CC BY
50
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICOCHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 579:579.873.13
DOI: http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2018-8-4-55-64
РАЗРАБОТКА КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ ТВОРОЖНОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА BIFIDOBACTERIUM LONGUM B379M
© Е.Е. Базеева*, Е.В. Аверьянова*, Е.П. Каменская**
* Бийский технологический институт (филиал) «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова»
659305, Российская Федерация, г. Бийск, ул. им. Героя Советского Союза Трофимова, 27 ** Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова 656038, Российская Федерация, г. Барнаул, пр-т Ленина, 46
РЕЗЮМЕ. Рассмотрена роль нормальной микрофлоры кишечника, приведены доводы в пользу бифидо-бактерий, участвующих в поддержании гомеостаза организма человека, обоснована необходимость разработки питательных сред для их культивирования. Экспериментальная часть представляет собой поэтапную разработку компонентного состава питательной среды для штамма Bifidobacterium longum B379M. Творожная сыворотка как вторичный сырьевой ресурс молочной промышленности вполне подходит в качестве основы среды благодаря присутствию в ней питательных веществ. Использование молочной сыворотки позволяет также решить проблему ее рациональной утилизации при производстве творога. Исходя из питательных потребностей микроорганизмов подбирали необходимые компоненты, оптимальные количества которых определяли сравнением логарифма концентраций КОЕ в 1 мл культу-ральной жидкости образцов после 24 ч инкубирования при температуре 37 °С и величин активной кислотности как показателя кислотообразующей способности бифидобактерий на нескольких этапах культивирования. Для удовлетворения потребности в азоте исследовались панкреатический гидроли-зат казеина, пептон и дрожжевой экстракт, в качестве источников углерода - инулин, лактоза и глюкоза. Уделено внимание созданию нейтральной реакции среды, необходимой бифидобактериям, посредством добавления лимоннокислого натрия, аскорбиновой кислоты, раствора фосфатного буфера и нейтрализации среды в процессе культивирования раствором гидрокарбоната натрия. В результате выход клеток на разработанной питательной среде составил более 109 КОЕ/см3, что достаточно для лабораторных исследований.
Ключевые слова: Bifidobacterium longum В379М, активная кислотность, источники азота, источники углерода, инокулят, количество жизнеспособных клеток, культивирование, нейтрализация, сыворотка.
Информация о статье. Дата поступления 15 марта 2018 г.; дата принятия к печати 25 ноября 2018 г.; дата онлайн-размещения 29 декабря 2018 г.
Для цитирования: Базеева Е.Е., Аверьянова Е.В., Каменская Е.П. Разработка компонентного состава питательной среды на основе творожной сыворотки для культивирования штамма Bifidobacterium Longum B379M // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. Т. 8. N 4. С. 55-64. DOI: 10.21285/2227-2925-20188-4-55-64
DEVELOPMENT OF A WHEY-BASED CULTURE MEDIUM FOR GROWING BIFIDOBACTERIUM LONGUM B379M
© E.E. Bazeeva*, E.V. Averyanova*, E.P. Kamenskaya**
* Biysk Technological Institute (branch) of the Altay State Technical University 27, Geroi Sovetskogo Soyuza Trofimov St., Biysk, 659305, Russian Federation ** Altay State Technical University
46, Lenin Ave., Barnaul, 656038, Russian Federation
ABSTRACT. In the theoretical part of this paper, we discuss the role of natural intestinal microflora - in particular, bifidobacteria - in maintaining the homeostasis of the human body. We also explain the importance of the development of culture media for growing these important bacteria. In the experimental part, we present a step
wise development of a culture medium composition for growing the Bifidobacterium longum B379M strain. Milk whey, a secondary raw material of the dairy industry containing numerous nutrients, seems to be a suitable basis for such a medium. The use of milk whey for these purposes also solves the problem of its rational utilization in the production of cottage cheese. The constituent components of the culture under development were selected taking into account the nutritional needs of the bacteria. The optimal amounts of these components were determined by comparing the logarithms of CFU concentrations in 1 mL of culture samples following a 24hour incubation at 37°C and their active acidity values, which are considered to be indicative of the acid-forming ability of the bifidobacterium at its various cultivation stages. Pancreatic casein hydrolysate, peptone and yeast extract were used as sources of nitrogen; whereas inulin, lactose and glucose supplied the carbon requirement. A particular attention is paid to the creation of a neutral medium, which is necessary for bifidobacteria, by adding sodium citrate, ascorbic acid and a solution of phosphate buffer. The medium was also neutralized during the cultivation process using a sodium bicarbonate solution. As a result, the cell yield on the developed culture medium exceeded 109 CFU/cm3, which is sufficient for laboratory studies.
Keywords: Bifidobacterium longum B379M, active acidity, nitrogen sources, carbon sources, inoculum, living cell number, cultivation, neutralization, milk whey
Information about the article. Received March 15, 2018; accepted for publication November 25, available online December 29, 2018.
For citation: Bazeeva E.E., Averyanova E.V., Kamenskaya E.P. Development of a whey-based culture medium for growing Bifidobacterium Longum B379M. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya iBiotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2018, vol. 8, no. 4, pp. 55-64. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-4-55-64
ВВЕДЕНИЕ
Нормальная микрофлора человека играет важную роль в поддержании его гомеостаза и иммунитета. Еще бактериолог И.И. Мечников поднял вопрос об антагонистических взаимоотношениях в микробных сообществах пищеварительного тракта, а его ученик А. Тиссье в 1900 г. впервые выделил из кала грудных младенцев микроорганизмы, морфологически схожие с лактобактериями, но раздвоенной формы, получившие название Bacillus bifidus. С тех пор изучение бифидобактерий как основных представителей микрофлоры кишечника человека активно развивается. Ряд оказываемых ими положительных эффектов на организм человека включает синтез незаменимых аминокислот, витаминов, ферментов, бактерицидных веществ, препятствующих размножению патогенной флоры, обезвреживание токсинов, снижение уровня холестерина в крови и др. [1].
На очередном заседании Президиума РАН в марте 2016 г. академик О.В. Бухарин подчеркнул, что бифидофлора первой в кишечнике обнаруживает чужеродные частицы: выявив патоген, она пытается обезвредить и избавиться от него с последующим сигналом на Т-хелперы SD4 и на ре-гуляторное звено гомеостаза. В помощь бифидо-бактериям включается ряд защитных факторов: карнозин, интерферон, лизоцим, которые препятствуют проникновению и распространению патогенных микроорганизмов. Следовательно, защитная роль бифидобактерий очевидна [2].
В связи с тем что бифидобактерии выделены из кишечника человека, их культивирование в условиях in vitro сопряжено со сложностью создания благоприятных условий, аналогичных их обычной среде обитания, а необходимость разработки новых питательных сред связана с решением вопросов снижения их себестоимости, срока
накопления микробной биомассы и увеличением продолжительности хранения культуры [3].
В настоящее время для культивирования бифидобактерий используется печеночно-цистеино-вая среда (среда Блаурока), реже - тиогликолевая среда. Для использования в молочной промышленности рекомендована гидролизатно-молочная среда (ГМ-среда). Л.В. Домотенко и А.П. Шепели-ным выявлены некоторые преимущества культивирования на бифидум-среде [4]. Часто в качестве питательной среды применяется печеночный бульон с внесением компонентов растительного происхождения (экстракт картофеля, обезжиренная соя, тростниковый сахар, кукурузный экстракт, морковь, капуста, отруби, растительные экстракты) [5]. Легкость приготовления питательных сред также имеет значение, поэтому в сухом готовом виде, выпускаемом промышленностью, они удобны в использовании, но дорогостоящи. Для приготовления среды из натурального сырья важно иметь подходящую питательную основу и возможность дополнять ее перед использованием недостающими компонентами. С этих позиций перспективно использование в качестве такой основы творожной сыворотки. Во-первых, это решает вопрос утилизации крупнотоннажного отхода молокопе-рерабатывающей промышленности, во-вторых, творожная сыворотка содержит до 50% ценных сухих веществ молока, включая аминокислоты, аминосахара, лактозу, минеральные вещества, необходимые для роста и развития бифидобактерий [6].
Согласно данным, на которые опирается А.М. Амерханова, в кишечнике грудных детей преобладающими являются виды B. bifidum и B. longum, у взрослых - B. bifidum и B. adolescentis, в меньшей концентрации содержится B. Longum [7]. Однако проведенные Д.С. Янковским и его коллегами ис-
следования не подтвердили факт преобладания вида B. bifidum у новорожденных детей, находящихся на грудном вскармливании [8]. В диссертационной работе А.В. Чаплина показано, что B. longum обнаруживается у людей всех возрастных групп благодаря его широкой ферментативной активности, высокой жизнеспособности и быстрой адаптации к условиям меняющейся внешней среды1 .
Таким образом, целью настоящей работы является подбор компонентов питательной среды на основе творожной сыворотки для культивирования наиболее часто встречающегося вида бифи-добактерий B. longum на примере штамма B. longum B379M.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве источника бифидобактерий был выбран концентрат бифидобактерий жидкий производства ООО «Пропионикс» (г. Москва, Россия), содержащий штамм Bifidobacteruim longum B379M.
Для активации штамма использовали бифи-дум-среду производства Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (ГНЦ ПМБ) (п. Оболенск Московской обл., Россия) в количестве 100 мл, приготовленную согласно рецептуре с последующим термостатированием в течение двух суток при температуре 37 °С.
Творожную сыворотку, полученную на предприятии ООО «Алтайский молочник» (г. Бийск, Россия), анализировали на соответствие требованиям ГОСТ Р 53438-20092. Полученные данные представлены в табл. 1.
Анализ творожной сыворотки показал, что ее кислотность несколько превышала показатель нормы, но, согласно [6], данная величина входит в пределы допустимых значений для культивирования бифидобактерий. Остальные показатели качества соответствуют требованиям ГОСТ Р 53438-20092.
Перед приготовлением питательной среды творожную сыворотку раскисляли до рН=7,9. Для
1 Чаплин А.В. Сравнительная геномика штаммов Bifidobacterium longum, выделенных из кишечника здоровых людей: дис. ... канд. мед. наук; 03.02.-3. М., 2015. 123 с.
Chaplin A.V. Sravnitel'naya genomika shtammov Bifidobacterium longum, vydelennykh iz kishechnika zdorovykh lyudei. Diss. kand. med. nauk [Comparative genomics of Bifidobacterium longum strains isolated from the gut of healthy people. PhD thesis]. Moscow, 2015, 123 p.
2 ГОСТ Р 53438-2009. Сыворотка молочная. Техни-
ческие условия; утв. и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 03.12.2009 г. № 548-ст GOST R 53438-2009. Syvorotka molochnaya. Tekhni-cheskie usloviya [State standard 53438-2009. Whey.
поддержания кислотности среды на уровне 7,0 в питательную среду вносили фосфатный буфер в количестве 0,3% от объема и необходимые количества биологически активных веществ (БАВ), затем автоклавировали при избыточном давлении 0,5 атм. в течение 20 мин. В охлажденную среду вносили посевной материал в концентрации 5% от объема. Культивирование проводили при температуре 37 °С в течение 24 ч с нейтрализацией сыворотки через 8, 12 или 16 ч (по мере необходимости) стерильным 10%-ным раствором гидрокарбоната натрия.
Активную кислотность определяли на лабораторном переносном рН-метре АНИОН 4100 (ООО НПП «Инфраспак-Аналит», Россия).
Количественный учет микроорганизмов проводили на плотной кукурузно-лактозной среде. Состав питательных сред приведен в табл. 2. Подсчет колоний микроорганизмов проводили методом Коха в три этапа: приготовление разведений в физиологическом растворе с коэффициентом разведения 10, высев на плотную питательную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний после инкубации3 [9].
В качестве источников азота исследовали дрожжевой экстракт (производитель - ООО «Био-техновация», Россия), пептон и панкреатический гидролизат казеина (производитель - ГНЦ ПМБ), которые являются дополнительными источниками витаминов, в частности группы В, минеральных солей и аминокислот, необходимых для роста микроорганизмов.
Подбор углеводов проводили, опираясь на полученные ранее для штамма B. longum DK-100 диапазоны концентраций инулина (ООО «Рязанские просторы», Россия) и лактозы («Евросериум САС», Франция) [10]. В сравнении с ними также исследовалась глюкоза производства ГНЦ ПМБ.
Для поддержания рН на уровне 7,0 оптимальной для жизнедеятельности бифидобактерий, проводили подбор оптимальных концентраций лимоннокислого натрия (ООО «РЕАХИМ», Россия) и аскорбиновой кислоты (ООО «МСД», Россия) [11, 12].
Доза вносимого инокулята в образцы пита-
Specifications]. Moscow: Standartinform Publ., 2010, 8 p. 3 МУК 4.2.999-00. Методические указания. 4.2. Методы контроля. Биологичеакие и микробиологические факторы. Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах; утв. главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 08.11.2000 г.
MUK 4.2.999-00. Metodicheskie ukazaniya. 4.2. Metody kontrolya. Biologicheskie i mikrobiologiches-kie factory. Opredelenie kolichestva bifidobakterii v kislomolochnykh produktakh [Instruction 4.2.999-00. Methods of control. Biological and microbiological factors. Determination of bifidobacteria in cultured milk foods]. Approved 08.11.2000.
тельных сред составляла 5% с концентрацией жизнеспособных клеток бифидобактерий не менее 106 КОЕ/см3.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
На первом этапе исследований рассматривали потребность бифидобактерий в источнике
азотистого питания. С этой целью в сыворотку включали пептон, дрожжевой экстракт и панкреатический гидролизат казеина в различных концентрациях. Образцом для сравнения являлась собственно сыворотка. Данные об активной кислотности образцов в зависимости от концентрации источников азота приведены в табл. 3.
Таблица 1
Характеристика творожной сыворотки
Table 1
Characteristics of curd whey
Показатель Значение
регламентируемое ГОСТ Р 53438-2009 фактическое
Внешний вид и консистенция однородная жидкость, допускается наличие белкового осадка однородная жидкость с наличием белкового осадка
Цвет бледно-зеленый бледно-зеленый
Вкус и запах свойственный молочной сыворотке, кисловатый свойственный молочной сыворотке, кисловатый
Кислотность, °Т Плотность, кг/м3 Массовая доля сухих веществ, % Массовая доля лактозы, % не более 70 1020-1030 не менее 5,5 не менее 3,5 80 1026 6,3 4,7
Таблица 2
Состав питательных сред
Table 2
Composition of nutrient media
Среда Компонентный состав
Бифидум-среда Панкреатический гидролизат казеина - 30,0 г; экстракт пекарных дрожжей - 5,0 г; глюкоза - 7,5 г; лактоза - 2,5 г; цистеин - 0,5 г; натрий хлористый - 2,5 г; магний сернокислый - 0,5 г; кислота аскорбиновая - 0,5 г; натрий уксуснокислый - 0,3 г; агар - 0,9 г
Кукурузно-лактозная среда3 Кукурузный экстракт - 40 см3; лактоза - 10,0 г; пептон - 10,0 г; калий фосфорнокислый двузамещенный - 2 г; агар микробиологический - 2,5 г; натрий лимоннокислый трехза-мещенный - 6,0 г; магний сернокислый - 0,12 г; цистеин - 0,15 г
Таблица 3
Зависимость активной кислотности среды от вида и концентрации источника азота
Table 3
Dependence of medium active acidity on the type and concentration of the nitrogen source
Концентрация источника азота, г/см3 Активная кислотность, ед. рН через 12 ч Количество 10%-го раствора углекислого натрия, мл Активная кислотность, ед. рН через 24 ч
Пептон
0,5 6,40 0,7 6,64
1,0 6,65 0,6 6,85
1,5 6,71 0,6 6,66
2,0 6,78 0,6 6,66
Дрожжевой экстракт
0,5 6,64 0,7 6,63
1,0 6,59 0,7 6,64
1,5 6,52 0,8 6,56
2,0 6,54 0,8 6,53
Панкреатический гидролизат казеина
1,5 6,27 1,6 6,10
2,0 5,79 4,4 6,01
2,5 5,84 4,3 5,49
3,0 5,76 4,5 6,01
Без добавки (контроль)
0 6,45 0,7 6,64
Согласно полученным данным явно выраженная зависимость активной кислотности питательной среды прослеживается при добавлении панкреатического гидролизата казеина. Повышение кислотообразующей способности бифидобак-терий в присутствии панкреатического гидролизата казеина связано, вероятно, с высоким содержанием в нем свободных аминокислот. Данные о концентрации клеток к окончанию процесса культивирования приведены на рис. 1.
Из данных гистограммы, представленной на рис. 1, очевидно, что бифидобактерии лучше усваивают гидролизат казеина в концентрации 2,5 г/см3, чем остальные источники азота, так как через 24 ч логарифм концентрации клеток со-
25
ставляет 19,7, что в 1,2 раза больше, чем в контрольном образце (без внесения добавки). Возможно, это связано с более доступной формой азота для бактерий в гидролизате молочного белка.
На следующем этапе исследовали влияние источников углерода на кислотообразование би-фидобактерий и их концентрацию. Для этого, исходя из результатов предыдущего опыта, использовали сыворотку, оптимизированную панкреатическим гидролизатом казеина. На основе литературных данных и результатов собственных исследований были выбраны глюкоза, инулин и лактоза [10]. Результаты опытов представлены в табл. 4 и на рис. 2.
Концентрация Активная кислотность Количество 10%-ного раствора Активная кислотность,
источника углерода, г/см3 ед. рН через 12 ч углекислого натрия, мл ед. рН через 24 ч
Глюкоза
1,0 6,70 0,3 6,8
1,5 6,70 0,5 7,0
2,0 6,65 0,6 6,9
2,5 6,65 0,5 6,7
Инулин
1,5 6,70 0,4 6,78
2,0 6,68 0,4 6,64
2,5 5,97 0,6 6,84
3,0 5,94 0,7 6,87
Лактоза
1,0 6,8 0,3 7,1
1,5 6,8 0,3 7,2
2,0 6,8 0,3 7,2
2,5 6,7 0,4 7,2
Без добавки (контроль)
0 6,48 0,7 6,07
£ 20
11 15 Пегггсж
| - 10 Дкр™
g Гидрслизат
1 г г г Г -
0,5/0,5/1,5 1/1/2 1,5/1,5/2,5 2/2/3
Концентрация, г/см3
Рис. 1. Гистограмма зависимости концентрации клеток бифидобактерий от вида и концентрации источников азота (через 24 ч культивирования)
Fig. 1. Effect of type and concentration of nitrogen sources on bifidobacteria cell concentration (after 24 hours of cultivation)
Таблица 4
Зависимость активной кислотности среды от вида и концентрации источника углерода
Table 4
Dependence of medium active acidity on the type and concentration of the carbon source
Из данных, представленных в табл. 4, можно предположить, что наиболее предпочтительным источником углерода для бифидобактерий является инулин, так как именно при его внесении требуется больше нейтрализующего раствора в связи повышенным содержанием кислот.
К окончанию процесса культивирования логарифм концентрации бифидобактерий в образце с инулином в количестве 2 г/см3 был в 1,2 раза больше, чем в контроле без добавления данного углевода. Объясняется это тем, что инулин, относящийся к пребиотикам, более энергоемкий полисахарид по сравнению с дисахаридом лактозой и
21
моносахаридом глюкозой, позволяющий бифидо-бактериям с ферментной системой бетафруктози-даз извлечь больше энергии. Следовательно, наибольшего количества клеток можно добиться внесением именно инулина в концентрации 2 г/см3.
В качестве реагента, поддерживающего щелочную реакцию среды, был использован лимоннокислый натрий, который вносили в сыворотку, обогащенную источниками углерода и азота, в концентрации 0,4; 0,6 и 0,8 г/см3. Изменение активной кислотности среды в зависимости от концентрации раствора лимоннокислого натрия приведено в табл. 5.
со 20
s
о
Ш
О
* 19
18
го
^ 17
I
<u
I
о
* 16
15
ftHHl
«Лактоза
Инулин
I Глюкоза
Без внесения
1/1,5/1
1,5/2/1,5 2/2,5/2
Концентрация, г/см3
2,5/3/2,5
Рис. 2. Гистограмма зависимости концентрации клеток бифидобактерий от вида и концентрации источников углерода (через 24 ч культивирования)
Fig. 2. Effect of type and concentration of carbon sources on bifidobacteria cell concentration (after 24 hours of cultivation)
Зависимость активной кислотности среды от концентрации раствора лимоннокислого натрия
Dependence of medium active acidity on sodium citric-acid solution concentration
Таблица 5
Table 5
Концентрация раствора лимоннокислого натрия, г/см3
Активная кислотность, ед. рН через 12 ч
Количество 10%-ного раствора углекислого натрия, мл
Активная кислотность, ед. рН через 24 ч
Лимоннокислый натрий
0,4 0,6 0,8
4,90 5,90 5,50
4,00 2,90 3,20
6,80 7,00 6,70
Без добавки (контроль)
0
4,80
3,50
4,89
Согласно данным, представленным в табл. 5, использование названных концентраций позволяет достичь необходимой кислотности через сутки культивирования изучаемого штамма бифи-добактерий.
Зависимость концентрации клеток бифидо-бактерий от концентрации лимоннокислого натрия (через 24 ч культивирования) приведена на рис. 3.
По данным количественного учета бифидо-бактерий, лучшей стала концентрация лимоннокислого натрия 0,8 г/см3, поскольку при ней концентрация клеток по сравнению с контролем стала в 1,16 раз больше.
Традиционно веществом, поддерживающим окислительно-восстановительный потенциал, является аскорбиновая кислота. Влияние ее концентрации на кислотность полученной питательной
среды и количество клеток представлено в табл. 6 и на рис. 4.
Согласно данным табл. 6, аскорбиновая кислота в концентрации от 0,05 до 0,1 г/см3 положительно влияет на условия культивирования бифи-добактерий. При повышении ее концентрации реакция среды становится щелочной, что неблагоприятно сказывается на жизнедеятельности микроорганизмов.
При концентрациях 0,2 и 0,3 г/см3 рост клеток при количественном учете не наблюдался, поэтому на графике приведены только полученные данные, согласно которым лучшей концентрацией витамина С стала концентрация 0,1 г/см3. Количество клеток в одном миллилитре достигло 3,5109 КОЕ/см3, что в 4 раза больше по сравнению с контролем.
/с
ш
О
К
о т
е
ц
а р
т
н
е ц
н о
К
0
0,4 0,6 0,8
Концентрация, г/см3
Рис. 3. Гистограмма зависимости концентрации клеток бифидобактерий от концентрации натрия лимоннокислого (через 24 ч культивирования)
Fig. 3. Effect of sodium citric-acid concentration on bifidobacteria cell concentration (after 24 hours of cultivation)
Таблица 6
Зависимость активной кислотности среды от концентрации витамина С
Table 6
Dependence of medium active acidity on vitamin C concentration
Концентрация витамина С, г/см3 Активная кислотность, ед. рН через 8 ч Количество 10%-ного раствора углекислого натрия, мл Активная кислотность, ед. рН через 16 ч Количество 10%-ного раствора углекислого натрия, мл Активная кислотность, ед. рН через 24 ч
Витамин С
0,05 5,61 2,8 5,19 6,00 4,98
0,10 5,61 3,6 6,04 6,04 4,94
0,20 5,49 4,0 7,6 - 7,7
0,30 5,40 4,5 7,5 - 7,8
Без добавки (контроль)
0 - - 4,80 3,5 4,89
о Ш
О
о
н
ф
J го ср н
I
ф
J
I
о
22,5 22 21,5 21 20,5 20 19,5
0
0,05 0,1
Концентрация, г/см3
Рис. 4. Гистограмма зависимости концентрации клеток бифидобактерий от концентрации аскорбиновой кислоты (через 24 ч культивирования)
Fig. 4. Effect of ascorbic acid concentration on bifidobacteria cell concentration (after 24 hours of cultivation)
ВЫВОДЫ
Проведен подбор питательных веществ и их концентрации для культивирования бифидобактерий штамма Bifidobacterium longum B379M в жидкой среде, основой которой являлась творожная сыворотка, представляющая собой вторичный сырьевой ресурс молочной промышленности. Показано, что лучшим источником азота для изучаемого штамма микроорганизмов является панкреатический гидролизат казеина в концентрации 2,5 г/см3, а для удовлетворения потребности в углероде достаточно внесения инулина в концентрации 2 г/см3.
Установлено, что для поддержания щелочности среды следует вносить лимоннокислый натрий в концентрации 0,8 г/см3, для поддержания окислительно-восстановительного потенциала -
0,1 г/см3 аскорбиновой кислоты, для поддержания буферной емкости - 0,3% фосфатного буфера активной кислотности 7,0 ед. рН.
Выявлено, что перед стерилизацией паром под давлением сыворотку следует раскислять до активной кислотности 7,9 ед. рН с учетом снижения этого показателя до нейтрального после авто-клавирования. При этом нейтрализацию культу-ральной жидкости по мере необходимости в процессе культивирования проводили 10%-ным стерильным раствором гидрокарбоната натрия. При соблюдении предложенных условий выход клеток на разработанной питательной среде составляет 3,5109 КОЕ/см3, следовательно, полученная среда может быть рекомендована для культивирования бифидобактерий штамма B. longum B379М в лабораторных условиях.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Puneeth Kumar C.L., Sushma Saroja Y., Mu-kesh Kumar D.J., Kalaichelvan P.T. Bifidobacteria for life betterment // World Applied Sciences Journal. 2012. V. 17. No. 11. P. 1454-1465.
2. Шаракшанэ С. Инфекция - модель ассоциативного симбиоза [Электронный ресурс] // Материалы портала «Научная Россия». URL: https://sci-entificrussia.ru/articles/prezidium-ran-infek-tsiya-model-assotsiativnogo-simbioza (09.01.2018).
3. Капрельянц Л.В. Труфкати Л.В., Крупицкая Л.А. Питательная среда для культивирования бактерий рода Bifidobacterium на основе расти-тель-ного сырья // Науковий вюник Львiвського нацю-нального уыверситету ветеринарно'Г меди-цини та бютехнолопй iменi С.З. Гжицького. 2015. Т. 17, N 4 (64). С. 47-54.
4. Домотенко Л.В., Шепелин А.П. Бифидум-сре-
да для выделения и культивирования бифидобак-
терий // Инфекция и иммунитет. 2014. Т. 4. N 3. С. 279-283.
5. Утебаева А.А., Бурмасова М.А., Сысоева М.А. Перспективы использования бифидобакте-рий в продуктах функционального питания и лекарственных средствах // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. Т. 6. N 4. С. 100-109.
6. Арсеньева Т.П. Безотходные технологии отрасли. СПб: Изд-во НИУ ИТМО, 2014. 38 с.
7. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Амерха-нова А.М., Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Афанасьев М.С., Алешкин А.В., Несвижский Ю.В., Феклисова Л.В., Мескина Е.Р. Видовой состав бифидофлоры желудочно-кишечного тракта у детей // Астраханский медицинский журнал. 2014. Т. 9. N 1. С. 49-55.
8. Янковский Д.С., Дымент Г.С., ПотребчукЕ.П .
Получение пробиотически ценных штаммов би-фидобактерий // Здоровье женщины. 2009. N 4 (2). С.216-222.
9. Каменская Е.П., Аверьянова Е.В. Количественный учет микроорганизмов. Бийск: Изд-во Алтайского госуд. техн. ун-та им. И.И. Ползунова, 2007. 35 с.
10. Базеева Е.Е., Каменская Е.П. Исследование бифидогенных свойств некоторых углеводов // Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: материалы X Всерос. науч.-практ. конф. студентов, ас-
1. Puneeth Kumar C.L., Sushma Saroja Y., Mukesh Kumar D.J., Kalaichelvan P.T. Bifidobacteria for life betterment. World Applied Sciences Journal. 2012, vol. 17, no. 11, pp. 1454-1465.
2. Sharakshane S. Infektsiya - model' as-sotsiativnogo simbioza [Infection - a model of associative symbiosis]. Available at: https://scientificrus-sia.ru/articles/prezidium-ran-infektsiya-model-assot-siativnogo-simbioza (accessed 09.01.2018).
3. Kaprel'yants L.V., Trufkati L.V., Krupitskaya L.A. Nutrient medium for the cultivation of bacteria of the genus Bifidobacterium based on vegetable raw materials. Nauchnyi vestnik L'vovskogo natsional'no-go universiteta veterinarnoi meditsiny i biotekhnologii imeni S.Z. Gzhiczkogo [Scientific Bulletin of Lviv National University of veterinary medicine and biotechnologies named after S.Z. Gzhiczky]. 2015, vol. 17, no. 4 (64), pp. 47-54. (in Russian)
4. Domotenko L.V., Shepelin A.P. Bifidum-envi-ronment for the isolation and cultivation of bifidobacteria. Infektsiya i immunitet [Infection and immunity]. 2014, vol. 4, no. 3, pp. 279-283. (in Russian)
5. Utebaeva A.A., Burmasova M.A., Sysoeva M.A. Prospects for the use of bifidobacteria in functional foods and medicines. Izvestiya vuzov. Priklad-naya khimiya i biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016, vol. 6, no. 4, pp. 100-109. (in Russian)
6. Arsen'eva T.P. Bezotkhodnye tekhnologii ot-rasli [Waste-free technologies of industry]. St. Petersburg: NIU ITMO Publ., 2014, 38 p.
7. Zhilenkova O.G., Voronina O.L., Amerkhanova A.M., Karaulov A.V., Afanas'ev S.S., Aleshkin V.A., Afa-nas'ev M.S., Aleshkin A.V., Nesvizhskii Yu.V., Fek-lisova L.V., Meskina E.R. The species composition of
Критерии авторства
Базеева Е.Е., Аверьянова Е.В., Каменская Е.П. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Базеева Е.Е., Аверьянова Е.В., Каменская Е.П. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
пирантов и молодых ученых с международным участием (Бийск, 24-26 марта 2017 г.). Барнаул: Изд-во Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова, 2017. С. 401-404.
11. Пат. № 2013120619/10, Российская Федерация. Способ получения бактериального концентрата бифидобактерий в жидкой форме / И.С. Ха-магаева, Н.А. Замбалова. 2015.
12. Пат. № 2005140005/13, Российская Федерация. Способ производства сывороточного концентрата / Т.А. Волкова, Г.Д. Перфильев, Э.Ф. Кравченко, А.А. Демичева. 2005.
the bifidoflora of the gastrointestinal tract in children. Astrakhanskii meditsinskii zhurnal [Astrakhan Medical Journal]. 2014, vol. 9, no. 1, pp. 49-55. (in Russian)
8. Yankovskii D.S., Dyment G.S., Potrebchuk E.P. Obtaining probiotically valuable strains of bifidobacteria. Zdorov'e zhenshchiny [Women's health]. 2009, no. 4 (2), pp. 216-222. (in Russian)
9. Kamenskaya E.P., Averyanova E.V. Kolich-estvennyi uchet mikroorganizmov [Quantitative accounting of microorganisms]. Biisk: Altaiskii gosudar-stvennyi tekhicheskii universitet im. I.I. Polzunova Publ., 2007, 35 p. (in Russian)
10. Bazeeva E.E., Kamenskaya E.P. Issledova-nie bifidogennykh svoistv nekotorykh uglevodov [Study of the bifidogenic properties of certain carbohydrates]. Materialy X Vserossiiskoi nauchno-prak-tich-eskoi konferentsii studentov, aspirantov i molodykh uchenykh s mezhdunarodnym uchastiem «Tekhnologii i oborudovanie khimicheskoi, biotech-nologicheskoi i pishchevoi promyshlennosti» [Proc. Xth All-Rus. Sci. Pract. Conf. Int. Part. «Technologies and equipment for chemical, biotechnology and food industry»]. Barnaul: Altaiskii gosudarstvennyi tekh-nicheskii universitet im. I.I. Polzunova Publ., 2017, pp. 401-404. (in Russian)
11. Khamagaeva I.S., Zambalova N.A. Sposob polucheniya bakterial'nogo kontsentrata bifidobakterii vzhidkoi forme [Method of obtaining bacterial concentrate of bifidobacteria in liquid form]. Patent of RF, no. 2013120619/10, 2015.
12. Volkova TA., Perfil'ev G.D., Kravchenko E.F., Demicheva A.A. Sposob proizvodstva syvorotochno-go kontsentrata [Method for the production of whey concentrate]. Patent of RF, no. 2005140005/13, 2005.
Contribution
Bazeeva E.E., Averyanova E.V., Kamenskaya E.P. carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Bazeeva E.E., Averyanova E.V., Kamenskaya E.P. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Евгения Е. Базеева
Магистрант
Бийский технологический институт (филиал) «Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова» email: [email protected]
Елена В. Аверьянова
К.х.н., доцент кафедры биотехнологии Бийский технологический институт (филиал) «Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова» email: [email protected]
Елена П. Каменская
К.б.н., доцент, доцент кафедры технологии бродильных производств и виноделия Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова email: [email protected]
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
AUTHORS' INDEX Affiliations
Evgeniya E. Bazeeva
Master's Degree Student Biysk Technological Institute (branch) of the Altay State Technical University email: [email protected]
Elena V. Averyanova
Ph.D. (Chemistry), Associate Professor Department of Biotechnology Biysk Technological Institute (branch) of the Altay State Technical University email: [email protected]
Elena P. Kamenskaya
Ph.D. (Biology), Associate Professor
Department of the Technology of Fermentation
and Wine-making
Altai State Technical University,
email: [email protected]
