CC BY
104
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.324
Разработка метода определения биологической активности препаратов эритропоэтина in vitro
Н. А. Гаврилова1, С. А. Черепушкин2, Н. В. Рыкалина2, Ю. И. Обухов1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия
2 Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Министерства образования и науки Российской Федерации, Москва, Россия
Поступила 03.03.2016. Принята к публикации 22.04.2016.
Разработан метод оценки биологической активности препаратов эритропоэтина in vitro на культуре чувствительных клеток TF-1. Исследованы особенности измерения и расчета биологической активности эритропоэтинов с различным уровнем гликозилирования в тестах in vivo и in vitro. Диапазоны линейного ответа клеточной линии на эритро-поэтин и его гипергликозилированный аналог отличались и составляли (0,39-0,56 нг/мл) и (3,1-12,5 нг/мл) соответственно. Проведенный анализ полученных результатов показывает возможность применения клеточного теста для сопоставления и количественной оценки активности аналогов эритропоэтина в международных единицах стандарта биологической активности (МЕ), принятых для эритропоэтина.
Ключевые слова: биологическая активность; эритропоэтин; дарбэпоэтин; клеточная линия TF-1; пролифера-тивный ответ.
Библиографическое описание: Гаврилова НА, Черепушкин СА, Рыкалина НВ, Обухов ЮИ. Разработка метода определения биологической активности препаратов эритропоэтина in vitro. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2016; 16 (2): 120-124.
Препараты рекомбинантного эритропоэтина человека (рчЭПО) и его аналогов до сих пор являются одними из наиболее распространенных в медицинской практике биотехнологических лекарственных средств [1]. В последнее десятилетие были получены и нашли широкое применение так называемые пролонгированные формы эритропоэтина с повышенной биологической активностью [2-5]. Активно разрабатываются аналоги эритропоэтина в виде гибридных молекул, обладающие рядом других, в том числе цитопротекторных функций [5, 6]. Биологические функции препаратов эритропоэтинового ряда определяются, прежде всего, способностью взаимодействовать с рецепторами клеток-предшественников эритроидного ряда и стимулировать их дифференцировку, а также структурой молекул, которая определяет конечную эффективность препарата, способствуя оптимизации его фармако-кинетических параметров.
Биологическая активность является одним из основных параметров качества эритропоэтина и определяется в соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи in vivo путем измерения числа ретикулоцитов в крови экспериментальных животных [7]. Активность эритропоэтина определяется в единицах международного стандарта, распространяемого Европейским директоратом по качеству медицинских препаратов [8]. В то же время, в нормативных документах РФ в настоящее время метод определения биологической активности препаратов эритропоэти-нового ряда не регламентирован. Серьезную проблему представляет также отсутствие в России собственного государственного стандартного образца (ГСО) на эритропоэтин [9]. Кроме того, зарегистрированные за рубежом и на российском рынке препараты аналогов эритропоэтина, такие как Аранесп фирмы «Амджен Европа Б. В» (Нидерланды), имеют дозировки без указания величины гемопоэти-ческой активности. Таким образом, ряд препаратов одной терапевтической группы в отсутствии единой системы из-
мерений невозможно сопоставить по основному параметру качества — биологической активности.
С другой стороны, трудоемкость и вариабельность результатов определения активности in vivo, связанная с объективными трудностями воспроизводимости результатов в живом организме, диктует необходимость разработки других способов измерения активности белков эритро-поэтинового ряда, например, с использованием культур клеток, более легко стандартизуемых по параметрам воспроизводимости и надежности, и не менее чувствительных. Применение этих методов особенно актуально на этапе получения новых рекомбинантных молекул, описания их свойств, а также выбора клонов продуцентов и разработки технологических процессов [5, 10, 11]. Несмотря на невозможность полноценной оценки биологических функций белков, эти методики позволяют определить подлинность и антигенную структуру белка по его способности взаимодействия с рецептором-мишенью. Кроме того, зависимость скорости пролиферации чувствительных клеток от количества ЭПО, добавленного в ростовую среду может быть оценена с помощью колориметрического теста. В зарубежной практике примером использования теста in vitro являются Аранесп («Амджен Европа Б. В», Нидерланды) [4], гибридные молекулы EPO-Fc [12, 13] и другие.
Во ФГУП ГосНИИгенетики разработан метод определения биологической активности ЭПО и его аналогов в культуре клеток in vitro с использованием клеточной линии TF-1 ATCC CRL-2003. Целью настоящего исследования была оценка возможности использования клеточного теста для определения биологической активности ЭПО, а также разработка формата методики для определения биологической активности эритропоэтинов с различным уровнем гликозилированности.
Материалы и методы
Стандартные и исследуемые белни. В качестве стандартного образца использовали препарат эталонного реком-бинантного эритропоэтина человека Erythropoietin BRP (EPO(BRP) E1515000), распространяемый Европейским директоратом по качеству медицинских препаратов. Измерение биологической активности проводили в образцах коммерческих препаратов Эпостим (ООО «Фарма-парк», Россия) и Аранесп («Амджен Европа Б. В», Нидерланды).
Биологичесную антивность in vivo для препаратов Аранесп и Эпостим определяли в экспериментах с лабораторными мышами BALB/c (питомник ГУ НЦБТ РАМН «Столбовая», самки, 20-22 г), которые проводили в соответствии с методическими рекомендациями Европейской фармакопеи [7]. Эксперименты выполняли с использованием проточного гемоцитометра-анализатора ADVIA 120 (Bayer Diagnostics («Simens»), Германия) и программы обработки данных Multispecies Software 2120. В качестве стандартного образца использовали препарат эталонного рекомбинантного эритропоэтина человека Erythropoietin BRP (EPO(BRP) E1515000), распространяемого Европейским директоратом по качеству медицинских препаратов. Для определения биологической активности (стимуляция генерации ретикулоцитов у нормоцитемических мышей) животным вводили подкожно по 0,5 мл раствора, содержащего 80, 40 или 20 МЕ/мл стандарта EPO(BRP) или по 0,5 мл двукратных разведений анализируемых белков. В предварительных экспериментах был найден диапазон разведений, позволяющий получать линейный ретикуло-цитарный ответ. По истечении четырех суток со дня инъекций в крови подопытных животных инструментально измеряли число ретикулоцитов и их процентное соотношение с количеством зрелых эритроцитов (RET %).
Биологичесную антивность in vitro определяли в культуре чувствительных к эритропоэтину клеток линии TF-1 ATCC CRL-2003.
Клетки линии TF-1 (ATCC CRL-2003) культивировали при температуре 37°С, в атмосфере 5% СО2, в среде RPMI (ООО «ПанЭко», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories», США), гентамицина (ООО «ПанЭко», Россия) до концентрации 1 мкг/мл и гранулоцитарно-мак-рофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) («PeproTech EC Ltd», Великобритания) в конечной концентрации 2 нг/мл. Пересев клеток выполняли каждые 2-3 сут. Концентрация клеток в культуре составляла от 30 до 500 тыс. кл/мл и не превышала 700 тыс. кл/мл. Для проведения использовали клетки, подготовленные по особой схеме (описание в тексте). Подготовленные клетки вносили в лунки 96-луночного планшета, содержащие по 50 мкл приготовленных разведений стандартного или испытуемого образца ЭПО (максимальная концентрация 50 нг/мл, каждая концентрация в 4 повторах), а также ростовой среды, в качестве контроля. Планшет инкубировали в течение 68-72 ч при температуре 37°С, в атмосфере 5% СО2. После окончания инкубации в каждую ячейку планшета, включая ячейки для контроля среды, прибавляли по 10 мкл субстратной смеси WST-1 («Roche Diagnostics», США). Далее инкубировали планшет при температуре 37°С, в атмосфере 5% СО2 в течение не менее 2 и не более 5 ч при визуальном контроле развития окраски. Затем измеряли оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 450 нм на планшетном спектрофотометре.
Для расчета специфической активности для стандартного и испытуемых образцов по результатам тестов in vivo или in vitro в программе Microsoft Excel строили зависимость между логарифмом концентрации (в нг/мл) испытуемого и стандартного растворов и специфическим ответом в виде пролиферативного (оптическая плотность) или гемопоэтического (количество ретикулоцитов, %) ответа. Полученная для стандартного и испытуемого препарата зависимость имела вид:
А = a ■ IgC + b,
где А —уровень биологического сигнала; С —концентрация раствора в нг/мл; b - угол наклона регрессионной прямой; a — свободный член уравнения регрессии.
Далее вычисляли концентрацию испытуемого белка, которая вызывает такое же биологическое действие, как и каждая доза стандартного белка с известной величиной биологической активности.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования было проведено измерение биологической активности двух коммерческих препаратов Эпостим («ООО Фармапарк», Россия) и Аранесп («Амджен Европа Б. В», Нидерланды) в тесте in vivo относительно стандарта гемопоэтической активности EPO(BRP). Измеренная биологическая активность препарата эритропоэтина (Эпостим) соответствовала заявленной производителем спецификации и составляла 1005 МЕ/мл. Препарат дарбэпоэтина суказанной производителем дозировкой 500 мкг/мл разводили до концентраций 0,05; 0,1; 0,2 мкг/мл в соответствии с определенным в более ранних исследованиях диапазоном линейной зависимости ретикулоцитарного ответа от концентрации пролонгированных форм эритропоэтина [5, 6]. Рассчитанное значение активности препарата Аранесп составляло около 523767 МЕ/мл или 1047534 МЕ/мг белка. Полученное значение согласуется с данными других исследователей, которые оценивали гемопоэтическую активность дарбэпоэтина как в 5 и более раз превосходящую активность эритропоэтина [4, 12]. На рисунке 1 представлены графики, характеризующие полученные линейные зависимости для стандартного белка, образцов коммерческих эритропо-этина и дарбэпоэтина.
Полученные результаты были использованы при постановке клеточного теста in vitro. Перед использованием в тесте по определению специфической активности клетки проходили так называемую стадию «голодания»: инкубацию в течение 22-26 ч в среде с минимальным содержанием сыворотки без добавления ГМ-КСФ и других факторов роста. Клетки, прошедшие стадию голодания, отмывали от культуральной среды путем центрифугирования при 1200 об/мин, отбора супернатанта и ресуспендирования осадка клеток в холодном растворе Хенкса без фенолового красного. Процедуру повторяли три раза. После третьей процедуры центрифугирования клеточный осадок суспендировали в таком объеме ростовой среды (без ГМ-КСФ), чтобы получившаяся концентрация клеток была в пределах 600-800 тыс. кл/мл. Данный формат метода подготовки клеточной суспезии был разработан в результате отдельного исследования по выбору оптимальных условий проведения эксперимента с соотношением уровней сигналов фона и максимального пролиферативного ответа не менее 1.
Н. А. Гаврилова, С. А. Черепушкин, Н. В. Рыкалина, Ю. И. Обухов
10,5
9,5
т" о н £ =Г
0
1
5
Й О.
о со
Ь
§ ас
8,5
7,5Ч
6,5
5,5
4,5 к
3,5
у =6,3354х- 3,8021 К2 =0,96 Зпостим у =6,7646х-4,4208 /?2= 0.98 ЕРО(В[*Р) у= 6,2646х-1,2462 /?2= 0,96 Аранесп 1
1111
4
/ /
/
т
♦ 1
/ X
у / ж ✓
У /
о у / у у
у / ✓
/ /
✓ 1
♦ / / / ✓
у
1
Ву
*
<*
у у'
/
у у
> И
1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9
1дС, МЕ/мл
Рис. 1. Графическая зависимость уровня биологического ответа у мышей от концентрации стандартного образца эритропоэтина (ЕРО(ВРР)), исследуемого образца препарата Зпостим и образца препарата Аранесп.
Таблица 1. Изменение активности препарата Аранесп при ускоренном хранении при температуре 25°С
Длительность хранения препарата, сутки Активность, МЕ/мг Активность, % от исходного результата определения
0 1047534 100,0
1 876785 83,7
7 675659 64,5
14 677754 64,7
Примечание. В графе активность указано среднее значение, полученное по результатам трех повторностей одного эксперимента.
Рис. 2. Графическая зависимость уровня биологического ответа клеточной линии ТР-1 от концентрации стандартного образца эритропоэтина (ЕРО(ВРР)), исследуемого образца препарата Зпостим и образца препарата Аранесп.
Оба исследуемых препарата Зпостим и Аранесп были разведены кратно в соответствии с их биологической активностью до концентраций, соответствующих линейному диапазону пролиферативной активности, определенной
ранее для ЕРО(ВРР) и составляющей (0,39-6,25 нг/мл). Графические зависимости уровня пролиферативного ответа от логарифма концентрации белка представлены на рисунке 2.
Концентрация эритропоэтина, необходимая для инициации пролиферативного ответа чувствительной линии ТР-1, почти в 10 раз ниже, чем для дарбэпоэтина. Зтот результат полностью соответствует данным литературы о более слабой аффинности дарбэпоэтина к рецептору-мише-
ни, что обусловлено структурными изменениями белка и, прежде всего, его гипергликозилированием [12], а также результатам, полученным для обоих белков в экспериментах in vivo.
Таким образом, величина биологической активности препаратов эритропоэтинового ряда с разным уровнем гликолизирования не может быть прямо рассчитана по активности EPO(BRP) в рамках одного теста. Требуется наличие соответствующего стандартного образца, с тем же уровнем взаимодействия с рецептором чувствительных клеток или внутреннего стандартного образца, предварительно оцененного в единицах ME.
Тем не менее, с целью подтверждения возможности использования клеточного пролиферативного теста для оценки биологической активности препаратов эритропо-этинового ряда с различным уровнем гликозилирования, было проведено исследование с ускоренным хранением коммерческого препарата Аранесп и мониторингом в клеточном тесте изменения его активности. Результаты представлены в таблице 1. В условиях хранения, несоответствующих специфицированным, при температуре 25°С в течение 14 суток, активность препарата Аранесп изменялась с 1047534 до 677754 ME/мг. Конечный результат был подтвержден соответствующим измерением активности в тесте на мышах.
Заключение
Таким образом, эритропоэтин и его гликозилированный аналог взаимодействуют с рецептором, вызывая пролиферацию чувствительных клеток TF-1, что позволяет проводить сопоставление биологической активности белков эритропоэтинового ряда с различным уровнем гликози-лирования.
Диапазоны линейного ответа клеточной линии на эритропоэтин и его гипергликозилированный аналог различаются и составляют (0,39-1,56 нг/мл) и (3,1-12,5 нг/мл) соответственно.
Результат клеточного пролиферативного теста может быть оценен количественно в единицах биологической активности, аналогично результатам метода in vivo. Разработанный метод позволяет сопоставить активность препарата эритропоэтина со стандартным образцом с аттестованной активностью и произвести расчет его активности в ME/мл. Препараты гипергликозилированных аналогов эритропоэтина, таких как Аранесп также могут быть оценены в соответствии с принятой для эритропоэтинов системой единиц измерения. Дальнейшие исследования и оценка основных валидационных характеристик клеточ-
ного теста позволят оценить возможность его применения не только для исследовательских целей, но и для оценки качества и стандартизации препаратов ЭПО.
Литература
1. Bunn HF. New agents that stimulate erythropoesis. Blood 2007; 109(3): 868-3.
2. Macdougall IC, Eckardt K-U. Novel strategies for stimulating eryt-hropoiesis and potential treatments for anaemia. Lancet 2006; 368(9539): 947-53.
3. Cossar JD, Lawrence M, Donaldi S. Pegylated erythpoietic compounds. W02004009627; 2004.
4. Egrie JC, Dwyer E, Browne JK, Hitz A, Lykos MA. Darbepoetin alfa has a longer circulating half-life and greater in vivo potency than recombinant erythropoietin. Exp Hematol. 2003; 31(4): 290-9.
5. Joung CH, Shin JY, Koo JK, Linn JJ, Wang JS, Lee SJ, et al. Production and characterization of long-acting recombinant human albumin-EP0 fusion protein expressed in CH0 cell. Protein Expr Purif. 2009; 68(2): 137-45.
6. Brines M, Grasso G, Fiordaliso F, Sfacteria A, Ghezzi P, Fratelli M, et al. Erythropoietin mediates tissue protection through an erythropoietin and common beta-subunit heteroreceptor. Proc Natl AcadSci USA 2004; 101(41): 14907-12.
7. European Pharmacopoeia 8.0/8.4. «Erythropoietin Concentrated Solution».
8. List of European Pharmacopoeia Reference Standards. Available from: http://www.edqm.eu/en/ph-eur-reference-standards-or-ders-catalogue.
9. Яковлев АН, Гайдерова ЛА, Алпатова НА, Лобанова TH, Ба-туашвили ТА, Симутенко ЛВ. и др. Этапы стандартизации препаратов эритропоэтинов. Биопрепараты 2015; (4): 17-20.
10. Kitamura T, Tange T, Terasawa T, Chiba S, Kuwaki T, Miyagawa K, et al. Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J Cell Physiol. 1989; 140(2): 323-34.
11. Elliott S, Egrie J, Browne J, Lorenzini T, Busse L, Rogers N, et al. Control of rHuEP0 biological activity: the role of carbohydrate. Exp Hematol. 2004; 32(12): 1146-55.
12. Гаврилова НА, Черемных АМ, Бобренёва РА, Аскерова ЕВ, На-линина ТИ, Булушова НВ и др. Гемопоэтическая активность и фармакокинетика гибридных белков EPO-Fc, EPO-Fcneo и Alb-EPO — производных эритропоэтина человека. Биотехнология 2012; (5): 38-49.
13. Черемных АМ, Аскерова ЕВ, Бобренёва РА, Гаврилова НА, На-линина ТИ. Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения. Патент Российской Федерации, №2515914; 2013.
Об авторах
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8, стр. 2. Гаврилова Наталья Андреевна. Аналитик 1-й категории Управления экспертизы противобактериальных МИБП Центра экспертизы и контроля МИБП, канд. биол. наук.
Обухов Юрий Иванович. Начальник Управления экспертизы противобактериальных МИБП Центра экспертизы и контроля МИБП. Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Министерства образования и науки Российской Федерации. Российская Федерация, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.
Черепушнин Станислав Андреевич. Научный сотрудник отдела медицинской биотехнологии. Рыналина Наталия Владимировна. Научный сотрудник лаборатории иммунологии. Адрес для переписки: Гаврилова Наталья Андреевна; Gavrilova@expmed.ru
H. A. Гаврилова, С. A. Черепушкин, H. В. Рыкалина, Ю. И. Обухов
The development of a method for determining the biological activity of erythropoietin preparations in vitro
N. A. Gavrilova1, S. A. Cherepushkin2, N. V. Rykalina2, Yu. I. Obukhov1
1 Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia
2 State Research Institute of Selection of Industrial Microorganisms of The Ministry of Education and Science of the Russian Federation, Moscow, Russia
The method for the assessment of biological activity of erythropoietin preparations in vitro on TF-1 sensitive cells culture has been developed. The special characteristics of measurements and calculations of the biological activity of erythropoietin with different levels of glycosylation in vivo and in vitro. Linear response ranges for cell lines to erythropoietin and its hyperglycosylated analogue differ and make (0.39-0.56 ng/ml) and (3.1-12.5 ng/ml), respectively. The results have shown the possibility of using cellular test for comparing and assaying the activity of erythropoietin analogues in standard international units of biological activity (IU) set for erythropoietin.
Key words: biological activity; erythropoietin; darbepoetin; cell line TF-1; proliferative response.
For citation: Gavrilova NA, Cherepushkin SA, Rykalina NV, Obukhov Yul. The development of a method for determining the biological activity of erythropoietin preparations in vitro. BlOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2016; 16 (2): 120-124.
References
1. Bunn HF. New agents that stimulate erythropoesis. Blood 2007; 109(3): 868-3.
2. Macdougall IC, Eckardt K-U. Novel strategies for stimulating eryt-hropoiesis and potential treatments for anaemia. Lancet 2006; 368(9539): 947-53.
3. Cossar JD, Lawrence M, Donaldi S. Pegylated erythpoietic compounds. W02004009627; 2004.
4. Egrie JC, Dwyer E, Browne JK, Hitz A, Lykos MA. Darbepoetin alfa has a longer circulating half-life and greater in vivo potency than recombinant erythropoietin. Exp Hematol. 2003; 31(4): 290-9.
5. Joung CH, Shin JY, Koo JK, Linn JJ, Wang JS, Lee SJ, et al. Production and characterization of long-acting recombinant human albumin-EP0 fusion protein expressed in CH0 cell. Protein Expr Purif. 2009; 68(2): 137-45.
6. Brines M, Grasso G, Fiordaliso F, Sfacteria A, Ghezzi P, Fratelli M, et al. Erythropoietin mediates tissue protection through an eryth-ropoietin and common beta-subunit heteroreceptor. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(41): 14907-12.
7. European Pharmacopoeia 8.0/8.4. «Erythropoietin Concentrated Solution».
List of European Pharmacopoeia Reference Standards. Available from: http://www.edqm.eu/en/ph-eur-reference-standards-or-ders-catalogue.
Yakovlev AK, Gayderova LA, Alpatova NA, Lobanova TN, Batuas-hvili TA, Simutenko LV, et al. The stages in standardizing erythropoietin preparations. Biopreparaty 2015; (4): 17-20 (in Russian). Kitamura T, Tange T, Terasawa T, Chiba S, Kuwaki T, Miyagawa K, et al. Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J Cell Physiol. 1989; 140(2): 323-34.
Elliott S, Egrie J, Browne J, Lorenzini T, Busse L, Rogers N, et al. Control of rHuEP0 biological activity: the role of carbohydrate. Exp Hematol. 2004; 32(12): 1146-55.
12. Gavrilova NA, Cheremnykh AM, Bobreneva RA, Askerova EV, Kalinina TA, Bulushova NV, et al. The haemopoietic activity and phar-macokinetics of EP0-Fc, EP0-Fcneo and Alb-EP0 fused proteins, derivatives of human erythropoietin. Biotehnologiya 2012; (5): 38-49 (in Russian).
Cheremnykh AM, Askerova EV, Bobreneva RA, Gavrilova NA, Kalinina TA, Jurin VL. Hybrid protein based on recombinant human erythropoietin, having prolonged action (versions), and method of its production. Patent RF, №2515914; 2013 (in Russian).
9.
10.
11.
13.
Authors
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre on Expert Evaluation of Medical Application Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Petrovsky Boulevard, 8-2, Moscow, 127051, Russian Federation.
Gavrilova NA. Analyst of Office of expertise of antibacterial medical immunobiological preparations of Center for examination and control of medical immunobiological preparations. Candidate of Biological Sciences.
Obuhov Yul. Head of Office of expertise of antibacterial medical immunobiological preparations of Center of expertise and control of medical immunobiological preparations.
Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation, 1st Dorozhnyj Proezd, 1, Moscow, 117545, Russian Federation. Cherepushkin SA. Researcher of Department of medical biotechnology. Rykalina NV. Researcher of Laboratory of immunology.
