory diagnostics of plague]. Infektsionnye Bolezni: Novosti, Mneniya, Obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2017; 5(22):22-7.
20. Burrows T.W. Virulence of pasteurella pestis and immunity to plague. Ergeb. Mikrobiol. Immunitatsforsch. Exp. Ther. 1963; 37:59-113. DOI: 10.1007/978-3-662-36742-1_2.
21. Sazanova E.V., Shmelkova T.P., Kravtsov A.L., Malyukova T.A., Popov Yu.A. [Flow-cytofluorimetric analysis of cytotoxicity of Yersinia pestis strains]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immu-nobiology]. 2017; 6:3-9. DOI: 10.36233/0372-9311-2017-6-3-9.
Authors:
Sazanova E.V., Malyukova T.A., Popova Yu.A., Lyapin M.N. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
об авторах:
СазановаЕ.В., Малюкова Т.А., ПоповЮ.А., ЛяпинМ.Н. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
