CC BY
16
УДК 619:616:98:579.873.21.636.22/28
Ключевые слова: гиперчувствительность замедленного типа, микобактерии M. bovis BCG, ППД туберкулин, воспалительный процесс, инбредные морские свинки, рандомбредные морские свинки
Key words: delayed type hypersensitivity, mycobacterium M. bovis BCG, PPD tuberculin, inflammatory process, inbreeding guinea pig, random breeding guinea pig
Мясоедов Ю. М., Искандаров М. И.
РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЯ ФОРМИРОВАНИЯ ГРУПП МОРСКИХ СВИНОК, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТЕСТАХ ТУБЕРКУЛИНОВОЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА
the development of the criterion of formation of guinea pig groups used in tests for delayed type hypersensitivity to tuberculin
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко» Российской академии сельскохозяйственных наук (ВИЭВ Россельхозакадемии) Адрес: 109428, г. Москва, Рязанский проспект, д. 24, к. 1
Budgetary State Research Institution "Y. R. Kovalenko's All-Russian Institute for Experimental Veterinary Medicine" of the Russian Academy of Agricultural Science Adderss: 109428, Russia, Moscow, Ryazansky pr., 24 k. 1
Мясоедов Юрий Михайлович, к. б. н.
Myasoedov Yury M., ph.D. in Biology Science Искандаров Марат Идрисович, д. в. н., гл. научн. сотр. сектора хронических инфекций
Iskandarov Marat I., Doctor of veterinary Science, chief Researcher of the Dept. of chronic Infections
Аннотация. В статье изложены результаты изучения критерия, характеризующегося зависимостью между размером воспалительной реакции в месте внутрикожного введения микобактерий M. bovis BCG и размером воспалительной реакции в месте введения ППД туберкулина, значение которого выше на морских свинках, полученных близкородственным скрещиванием. Использование критерия позволяет формировать группы морских свинок для последующего использования в тестах гиперчувствительности замедленного типа.
Summary. The article presents the results of studying the criterion characterized by the dependence between the size of inflammatory reaction in the place of intradermal injection of mycobacterium M. bovis BCG and the size of inflammatory reaction in the place of injection of PPD the value of which is higher in guinea pigs that have undergone closely related crossing. The use of the criterion allows to form groups of guinea pigs for subsequent use in delayed hypersensitivity tests.
Введение
Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), развивающаяся в организме животных на введение микобактерий M. bovis и выявляемая в кожном тесте с ППД туберкулином, называется туберкулиновой [5]. Туберкулиновая ГЗТ лежит в основе ряда тестов, используемых при оценке иммуногенности разных доз вакцин против туберкулеза [8]; определении биологической активности ППД тубер-кулинов [1]; оценке свойства фармакологических препаратов подавлять туберкулиновую реакцию [2]. В свою очередь, при моделировании туберкулиновой ГЗТ преимущественно используются морские свинки, сгруппированные по критериям: пола, массы, возраста [1, 8], конвенциональности [3].
В ходе клинических наблюдений в гуманной медицине был разработан критерий, исполь-
зуемый во фтизиатрии, но не учитываемый при исследовании на животных - размер воспалительной реакции в месте внутрикожного введения микобактерий M. bovis BCG, характеризующийся положительной зависимостью с размером воспалительной реакции в месте введения ППД туберкулина [4]. Зависимость, выявленная в клинических исследованиях, предполагает наличие подобной корреляции и у морских свинок, сенсибилизированных M. bovis, что может быть использовано как критерий при формировании групп морских свинок, используемых в тестах туберкулиновой гиперчувствительности замедленного типа. Принимая во внимание вышеизложенное, целью исследования была разработка критерия формирования групп морских свинок, используемых в тестах туберкулиновой гиперчувствительности замедленного типа.
Материалы и методы
В исследовании использовали самок морских свинок, альбиносов, полученных ин-бредным (брат х сестра) и рандомбредным способами массой 500-550 г, содержащихся на стандартном гранулированном корме со свободным доступом к воде.
В работе был использован туберкулин очищенный ППД для млекопитающих (производство ФГУП «Курская биофабрика») с содержанием 10000 МЕ/см3 (PPD-bovine). Разведения ППД туберкулина осуществляли на фосфатном буфере (рН 7,0).
В исследовании использован штамм ми-кобактерий M. bovis BCG-1 (ФГУП «НПО «Микроген»), из которого приготавливали суспензию на фосфатном буфере для последующей внутрикожной сенсибилизации животных.
Статистическую обработку результатов эксперимента проводили при помощи программного обеспечения Microsoft Office Excel 2007 и методами вариационной статистики [6].
Результаты исследований
Исследование включало три этапа. При реализации первого этапа было проведено моделирование туберкулиновой ГЗТ с определением корреляционной зависимости между размером воспалительной реакции в месте внутрикожного введения разведений ППД туберкулина и воспалительной реакции в месте внутрикожного введения M. bovis у самок морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием. Для чего была сформирована группа животных (n = 25), которым внутрикожно вводили микобакте-рии M. bovis в дозе 0,2 мг/0,1 см3. Спустя
месяц после сенсибилизации (период развития состояния туберкулиновой ГЗТ) всем животным в предварительно депилирован-ный участок, с правой боковой поверхности, вводили ППД туберкулин в дозах: 25, 5, 1 МЕ. Через 24 часа после введения разведений ППД туберкулина был осуществлен учет реакций путем измерения продольного и поперченного размера воспалительных зон на введение разведений ППД туберкулина и воспалительного процесса в месте введения микобактерий M. bovis. После этого определена корреляционная зависимость между воспалительной реакцией в месте введения разведений ППД туберкулина и размером воспалительной реакции в месте введения M. bovis, а также между суммарным значением ГЗТ на дозы ППД туберкулина и размером воспалительной реакции в месте введения микобактерий M. bovis. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Результаты корреляционного анализа продемонстрировали, что зависимость между аллергической реакцией на дозы 25, 5, 1 МЕ и размером воспалительной реакции в месте введения M. bovis выше среднего. Максимальное значение коэффициента корреляции было выявлено между суммарным значением аллергической реакции на введение ППД туберкулина и размером воспалительной реакции в месте введения M. bovis. В свою очередь, значение зависимости, полученное между суммой аллергической реакции на введение ППД туберкулина и размером воспалительной реакции на введение M. bovis, может быть использовано для построения математической модели позволяющей прогнозировать значение аллергической реакции на введение ППД туберкулина по раз-
Таблица 1.
Определение корреляции между кожной аллергической реакцией ГЗТ на введение ППД туберкулина и воспалительной реакцией на введение M. Bovis
Показатели Дозы ППД туберкулина Сумма аллергической реакции ГЗТ на введение ППД туберкулина (мм) Размер воспалительной реакции на введение M. bovis (мм)
25МЕ 5МЕ 1МЕ
r 0,55* 0,56* 0,63* 0,85* -
Примечание: * - результат достоверен при р < 0,05.
меру воспалительной реакции на введение M. bovis, что составило второй этап исследования.
При реализации второго этапа исследований была использована техника построения вариационного ряда предполагающего распределение значений суммы аллергической реакции на введение разведений ППД для млекопитающих и воспалительной реакцией на введение M. bovis, по интервалам. Данный подход применим для формирования групп(-ы) морских свинок по размеру воспалительной реакции на месте введения M. bovis. Результаты расчетов представлены в таблице 2.
В результате проведенных расчетов было получено пять интервалов с различным распределением частоты: максимальным,
соответствующим номеру 3, и минимальным, соответствующим номерам 1 и 5, соответственно. Применение результатов расчетов, представленных в таблице 2, предполагают группирование животных по размеру воспалительной реакции в месте введения M. bovis, входящий в соответствующий интервал в зависимости от количества, необходимого для проведения исследований. Определение общего количества животных, необходимое для получения группы, осуществляется согласно формулы N = n / f, где:
N - количество животных, взятое для сенсибилизации;
n - общее количество животных, используемое для проведения исследования;
f - частота интервала (табличное значение).
Таблица 2.
Интервалы воспалительной реакции на внутрикожное введение M. bovis и ППД туберкулина
Номер интервала Интервалы суммы аллергической реакции на введение ППД туберкулина (мм) Интервалы воспалительной реакции на введение M. bovis (мм) Частота интервала (f)
1 38,0-39,5 10,0-10,5 0,1
2 40,0-42,5 11,0-12,5 0,2
3 43,0-45,5 13,0-13,5 0,4
4 46,0-48,5 14,0-15,5 0,2
5 49,0-50,5 16,0-16,5 0,1
Группа сформированная стандартным способом (I), n = 12
Дозы ППД 25 МЕ 5 МЕ 1 МЕ Сумма аллергической реакции на введение ППД туберкулина
M±m 18±0,60 14,83±0,49 11,58±0,57 44,42±1,56
V 11,61 11,44 16,95 12
Группа сформированная по размеру воспалительной реакции на введение M. bovis (II), n = 12
Дозы ППД 25 МЕ 5 МЕ 1 МЕ Сумма аллергической реакции на введение ППД туберкулина
M±m 17,46±0,42 15,29±0,30 11,63±0,31 44,38±0,32
V 8,41 6,75 9,19 2,5
Таблица 3.
Вариация туберкулиновых реакций в группах морских свинок, сформированных стандартным способом и по размеру воспалительной реакции
на введение M. Bovis
Так, например, для получения группы морских свинок в количестве 12 (n) среднего значения интервала № 3 (10,5-11,5 мм), сформированных по критерию воспалительной реакции в месте введения M. bovis, требуется сенсибилизировать 30 голов (N).
Третьим этапом исследования была проверка расчетной модели. При реализации данного этапа исследования использовали 42 головы морских свинок, подобранных по массе, полу, возрасту, из числа которых 12 животных были получены без использования инбридинга, а 30 получены в результате инбридинга. Все животные были вну-трикожно сенсибилизированы M. bovis и через месяц использованы для проведения исследований.
Перед проведением исследований из числа животных второй группы были отобраны 12 голов интервала № 3 по размеру воспалительной реакции на месте введения M. bovis. После этого у животных двух групп морских свинок с боковой поверхности удаляли шерсть на площади размером 30 х 50 мм и вводили разведения ППД туберкулина в дозах: 25, 5, 1 МЕ. Через 24 часа были определены средние размеры реакций на введение ППД туберкулина и рассчитаны среднее арифметическое, ошибка среднего арифметического и вариация. Сравнение полученных результатов осуществлялось по коэффициенту вариации. Результаты исследования представлены в таблице 3.
Из полученных данных видно, что коэффициент вариации на дозы 25, 5 и 1 МЕ ППД туберкулина является слабым (V < 10 %) и ниже в группе животных, сформированных по размеру воспалительной реакции, в месте введения M. bovis, в сравнении с группой животных, сформированных стандартным подходом, где варьирование соответствует среднему уровню (V = 11-25 %).
Обсуждение результатов
Исследованиями, проведенными у детей, вакцинированных M. bovis BCG против туберкулеза, была продемонстрирована зависимость между воспалительной реакцией на введение вакцины (поствакцинальный рубчик) с кожной реакцией ГЗТ на введение
ППД туберкулина [4]. Данная зависимость приобрела широкое клиническое распространение, так как позволяет оценить предрасположенность к туберкулезу, которая, в свою очередь, обусловлена генетически [5]. Предрасположенность к туберкулезу у лабораторных животных (морских свинок), как было показано, также детерминировано генетически и значительно варьирует в пределах различных линий [3]. Так, например, животные с генотипом a, ep, s линия 2 относительно резистентны к туберкулезу, напротив, животные с генотипом a, ep, s линия 13 являются более чувствительными к туберкулезу [3]. Различная линейная восприимчивость морских свинок к микобактериям туберкулеза учитывается при проведении различных исследований зарубежными специалистами [9, 10]. В то же время в Российской Федерации использование линейных морских свинок и выведение разных линий для проведения исследований в области ветеринарной фтизиатрии ограничено отдельными экспериментами. Учитывая широкое использование морских свинок для моделирования ГЗТ, выведение линий для решения конкретных задач, например, таких как использования в тестах туберкулиновой ГЗТ, является актуальным.
Предварительные исследования по определению зависимости между аллергической реакцией на введение ППД туберкулина и воспалительной реакцией на введение M. bovis рандомбредным морским свинкам продемонстрировало среднюю корреляционную зависимость r = 0,4 при р < 0,05 [7]. Принимая во внимание наличие положительной корреляционной зависимости и литературные данные относительно различной чувствительности линий морских свинок к туберкулезной инфекции [3], были предприняты попытки путем инбридинга получить совокупность животных, характеризующихся более высоким коэффициентом корреляции между аллергической реакцией на введение ППД туберкулина и воспалительной реакцией на введение M. bovis. В свою очередь, чем выше показатель корреляции, тем более прогнозируемая получится модель [6]. После получения достаточного количества животных методом близкородственного скрещивания
была сформирована группа в количестве 25 голов, подобранных по полу, массе и возрасту.
Проведение на данных животных последующих исследований выявило закономерность: коэффициент корреляции на дозы 25, 5, 1 МЕ ниже, чем на суммарное значение реакции на месте введения ППД туберкулина. Полученные результаты предполагают: при проведении исследований с использованием нескольких доз ППД туберкулина учитывать суммарное значение реакции.
Практическое использование полученных данных предполагает разработку подхода формирования групп(-ы) морских свинок с помощью статистических методов. Среди методов статистики, наиболее подходящих для решения данной задачи, является техника построения вариационных рядов, позволяющая рассчитать классовые интервалы, включающие весь диапазон размеров воспалительных реакций в месте введения микобактерий M. bovis у морских свинок. В результате расчетов было получено пять интервалов с различной частотой встречаемости (f) значений, входящих в заданный интервал, характеризующий отношение количества особей с размером воспалительной реакции на месте введения M. bovis данного интервала к общему числу животных.
Практическая проверка полученной модели осуществлялась по вариации, представляющей собой среднеквадратическое отклонение, выраженное в процентах от величины средней арифметической, которая характеризует воспроизводимость метода [6]. Оценка разработанной модели осуществлялась на группе животных, полученных как без использования инбридинга, где не предполагалась подборка по размеру воспалительного процесса на месте введения M. bovis, а также животных, полученных методом близкородственного скрещивания, где предполагалась подборка по размеру воспалительного процесса на месте введения M. bovis. Полученные результаты продемонстрировали меньшую вариацию в группе животных, полученных близкородственным скрещиванием в сравнении с контрольной группой животных.
Выявленная зависимость применима при оценке иммуногенности разных доз вакцин против туберкулеза, определении биологической активности ППД туберкулинов, оценке свойства фармакологических препаратов подавлять туберкулиновую реакцию в зависимости от объема проводимых исследований. Так, например, при проведении единичных сравнительных исследований целесообразно использование небольшого количества животных центрального номера интервала 3, обеспечивающего частоту интервала, равную 0,4. В свою очередь, при проведении масштабных сравнительных исследований целесообразным является сенсибилизация не менее 100 голов животных, что обеспечит получение в группах количества животных от 10 и более и все номера интервалов.
Выводы
1. Использование морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием брат х сестра позволяет получать животных, характеризующихся большей корреляционной зависимостью между аллергической реакцией в месте введения ППД туберкулина и воспалительной реакцией в месте введения M. bovis в сравнении с рандномбредными животными.
2. При исследованиях, сопряженных с моделированием туберкулиновой гиперчувствительности замедленного типа, наиболее целесообразным является использование групп морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием и сгруппированных по размеру воспалительной реакции в месте введения M. bovis.
Список литературы
1. ГОСТ 16739-88. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для млекопитающих. - М. : Изд-во стандартов. - 21 с.
2. Дейл, М. М. Руководство по иммунофармаколо-гии / М. М. Дейл, Дж. К. Формен. - М. : Медицина, 1998. - 332 с.
3. Каркищенко, Н. Н. Основы биомоделирования / Н. Н. Каркищенко. - М. : Межакадемическое издательство ВПК, 2004. - 607 с.
4. Клименко, Л. И. Оценка качества вакцинации БЦЖ по развитию поствакцинального знака / Л. И. Клименко, Т. С. Полякова, И. Ю. Бучковская // Запорожский мед. журн. - 2012. - № 1 (70). - С. 86-88.
5. Кошечкин, В. А. Туберкулез / В. А. Кошечкин, З. А. Иванова - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 302 с.
6. Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. - М. : Высшая школа, 1990. - С. 50-51.
7. Мясоедов, Ю. М. Изучение корреляционных зависимостей между критериями оценки субклинической формы туберкулезного процесса / Ю. М. Мясоедов, С. В. Морозов // Материалы Межд. научно-практ. конф. посвященной 125-летию ветеринарии Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» 22-23.05.2008 г. - КурГСХА. -Курск. - С. 270-274.
8. Яблокова, Т. Б. Экспериментальное изучение препарата вакцины БЦЖ-М с уменьшенной анти-
генной нагрузкой / Т. Б. Яблокова, Н. Н.Писаренко, Д. Т. Леви и др. // Проблемы туберкулеза. - 1985. -№ 6. - С. 52-55.
9. Kawahara, M. Intradermal and oral immunization with recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the simian immunodeficiency virus Gag protein induces long-lasting, antigen-specific, immune responses in guinea pigs/ M. Kawahara, K. Matsuo, M. Honda // Clin. Immunol. - 2006. - Apr. 119 (1). -P. 67-68.
10. Zhi, W. HBASAC-BCG combined vaccine for intracutaneous injection and preparation method and thereof : Patent # US 7,579,003 B2, Aug. 25, 2009.
аппарат для импульснои виосинхронизировАнной электромагнитной терапии «уми-05»
На протяжении многих лет клиника БНПЦ ЧИН и Институт Ветеринарной Биологии (Санкт-Петербург) использует в своей практике уникальный прибор - генератор низкочастотного магнитного импульсного излучения большой мощности «УМИ-05» (ранее «УИМТ-2», «УИМТ-3»). Данный прибор применяется для моно- или комплексной терапии целого ряда заболеваний, которые ранее считались неизлечимыми или очень тяжело поддавались лечению.
Основные направления применения «УМИ-05»
• Заболевания мочевой системы: мочекаменная болезнь, пиелонефрит, поликистоз, цистит.
• Желчекаменная болезнь.
• Заболевания опорно-двигательного аппарата: остеохондроз позвоночника, дископатия, артрозо-артриты, бурсит, растяжение связок, ушибы, контрактуры суставов, миозит.
• Купирование эпилептических приступов и эпилептического статуса.
• Гипертензия.
• Отит гнойный.
• Отит аллергический.
Стандартный курс лечения
• 10 сеансов по 30-50 импульсов на одну патологическую область. Мощность 50-80 %. Курс можно повторить с перерывом в 10 дней.
• Профилактический курс для животных группы риска (остеохондроз, МКБ и пр.) -7-10 сеансов с интервалом 6 месяцев.
• Применение прибора не вступает в противоречие с использованием фармакологических и хирургических методов лечения.
• Магнитотерапию не следует проводить на области тела, содержащей металлоконструкции (например, штифты или пластины для остеосинтеза).
Экономика
• Быстрая окупаемость прибора.
• Минимальная затрата рабочего времени: длительность одного сеанса на одну патологическую зону - 2-3 минуты.
• Высокая эффективность лечения, полное излечение или введение животного в стойкую ремиссию по всем перечисленным заболеваниям гарантируют значительное увеличение рейтинга клиники в целом и приток новых клиентов.
Стоимость прибора 19 500 руб.
Заказать УМИ-05 можно по тел./факсу: (812) 927-55-92; по e-mail: virclin@mail.ru. Подробности на сайте: www.invetbio.spb.ru
