CC BY
9
42/2005 ^
_Вестник Ставропольского государственного университета ЩИ^
НЕЩШИСКИЕ нну к и I Фпзпологпл
РАЗРАБОТКА КАМПИЛОБАКТЕРИОЗНЫХ АФФИННЫХ МАГНОСОРБЕНТОВ ДЛЯ ОБСЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
Е.В. Алиева
THE ELABORATION OF KAMPYLOBAC-TERIOUS AFFINE MAGNOSORBENTS FOR THE INVESTIGATION OF ENVIRONMENT OBJECTS
Alieva E.V.
This paper presents a new method of express-detection of kampylobacteria in the environment objects with the help of magnoimmu-nosorbents, which allow to concentrate a small amount of the microbe located in the investigated material and then to reveal it by immu-noenzythatic analysis
В настоящее время существует проблема диагностики острых кишечных инфекций, вызванных кампилобактериями. Дело в том, что эти микроорганизмы обладают сложными биологическими свойствами и поэтому, традиционные методы диагностики не выявляют их в исследуемом материале. В данной работе представлен новый метод экспресс-детекции кампилобакте-рий в объектах внешней среды при помощи маг-ноиммуносорбентов, которые позволяют концентрировать небольшое количество микроба, находящегося в исследуемом материале, а затем выявлять его при помощи иммуноферментного анализа
УДК 579.252.55.001.2
В настоящее время значительное внимание специалистов, изучающих проблему острых кишечных заболеваний, привлекают микроорганизмы, роль которых в этиологии этих заболеваний ранее была неясна. Из числа таких «новых» инфекций наибольший интерес представляет кампилобактериоз, что обусловлено его чрезвычайно широким географическим распространением, интенсивной циркуляцией среди людей и животных, значительными показателями заболеваемости и существенным социально-экономическим ущербом от этой инфекции. Зарегистрировано множество кампилобактери-озных вспышек, обусловленных употреблением контаминированной питьевой воды, непастеризованного молока и других пищевых продуктов. Спорадические случаи кам-билобактериоза связывают с активацией эпизоотического процесса среди кур и употреблением населением инфицированных яиц и мяса птицы (1, 6, 8).
Серологические методы исследований при кампилобактериозе играют важную роль при крупномасштабных эпидемиологических исследованиях, в то время как их роль в диагностике спорадических случаев относительно невелика. В практике используют как традиционные (РА, РСК, РКА, РНГА), так и современные методики (ИФА, иммунный блотинг, иммуноэлектрофорез, латекс-агглютинация). Несмотря на высокую чувствительность названных лабораторных методов исследования, их использование для выделения и индикации возбудителей кам-
Алиева Е.В.
«Разработка кампилобактериозных аффинных магносорбентов...»
пилобактериоза и их антигенов, присутствующих в различных объектах внешней среды, не всегда обеспечивает качественный микробиологический мониторинг этой инфекции. В последние годы медицина обогатилась новыми методами исследований, в которых используются новейшие достижения биотехнологии, одним из которых является разработка и внедрение твердофазных носителей, в том числе различных сорбентов. Приобретение последними биоспецифических качеств достигается путем иммобилизации на поверхности или в структуре матрицы различных лигандов белковой природы. Новый этап усовершенствования матриц связан с включением в них магнитного материала (2, 3, 7).
Целью настоящих исследований является разработка аффинных магносорбентов для детекции кампилобактериоза в объектах внешней среды в иммуноферментном анализе.
В работе использовали типичные штаммы кампилобактеров - С)е_|иш, С.соП, которые имеют наибольшее значение в этиологии заболевания у людей. Из их биомассы извлекали специфичные антигенные
комплексы, объединяли, получали полигрупповой водорастворимый антиген, который служил иммуногеном при получении гипериммунных сывороток. Иммунизацию проводили по схеме, предложенной И.С. Тюменцевой с соавт. (5). Активность антигенов, сывороток, иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффу-зии (РИД) по О. Оухтерлони (10). Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных из сыворотки каприловой кислотой по О. 81е1ЬисЬ, Я. Ап^ап (11), с ферментом-пероксидазой хрена проводили по методу Я. Какапе (9), очистку конъюгата от несвя-завшегося фермента осуществляли гель-фильтрацией с использованием сефадекса О-100 на хроматографической установке. Маг-ноиммуносорбенты (МИС) готовили согласно разработкам, биотехнология которых защищена патентом РФ (4), корректируя и оптимизируя параметры для данного патогена.
Схема получения МИС кампилобакте-риозных включает следующие стадии:
42/2005
Вестник Ставропольского государственного университета
В результате корректировки и оптимизации параметров получены высококачественные сорбенты. Рекомендованы следующие условия получения МИС кампилобак-териозных для ИФА: соотношение компонентов синтеза 5:2:1: соответственно окись железа, полиглюкин, алюмосиликат; время гелеобразования -1-2 ч при температуре (24 +4) 0С; время иммобилизации 4 часа, температура 37 0С.
Постановку ИФА с МИС осуществляли по следующей схеме:
В работе использовали полученные конъюгаты иммунопероксидазные кампило-бактериозные с рабочим титром 1:400. Для оптимизации постановки ИФА с кампило-бактериозным МИС изучено влияние различных параметров. В результате установлено, что 30 мин инкубации МИС с антигеном и конъюгатом в его рабочем разведении является оптимальным. Выявление активности после ферментспецифического субстрата происходит в течение 1-2 мин. В качестве отрицательного контроля использовали гра-
нулы МИС, не контактировавшие с антигеном, но взаимодействующие с конъюгатом иммунопероксидазным. Учёт результатов ИФА производили визуально и с помощью сканирующего прибора "Мультискан" при длине волны 492 нм. В опытных пробах наблюдалось интенсивное оранжевое окрашивание, в контрольных- слабое желтое окрашивание или раствор был прозрачным. Положительной считали пробу, показания оптической плотности которой в 2 и более раз превышали показания контроля. Чувствительность ИФА с кампилобактериозным антигеном составила 1х10 2 мк/мл.
На основе разработанных кампилобак-териозных МИС и оптимизации постановки ИФА нами сконструирована тест-система диагностическая для обнаружения возбудителей кампилобактериоза в иммунофер-ментном анализе. Состав тест-системы: ди-агностикум магноиммуносорбентный им-муноглобулиновый кампилобактериозный; взвесь кампилобактериозного микроба (положительный контроль); конъюгат иммуно-пероксидазный кампилобактериозный; фос-фатно-солевой буфер (ФСБ); бычий сывороточный альбумин (БСА); твин-20; цитрат-ный буфер; гидроперит; хромаген; стоп-реагент.
Данная тест-система прошла апробацию в лабораторных условиях и во время паводка в Пятигорске, Железноводске и Ессентуках (лето 2002 г.). Обследовались сточные воды и воды открытых водоемов на наличие в них возбудителей кампилобакте-риоза. При исследовании получены следующие результаты: в среднем в сточных водах в 26% обнаруживались кампилобак-териозные антигены, в воде открытых водоемов - до 24 %. Высокая эффективность данной тест-системы обеспечивается за счет избирательного концентрирования возбудителей кампилобактериоза на магноиммуно-сорбенте; возможности максимального освобождения от посторонней микрофлоры путем многократных промываний без потери выделяемых микроорганизмов при исследовании сильно загрязненных проб воды.
Таким образом, разработанная тест-система магноиммуносорбентная антитель-
Алиева Е.В.
«Разработка кампилобактериозных аффинных магносорбентов...»
ная для экспресс-детекции кампилобактеров способствует более быстрому и точному выявлению этих возбудителей в объектах внешней среды, что позволяет увеличить количество исследуемых проб за единицу времени. Это особенно важно в той сложной обстановке, которая возникает в период чрезвычайных ситуаций.
ЛИТЕРАТУРА
1. Минаев В.И., Николаева Т.Н., Смирнов В.Н. и др. Эпидемиологические характеристики единичных заболеваний кампилобактериозом городских жителей // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - 1994. - №4. - С.32-35.
2. Ефременко В.И. Магноиммуносорбенты в микробиологических исследованиях. - Ставрополь: «Ставрополье», 1996. - 131 с.
3. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Саратов, 1996. - 57с.
4. Жарникова И.В., Тюменцева И. С., Ефременко В.И., Бинатова В.В. Патент РФ № 213881. Бюл. №27 от 27.09.99. Способ получения имму-носорбента (варианты).
5. Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Ефременко В.И., Базиков И.А., Алиева Е.В. Способ получения диагностической сыворотки // Патент РФ №2135210 от 27.08.99.
6. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.А. Кампилобакте-риоз. Лекции по инфекционным болезням. - М., 1999. - С.185-193.
7. Жарникова И.В. Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. -Ставрополь, 2004. - 39с.
8. Пожалостина Л.В. Этиологическая структура острых кишечных инфекций в России в начале XXI века // Медицинская микробиология - XXI век (28-30 октября 2004, Саратов). - Саратов 2004. - С. 183-184.
9. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody - a new method of conjugation //J.Histochem. Cytochem. - 1974. - V.22, N 4. -P.506-508; 1084-1091.
10. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel //Acta Path. Microbiol Med.- 1949. - Vol.26. -P. 507-515.
11. Steibuch G., Andran R The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of caprilic // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. - 1969. -V.139. - P. 279-284.
Об авторе
Алиева Елена Васильевна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии Ставропольской государственной медицинской академии, соискатель Ставропольского научно-исследовательского противочумного института. Сфера научных интересов - разработки в области биотехнологии.
