CC BY
57УДК 575 DOI: 10.24411/0023-4885-2020-10601
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ГЕНОМНОГО СКАНИРОВАНИЯ С ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ГРУПП СЕЛЕКЦИОНИРУЕМЫХ КРОЛИКОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИЛОКУСНОГО ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВЫСОКОПОЛИМОРФНЫХ ГЕНОМНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ Полилокусное генотипирование кроликов
Г.Ю. Косовский1, Т.Т. Глазко1'2, В.И. Глазко1,2, А.Р. Шумилина1, Е.С. Колесник1
1Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева» 140143, Московская область, Раменский район, пос. Родники, ул. Трудовая, 6
e-mail: niipzk@mail.ru
2Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева
127550, Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49 e-mail:vigvalery@gmail.com, tglazko@rambler.ru
Осуществлен подбор наиболее полиморфных геномных элементов домашнего кролика с целью по-лилокусного генотипирования для выявления генетической гетерогенности групп кроликов и контроля изменений их генетических структур в процессе селекционной работы. Выполнен поиск участков гомологии к наиболее полиморфным геномным участкам - микросателлитам и фрагментам длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов в референтном геноме домашнего кролика с использованием алгоритма BLSTn и базы ГенБанка, представленных в пакете программ веб страницы National Center for Biotechnology Information (nih.gov). Выполнено сравнение полиморфизма геномных участков кроликов пород белый великан, советская шиншилла, калифорнийская и полученного на их основе синтетического трехпородного кросса с использованием оценок разнообразия фрагментов геномной ДНК кроликов, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (ACC)6G, (GAG)6C, (CTC)6C (ISSR-PCR маркеры) и участками LTR эндогенных ретровирусов (IRAP-PCR маркеры) Berv-LTR-K1,LTR-SIRE-1,Sabrina 111, Sabrina 1336 и Bare 123A. В результате выполненных исследований обнаружено, что наиболее информативными по своему полиморфизму, необходимому для контроля изменчивости генетических структур разных групп кроликов, являются спектры продуктов амплификации, полученные в результате использования в ПЦР в качестве праймеров микросателлита (CTC)6C и фрагментов Sabrina 111, Sabrina 1336, LTR Bare 123A. Полученные данные позволяют рекомендовать условия проведения ПЦР и последовательности (CTC)6C, фрагментов Sabrina 111, Sabrina 1336, LTR Bare 123A в качестве праймеров в ПЦР для экспресс-контроля генетической структуры и ее динамики в процессе селекционной работы с домашним кроликом.
Ключевые слова: кролик, молекулярные генетические маркеры, полиморфизм, ISSR, IRAP, эндогенные ретровирусы, микросателлиты.
Европейский кролик (Oryctolagus cuniculus) и высокоценному диетическому мясу - крольча-
- единственный признанный родоначальник до- тина усваивается организмом человека на 90%.
машних кроликов, который сегодня является уни- Кролики являются наиболее важным видом лабо-
кальным объектом биомедицинских исследова- раторных млекопитающих, который существенно
ний в связи с особенностями физиологии [1], а ближе генетически и физиологически к человеку.
также важным сельскохозяйственным видом, бла- Кроме того, многоплодие и короткий репродук-
годаря высокой продуктивности, скороспелости, тивный период делает их наиболее удобной моде-
относительной неприхотливости в уходе, возмож- лью для исследований по сравнению с другими
ности использования в пушной промышленности доместицированными видами млекопитающих.
Развитие новых биотехнологий к настоящему времени позволило получить данные о полногеномном секвенировании домашнего кролика, референтный геном которого представлен в ГенБанк, а также сравнивать полногеномные сиквенсы домашнего и дикого кролика, выделять мононуклео-тидные полиморфизмы (Single Nucleotide Polymorphisms - SNP), выявлять и оценивать геномные участки, полиморфизм которых ассоциирован с изменчивостью фенотипических характеристик животных [2-3].
Из-за короткой продолжительности жизни, относительно небольших сроков беременности, многоплодия, низкой стоимости и доступности геномной и протеомной информации домашний кролик служит для преодоления разрыва между мелкими грызунами (мыши и крысы) и более крупными животными (собаки и обезьяны) при необходимости экстраполяции экспериментальных данных, получаемых на модельных объектах, на человека. Это играет особо важную роль во многих исследованиях, таких как доклиническое тестирование лекарств и диагностических методов [4]. Так, например, одним из лучших вкладов кроликов в медицину является открытие статина, самого мощного гиполипидемического препарата. С точки зрения развития терапевтических методов, достаточно давно стало очевидным, что многие болезни человека не могут быть должным образом исследованы на мелких мышевидных грызунах. Ряд клинических испытаний оказались неудачными, возможно, потому, что первоначальные исследования проводились на них. Поэтому кролик служит альтернативной моделью для изучения заболеваний человека и выяснения тех специфических вопросов, которые не могут быть решены на грызунах. Трансгенные кролики, наряду с появлением кроликов с нок-аутными генами, проложат новый путь для развития как терапевтических, так и диагностических стратегий в будущем. Сравнительный анализ генома кролика с другими млекопитающими повысит полезность кролика как биологической модели. Изучение эпигенетических изменений в регуляторных геномных элементах может способствовать выявлению генных сетей, лежащих в основе адаптации животных к факторам экологического стресса, а секвенирование геномов кроликов может позволить сопоставлять и выявлять критические регуляторные элементы этого процесса, структурные гены и их взаимодействия у грызунов, зайцеобразных и приматов.
Домашний кролик является одним из самых последних одомашненных видов и характеризуется исключительно высоким фенотипическим разнообразием, включает более чем 200 пород [5], что находит свое применение в коммерческих и исследовательских целях [1, 6-11]. Коммерческое применение включает производство мяса, меха, шерсти и терапевтических белков, а также использование в качестве домашних животных-игрушек или спутников. Кроме того, кролики являются модельным объектом в исследованиях целого ряда наследственных заболеваний, широко распространенных у человека (например, аортальный атеросклероз, катаракта, гипертония, гипертрофическая кардиомиопатия, эпилепсия, остеопороз и многие другие), что делает их ценным объектом как в медико- биологических, так и в фундаментальных исследованиях [12].
На современном этапе продолжается селекционная работа, в которую существенный вклад вносят методы селекции с помощью ДНК маркеров (Marker Assistance Selection - MAS), геномной селекции путем выявления ассоциаций между полиморфизмом SNP структурных генов и регуляторных геномных элементов, контролирующих различные метаболические пути, с такими хозяйственно важными характеристиками, как мясная и шерстная продуктивность, репродукция животных, устойчивость к различным заболеваниям [12, 13].
Известно, что уровни внутрипородного и видового генетического полиморфизма по некоторым ДНК маркерам у кроликов составляют 0,2% [3, 15-16], а от дикого предка современный кролик отличается на 60%. Породы кроликов являются сравнительно молодыми, коэффициент инбридинга субпопуляций относительно всей популяции - корреляция между случайно отобранными гаметами в пределах субпопуляции (Fst) [17] равен 17,9%, что дает возможность предполагать, что кролики, которые являлись предшественниками пород, содержались в виде закрытых генофондов, что способствовало накоплению породных популяционно-генетиче-ских отличий [3]. Результаты ретроспективного анализа популяционно генетических процессов предполагают [17], что начальная популяция кроликов, вовлеченная в доместикацию, насчитывала менее 1200 особей [12].
Выявленные изменения в таких структурных генах, как GPC3 и GPC4, кодирующих белки
Glypican-3 и Glypican-4, играющие роль в контроле клеточного деления, указывают на влияние искусственного отбора [18, 19]. Генные сети, участвующие в контроле клеточного деления, в том числе и гены GPC3 и GPC4, могут являться опосредованной мишенью отбора, поскольку размер тела исторически является первым селекционируемым признаком у кроликов [20].
Одомашнивание кролика, судя по накопленным данным о гаплотипах D-петли митохонд-риальной ДНК, видимо, привело к большей потере части генетического разнообразия, как и у большинства одомашненных видов. Эффект бутылочного горлышка является общей чертой одомашнивания, которое приводит к снижению генетической изменчивости по митохондриальной ДНК, что коррелирует со снижением эффективности отбора [2]. Наблюдается постоянное снижение генетической изменчивости по микроса-теллитным локусам, митохондриальной ДНК и гена, кодирующего фактор транскрипции (SRY-Sex-Determining Region Y Protein) [21-23], что, вероятно, объясняется малыми популяциями кроликов, исторически разводимых изолированно [12]. Для домашнего кролика характерна повышенная экспрессия гена sox6 (фактор регуляции транскрипции SOX6) [24] и prom1 (Promi-nin 1) [21], который кодирует антиген CD133. Оба этих гена являются модуляторами развития мозга, и уровни их экспрессии были выше у до-местицированных видов [25].
Известно, что показатели генетической изменчивости (гетерозиготность, доля полиморфных локусов, генетические расстояния) домашнего кролика по исследованию неравновесного сцепления аллельных вариантов ряда микросателлитов ниже по сравнению с дикими [12]. В то же время, по ряду других геномных элементов наблюдается повышенный полиморфизм. Так, например, по белкам спермы у некоторых линий домашнего кролика выявлено большое количество аллельных вариантов [26].
В геномах млекопитающих среди диспергированных повторов широко представлены эндогенные ретровирусы - производные экзогенных вирусов, утратившие инфекционную полноценность, но сохранившие возможности воспроизводится через собственную обратную транскриптазу и расселяться в новые геномные участки. Сравнение домашнего кролика по распределению эндогенных ретровирусов (ERV -
Endogenous Retrovirus) с предковым европейским подвидом свидетельствует, как правило, о близости их происхождения [3]. Ретровирусы интегрируют провирусную копию ДНК в зародышевую линию хозяина и передаются по наследству. ERV идентифицируются в геномах хозяина по их сходству с последовательностями представителей экзогенных ретровирусов, принадлежащих к тому же роду. Последствиями присутствия ERV и перемещения в геноме хозяина является перетасовка геномных последовательностей, которая, в том числе, способствует образованию рекомбинантов эндогенных ретровирусов, а также сохранению отдельных ретровирусных участков, например, одиночных длинных терминальных повторов (solo-LTR -Long Terminal Repeats). Широкая распространенность ERV в геномах млекопитающих позволяет использовать гомологичные им последовательности для реконструкции филогенетических взаимоотношений, в частности, для разных групп кроликов [10]. Так, в частности, выполнен сравнительный геномный анализ мо-нонуклеотидных замен (SNP) и распределения эндогенных ретровирусов (ERV) у двух подвидов дикого кролика (французский и испанский, O.c.cuniculus и O.c.algirus), а также у домашнего кролика. В геноме европейского кролика выявлено высокое разнообразие ERV, сформированное многочисленными эволюционными событиями: одомашнивание, гибридизация и породообразование [10]. Обнаружено относительно большее сходство распределения ERV между французским подвидом и домашним кроликом по сравнению с испанским подвидом. Суммарно у дикого вида наблюдается большее разнообразие по ERV, чем у домашнего кролика, в то же время выявлено преимущественное размножение отдельных семейств ERV, отличающего доместицированных животных от исходного подвида.
Накопленные к настоящему времени результаты экспериментальных исследований свидетельствуют об актуальности поисков нового поколения молекулярно-генетических маркеров, позволяющих контролировать с высоким разрешением генетическую структуру групп кроликов и ее динамики в разных условиях содержания и в процессе селекционной работы. Результаты геномных исследований генома кролика, представленные выше, свидетельствуют о том, что к та-
кому поколению могут принадлежать наиболее полиморфные геномные элементы, такие как микросателлиты, фрагменты эндогенных ретро-вирусов.
В этой связи, целью настоящей работы, был сравнительный анализ и подбор наиболее полиморфных геномных элементов домашнего кролика, позволяющих выполнять полилокусное генотипирование животных для выявления генетической гетерогенности селекционируемой группы и контроля изменения ее генетической структуры в процессе селекционной работы. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.
- Выявление участков гомологии к длинным концевым повторам ряда эндогенных ретро-вирусов в референтном геноме домашнего кролика.
- Сравнительный анализ распределения частоты встречаемости элементов длинных концевых повторов ряда эндогенных ретровирусов.
- С целью выявления наиболее информативных геномных участков выполнен сравнительный анализ количества и полиморфизма фрагментов геномной ДНК кроликов, амплифи-цируемых в полимеразной цепной реакции с использованием в качестве праймеров участков длинных концевых повторов некоторых эндогенных ретровирусов.
Материалы и методы исследований
В исследования включены представители трех пород кроликов (белый великан, советская шиншилла и калифорнийская), являющиеся родительскими для трехпородного кросса, и синтетический кросс кроликов (суммарно 60 голов). Все кролики содержались в условиях шедовой системы содержания в отделе экспериментального кролиководства ФГБНУ НИИПЗК, имеющего статус племенного репродуктора. От каждого животного было взято 3-5 мл крови из ушной краевой вены в пробирки с ЭДТА в количестве 40 образцов (по 10 образцов крови от каждой породы).
Экстрагирование ДНК проводили с помощью набора ДНК-М-Сорб («Синтол», Россия) следуя инструкции от производителя. С полученными образцами ДНК проводили полиме-разную цепную реакцию (PCR) в амплифика-торе Swift Maxi (Esco, Сингапур) с использованием наборов ПЦР-РВ («Синтол», Россия), а
также микросателлитных маркеров и ретро-транспозонов.
В качестве праймеров в PCR использовали по следовательности микросателлитов(АСС)^, (GAG)6C, (CTC)6C (ISSR-PCR маркеры) и участки LTR эндогенных ретровирусов (IRAP-PCR маркеры) Sabrina 111 (5'AAACAAGAACTGA-CACTTGGCACT3'), Sabrina 1336 (5'TCATG-GCGTTGGGAGCAAGC3'), Bare 123 A (5'CCCTCTCGTAGATGGACATCACC3'), Berv-LTR-K1 (5' TATCAGGCCTCTCCGCATG 3'), LTR-SIRE-1 (5 ' GCAGTTATGCAAGTGGGAT-CAGCA3'). С готовой ПЦР смесью (20мкл) проводили амплификацию по программе: 2 мин при 95°С; 40 циклов - 20 с при 94°С, 20 с при 55°С, 2 мин при 72°С; 2 мин при 72°С.
Фракционирование продуктов амплификации проводили в 1,5% агарозном геле в 1X TAE буфере при постоянном напряжение 100В и силе тока 100А в течении 60-90 минут. Гель фотографировали и анализировали под ультрафиолетовыми лучами в системе фотогельдокументации Quantum-ST4 (Vilber Lourmat, Франция).
Математическая обработка данных проводилась на основе полученных ISSR- и IRAP спектров продуктов амплификации участков геномной ДНК кроликов, фланкированных инвертированными повторами соответствующих праймеров. Каждый продукт амплификации рассматривали как отдельный локус. Составлены бинарные матрицы для каждого праймера отдельно и общие матрицы для ISSR-маркеров и IRAP-маркеров, отображающие присутствие либо отсутствие конкретного продукта амплификации (ампликона). Бинарные матрицы использованы для вычисления значения полиморфного информационного содержания (Polymorphic Information Content - PIC) и доли полиморфных локусов (ДПЛ, в %) в спектрах продуктов амплификации. Полиморфное информационное содержание (ожидаемая гетерози-готность) рассчитывали по формуле PIC = 2f(1-f), где f - частота одного из двух аллелей, рассчитанная как f = , где R - частота вариантов, у которых отсутствовал фрагмент ДНК соответствующей длины (рассматривались как гомозиготы по «рецессивному» аллелю). Для статистической обработки данных полилокусного генотипирования использовали программы Microsoft Office Excel, TFPGA. В анализ включали данные, полученные с использованием алгоритма BLSTn и ресурсов ГенБанк NCBI.
Результаты исследований
В целях сравнения распределения микро-сателлитных повторов с соответствующим якорным нуклеотидом и участков длинных концевых повторов ряда эндогенных ретровирусов выполнен анализ частоты встречаемости соответствующих участков в референтном геноме домашнего кролика, представленного в Ген-Бан^СВ1 с использованием алгоритмов BLSTn. Полученные данные приведены в таблице!.
Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшая частота встречаемости в референтном геноме домашнего кролика обнаруживается для фрагмента ЦТЯ эндогенного ретро-вирусаВаге 123А, затем для эндогенного ретро-вирусаSabrina 111 и наименьшая - для иТК^1КЕ-1 (табл.1). Среди микросателлитных локусов наибольшая частота встречаемости выявлена для последовательности (GAG)6С, наименьшая - для (ACC)6G (табл.1).
Полученные данные позволяют предполагать, что частота встречаемости последовательностей в референтном геноме домашнего кролика, которые в дальнейшем могут использоваться как праймеры для полилокусного
генотипирования кроликов, в определенной степени ассоциированы с их полиморфизмом: чем больше частота встречаемости, тем больше полиморфных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами указанных выше праймеров.
Для получения ответа на этот вопрос были выполнены оценки полиморфизма (доли полиморфных локусов, полиморфного информационного содержания спектров ампликонов - PIC) у групп кроликов пород белый великан, шиншилла, калифорнийская и трехпородного кросса. В результате получены следующие данные.
В спектрах продуктов амплификации при применении в ПЦР в качестве праймеров три-нуклеотидных микросателлитов для каждой породы кроликов выявлялись свои, породоспеци-фичные особенности количества фрагментов ДНК разной длины и их сочетаний. Примеры сравнительного анализа спектров продуктов амплификации, полученных с праймерами (ACC)6G , (GAG)6C, (CTC)6C у представителей разных пород кроликов представлены на рисунках 1-3.
В спектрах продуктов амплификации фрагментов геномной ДНК, фланкированных инвер-
Таблица 1. Частота встречаемости последовательностей в референтном геноме домашнего кролика, представленного в ГенБан^СВ1, гомологичных микросателлитным локусам (ACC)6G, (GAG)6C, (CTC)6C и участкам длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов Sabrina 111, Sabrina 1336, Bare 123A, Berv-LTR-K1, LTR-SIRE-1 Table 1. Frequency of occurrence of sequences in the reference genome of the domestic rabbit, presented in the NCBI GenBank, homologous to the microsatellite loci (ACC)6G, (GAG)6C, (CTC)6C and the regions of long terminal repeats of endogenous retroviruses Sabrina 111, Sabrina 1336, Bare 123A, Berv-LTR-K1, LTR-SIRE-1
Микросателлиты / Microsatellites Частота встречаемости в референтном геноме домашнего кролика/ Frequency of occurrence in the reference genome of the domestic rabbit Фрагменты длинных концевых повторов (LTR) эндогенных ретровирусов/ Long terminal repeat (LTR) fragments of endogenous retroviruses Частота встречаемости в референтном геноме домашнего кролика / Frequency of occurrence in the reference genome of the domestic rabbit
(GAG)6C 17171 Sabrina 111 26281
(CTC)6C 14473 Sabrina 1336 14323
(ACC)6G 8103 Bare 123A 48747
Berv-LTR-K1 6579
LTR-SIRE-1 4427
Рисунок 1. Пример электрофоретических спектров ISSR-амплификации ДНК-кроликов при использовании маркера (ACC)6G: М - маркер молекулярных масс, 1ГБ-3ГБ, 5ГБ-10ГБ -трехпородный кросс кроликов, 2КФ - кролики калифорнийской породы.
Figure 1. An example of electrophoretic spectra of ISSR-amplification of DNA-rabbits using the marker (ACC)6G: M - molecular weight marker, 1GB-3GB, 5GB-10GB - three-breed cross of rabbits, 2CF - Californian rabbits.
Рисунок 2. Пример электрофоретических спектров ISSR-амплификации ДНК-кроликов при использовании маркера (GAG)6C: М - маркер молекулярных масс, 1БВ, 2БВ, 6БВ, 8БВ -кролики породы белый великан, 1СШ, 4СШ, 7СШ, 8СШ - кролики породы советская шиншилла, 1КФ, 4КФ, 6КФ, 8КФ - кролики калифорнийской породы, 1ГБ-4ГБ - трехпородный кросс кроликов.
Figure 2. An example of electrophoretic spectra of ISSR amplification of DNA rabbits using the marker (GAG)6C: M - molecular weight marker, 1WG, 2 WG, 6 WG, 8 WG - White giant rabbits, 1SSh, 4SSh, 7SSh, 8SSh - Soviet chinchilla, 1CF, 4CF, 6CF, 8CF - rabbits of the Californian breed, 1GB-4GB - three-breed cross of rabbits.
Рисунок 3. Пример электрофоретических спектров ISSR-амплификации ДНК-кроликов при использовании маркера (CTC)6C: М - маркер молекулярных масс, 1КФ-10КФ - кролики калифорнийской породы, 1БВ-3БВ, 5БВ-10БВ -кролики породы белый великан.
Figure 3. An example of electrophoretic spectra of ISSR-amplification of DNA-rabbits using the marker (CTC)6C: M - molecular weight marker, 1CF-10CF - Californian rabbits, 1 WG -3 WG, 5 WG -10 WG - white giant rabbits.
тированными повторами последовательностей (GAG)6C, (ACC)6G и (CTC)6C суммарно выявлено, соответственно, 7, 12 и 7 фрагментов ДНК. Наиболее сложные спектры у кроликов наблюдались при использовании в полимеразной цепной реакции в качестве праймера последовательности (ACC)6G. Полиморфное информационное содержание (Polymorphic Information Content - PIC) и доля полиморфных локусов (ДПЛ, %) в спектрах продуктов амплификации (ампликонов) у исследованных групп кроликов представлена в таблице 2.
Полученные данные свидетельствуют о том, что характеристики полиморфизма отличаются в зависимости от используемого прай-мера, наиболее полиморфные спектры амплико-нов по доле полиморфных локусов и PIC получены при использовании в качестве праймера последовательности (CTC^C.
На рисунке 4 графически представлены данные о доле полиморфных локусов у разных пород кроликов и животных трехпородного кросса, полученные в ходе исследования. По праймеру (ACC^G доля полиморфных локусов для животных трехпородного кросса составила 41,7%, для породы белый великан - 50%, для пород калифорнийская и советская шиншилла -оказалась равной и составила 33,3%.
Проведенный анализ по праймеру (CTC)6C позволил получить следующие данные о доле по-
Таблица 2.Полиморфное информационное содержание (PIC) и доля полиморфных локусов (ДПЛ) у гибридных животных и исходных пород кроликов для трех ISSR-PCR маркеров - (ACC)6G, (СТС)6С, (GAG)6C Table 2. Polymorphic information content (PIC) and proportion of polymorphic loci (DPL) in hybrid animals and parental rabbit breeds for three ISSR-PCR markers -
(ACC)6G, (CTC)6C, (GAG)6C
Порода / Breed (ACC)6G (СТС)бС (GAG)6C
ДПЛ, % / DPL, % Р1Сср* / PICavg* ДПЛ, % / DPL, % PIV / PICavg* ДПЛ, % / DPL, % PI<V / PICavg*
Трехпородный кросс/ Three-breed cross 41,7 0,134 57,1 0,21 28,6 0,113
Калифорнийская / Californian rabbits 33,3 0,122 42,9 0,172 42,9 0,125
Белый великан / White giant rabbits 50 0,134 71,4 0,278 57,1 0,223
Советская шиншилла / Soviet chinchilla 33,3 0,148 85,7 0,347 42,9 0,155
* - PIC - среднее значение PIC (полиморфное информационное содержание).
ср
* - PICavg - average PIC (polymorphic information content)
Рисунок 4. Доля полиморфных локусов у трехпородного кросса и исходных пород кроликов для трех ISSR-PCR маркеров - (ACC)6G, (СТС)6С, (GAG)6C.
Figure 4. The proportion of polymorphic loci in a three-breed cross and parental rabbit breeds for three ISSR-PCR markers - (ACC)6G, (CTC)6C, (GAG)6C.
лиморфных локусов: для трехпородного кросса При использовании праймера (GAG^C
она составила 57,1%, для породы белый великан доля полиморфных локусов для трехпородного - 71,4%, для пород калифорнийская и советская кросса составила 28,6%, для породы белый ве-шиншилла - 42,9% и 85,7% соответственно. ликан - 57,1%, для пород калифорнийская и со-
Рисунок 5. Полиморфное информационное содержание у трехпородного кросса и исходных пород кроликов для трех ISSR-PCR маркеров - (ACC)6G, (СТС)6С, (GAG)6C.
Figure 5. Polymorphic information content in a three-breed cross and parental rabbit breeds for three ISSR-PCR markers - (ACC)6G, (CTC)6C, (GAG)6C.
ветская шиншилла - оказалась равной и составила 42,9%.
Диаграмма, представленная на рисунке 5, отражает полученные данные о значениях полиморфного информационного содержания у разных пород кроликов и животных трехпородного кросса.
Среднее значение полиморфного информационного содержания для праймера (ACC)6G оказалось равным для породы белый великан и животных трехпородного кросса и составило 0,134, для пород калифорнийская и советская шиншилла оно составило 0,122 и 0,148, соответственно.
Среднее значение полиморфного информационного содержания для праймера (СТС)бС для трехпородного кросса составило 0,210, для калифорнийской породы - 0,172, для пород белый великан и советская шиншилла оно составило 0,278 и 0,347, соответственно.
Среднее значение полиморфного информационного содержания для праймера (GAG)6C для трехпородного кросса составило 0,113, для калифорнийской породы - 0,125, для пород белый великан и советская шиншилла оно составило 0,223 и 0,155, соответственно.
Самые высокие значения доли полиморфных локусов и полиморфного информационного
содержания по всем породам и трехпородному кроссу были получены по праймеру (СТС^С.
Таким образом, на основе проведенного анализа можно заключить, что наиболее информативными для оценки генетического разнообразия кроликов являются спектры продуктов амплификации, полученные с использованием в качестве праймера (СТС^С, несмотря на то, что частота встречаемости гомологичных к нему последовательностей встречается в референтном геноме домашнего кролика заметно реже, чем последовательности (GAG)6C (табл.1).
Обращает на себя внимание и то, что оба микросателлита представляют участки пурин/пи-римидиновых треков с высокой предрасположенностью к формированию вторичных структур ДНК (триплексов), комплементарны друг к другу (за исключением якорного нуклеотида) и, тем не менее, встречаются в референтном геноме с разной частотой и заметно отличаются по полиморфизму участков геномной ДНК, фланкированных их инвертированными повторами.
Получение спектров продуктов амплификации с использованием в ПЦР в качестве прай-меров фрагментов длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов позволило получить следующие данные.
Таблица 3. Полиморфное информационное содержание (PIC), доля полиморфных локусов (ДПЛ) в спектрах продуктов амплификации пород кроликов калифорнийская, советская
шиншилла, белый великан и синтетического кросса с использованием в качестве праймеров участков длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов Sabrina111,
Sabrina 1336, Bare 123A. Table 3. Polymorphic information content (PIC), the proportion of polymorphic loci (DPL) in the spectra of amplification products of the Californian, Soviet chinchilla, white giant, and three-breed rabbits breeds using long terminal repeats of endogenous retroviruses Sabrina111, Sabrina 1336, Bare 123A as primers ...
Маркеры I Primers Калифорнийская I Californian Советская шиншилла I Soviet chinchilla Белый великан / White giant Синтетиче ский кросс / three-breed cross
ДПЛ,% I DPL, % PIC ДПЛ,% I DPL, % PIC ДПЛ,% I DPL, % PIC ДПЛ,% I DPL, % PIC
Sabrina111 57.14 0.390 50.00 0.376 62.50 0.392 62.5 0.382
Sabrina 1336 71.42 0,457 42.85 0,464 50.00 0,425 33.3 0,341
Bare 123A 75.00 0,372 75.00 0,44 75.00 0,475 75.0 0,347
В спектрах ампликонов праймера Berv-LTR-K1 выявлено суммарно 10 локусов, 6 из них оказались полиморфными, остальные 4 - консервативными и соответствующие фрагменты ДНК (500, 700-750, 1200 и 1300 п.о.) встречались у всех исследованных кроликов. В среднем, по кроликам всех пород, полиморфизм этого спектра был невысоким и достигал значений по PIC около 0,210.
В спектрах праймера LTR-SIRE-1 консервативные зоны выявлены в районах длин 800, 550, 400, 300 и 250 пар оснований. В спектрах этого праймера наблюдали 16 локусов, 11 из них являлись полиморфными, 5 консервативными. Спектры ампликонов и этого праймера по доле PIC оказались сравнительно невысокими и существенно не отличались у разных пород, в среднем значения PIC были 0,200.
Почти в два раза выше по полиморфному информационному содержанию оказались спектры ампликонов трех других фрагментов LTR эндогенных ретровирусов (табл.3).
Интересно отметить, что в данном случае есть определенное соответствие между высокой частотой встречаемости в референтном геноме домашнего кролика участков гомологии к LTR эндогенных ретровирусов (табл.1) и сравнительно повышенной ожидаемой гетерозигот-ностью (PIC) (табл.3).
Заключение
В результате выполненных исследований получены новые данные о возможностях использования полилокусного генотипирования кроликов, позволяющие выявлять популяционно-гене-тические особенности разных групп кроликов, подобраны наиболее эффективные условия использования нового метода полилокусного гено-типирования в целях увеличения надежности контроля и управления динамкой генетической структуры кроликов в процессе селекционной работы. Обнаружена зависимость полиморфизма отдельных ДНК маркеров от особенностей нук-леотидных последовательностей микросателлит-ных последовательностей и длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов и ее отсутствие с частотой встречаемости участков гомологии к ним в референтном геноме домашнего кролика. Выявлены нуклеотидные последовательности микросателлитных локусов, фрагментов LTR эндогенных ретровирусов, которые могут быть наиболее эффективно использованы для контроля популяционно-генетических структур групп кролика в процессе селекционной работы, к ним относятся микросателлит (CTC)6C, фрагменты длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов Sabrina 111, Sabrina 1336, LTR Bare 123A
Список литературы/ References
1. Bosze Z., et al. The transgenic rabbit as model for human diseases and as a source of biologically active recombinant proteins. Transgenic Res., 2003, V. 12. P. 541-553.
2. Brandvain Y., et al. The limits of natural selection in a nonequilibrium world. Trends Genet, 2016, № 324. P. 201-210.
3. Carneiro M., et al. Rabbit genome analysis reveals a polygenic basis for phenotypic change during domestication. Science, 2014, V. 375. P. 1074-1079.
4. Weisbroth S.H., et al. Neoplastic diseases, Biology of the laboratory rabbit. New York Academic Press, 1974, P. 332-369.
5. Fontanesi L., et al. Lagomorph Genomics Consortium. LaGomiCs-Lagomorph Genomics Consortium: An International Collaborative Effort for Sequencing the Genomes of an Entire Mammalian Order. J Hered., 2016, V. 107(4). P. 295308.
6. Fan J.L., et al. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models. PharmacolTherapeut, 2003, V. 99. P. 261-282.
7. Houdebine L.M., et al. Transgenic rabbits to prepare pharmaceutical proteins, Rabbit Biotechnology: rabbit genomics, transgenesis, cloning and models. New York Springer, 2009, P. 65-75.
8. Lebas F., et al. The rabbit: husbandry, health and production. Rome FAO Animal Production and Health Series, 1997. № 21.
9. Lindsey J., et al. The biology of the laboratory rabbit, Inherited disease and variations. San Diego (CA)Academic Press, 1994, P. 293-319.
10. Rivas-Carrilloa S. D., et al. Whole-genome comparison of endogenous retrovirus segregation across wild and domestic host species populations. Proc Natl AcadSci USA, 2018, V. 23. P. 1101211017.
11. Rogel-Gaillard C, et al. Rabbit, Genome mapping and genomics in domestic animals. Heidel berg Springer, 2009, 165-230 p.
12. Carneiro M., et al. The Genetic Structure of Domestic Rabbits. Molecular Biology and Evolution, 2011, V. 28. I. 6. P. 1801-1816.
13. El-Sabrout K., et al. Some recent applications of rabbit biotechnology - a review. Animal biotechnology, 2018, V. 31(1). P. 76-80.
14. Gunia M., et al. Genetic Parameters for Resistance to Non-specific Diseases and Production Traits Measured in Challenging and Selection
Environments. Application to a Rabbit Case. Front. Genet., 2018. V. 9. P. 467.
15. El-Bayomi K.M., et al. Genetic diversity and phylogenetic relationship among some rabbit breeds using random amplified polymorphic DNA markers. Life Sci., 2013, V. 10. P. 14491457.
16. Whitman B.D. Domestic rabbits & their histories: breeds of the world. Overland Park, KS: Leathers Publishing, 2004. 456 p.
17. Christian N. K. et al. A population genetics model for data from multiple populations and points in time. Bioinformatics, 2004, V. 21. I. 8. P. 1733-1734.
18. Oliver F, et al. Regulatory variation at glypican-3 underlies a major growth QTL in mice. PLoS Biol., 2005, V. 3 P. 135.
19. Pilia G. et al. Mutations in GPC3, a glypican gene, cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome. Nat Genet., 1996, V. 12. P. 241-247.
20. Clutton-Brock J. A natural history of domesticated mammals. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1999, P. 248.
21. https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SOX6
22. https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SRY
23. Geraldes A., et al. High levels of nucleotide diversity in the European rabbit (Oryctolaguscuni-culus) SRY gene. Anim Genet., 2005, V. 36(4). P. 349-51.
24. https://www.genecards.org/cgi-in/carddisp.pl?gene=PROM1&keywords=PRO M1
25. Khaitovich P., et al. Parallel Patterns of Evolution in the Genomes and Transcriptomes of Humans and Chimpanzees. Science, 2005, V. 309. P. 1850-1854.
26. Casares-Crespo L., et al. Proteomic characterization of rabbit (Oryctolaguscuniculus) sperm from two different genotypes. Theriogenology, 2019, №128. P. 140-148.
DEVELOPMENT OF METHODS FOR GENETIC DIVERSITY OF GROUPS OF BREEDING RABBITS BASED ON POLYLOCUS GENOTYPING OF HIGHLY POLYMORPHIC GENOMIC ELEMENTS
Polylocus genotyping of rabbits
G.Yu. Kosovsky1, Т.Т. Glazko1'2, V.I. Glazko1'2, A.R. Shumilina1, E.S. Kolesnik1
1Afanas'ev Research Institute of Fur-Bearing Animal Breeding and Rabbit Breeding. Russia, 140143, Moscow province, Ramenskii region, pos. Rodniky, ul. Trudovaya, 6
e-mail: niipzk@mail.ru
2Timiryazev Russian State Agrarian University
Russia Moscow Agrarian Academy, 49, ul. Timiryazevskaya, Moscow, 127550 e-mail: vigvalery@gmail.com, tglazko@rambler.ru
The selection of the most polymorphic genomic elements of the domestic rabbit for polylocus genotyping and identification of the genetic heterogeneity of groups of rabbits and control of changes in their genetic structures in breeding work was carried out. The search for homology regions to the most polymorphic genomic regions - microsatellites and fragments of long terminal repeats of endogenous retroviruses in the reference genome of the domestic rabbit was performed using the BLSTn algorithm and the GenBank database presented in the National Center for Biotechnology Information (nih.gov). A comparison of the polymorphism of the genomic regions of rabbits of the White Giant, Soviet Chinchilla, and Californian rabbits and a synthetic three-breed cross obtained on their basis was performed using estimates of the diversity of rabbit genomic DNA fragments flanked by inverted repeats of microsatellites (ACC)6G, (GAG)6C, (CTC)6C ( ISSR-PCR markers) and LTR regions of endogenous retroviruses (IRAP-PCR markers) Berv-LTR-K1, LTR-SIRE-1, Sabrina 111, Sabrina 1336, and Bare 123A. As a result of the studies performed, it was found that the most informative in terms of its polymorphism, which is necessary for controlling the variability of the genetic structures of different groups of rabbits, are the spectra of amplification products obtained as a result of the use of microsatellite (CTC)6C and fragments of Sabrina 111, Sabrina 1336 in PCR as primers. , LTR Bare 123A. The data obtained allow us to recommend the conditions for PCR and the sequence (CTC)6C, fragments of Sabrina 111, Sabrina 1336, LTR Bare 123A as primers in PCR for the express control of the genetic structure and its dynamics in the process of breeding work with a domestic rabbit.
Key words: rabbit, molecular genetic markers, polymorphism, ISSR, IRAP, endogenous retroviruses (ERV), microsatellites.
Г.Ю. Косовский: SPIN-код: 3736-3480; AuthorID: 353097; ORCID: 0000-0003-3808-3086; Research-erID: ABG-7304-2020; ScopusID: 57196461206
Т.Т. Глазко: SPIN-код: 9581-8980; AuthorID: 186988; ORCID: 0000-0002-3879-6935; ResearcherID: S-4925-2017; ScopusID: 6603540980
В.И. Глазко: SPIN-код: 1556-3661; AuthorID: 297850; ORCID: 0000-0002-8566-8717; ResearcherID: Q-3017-2019, L-3116-2017; ScopusID: 7003981461
А.Р. Шумилина: SPIN-код: 3588-4841; AuthorID: 621252; ORCID: 0000-0003-1961-8428
Е.С. Колесник: SPIN-код: 3533-3806; AuthorID: 1050062; ORCID: 0000-0002-2465-7184; ScopusID: 57219537696
