CC BY
41
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №04-3/2017 ISSN 2410-6070_
УДК 616-093/-098
Румянцева Т.А.
к.м.н.
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора г. Москва, Российская Федерация
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ТЕСТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА
Аннотация
Бактериальный вагиноз - самое распространенное инфекционное заболевание в гинекологической практике. В России методы диагностики, считающиеся «золотым стандартом», не применяются. В ходе данной работы разработан и валидирован метод диагностики бактериального вагиноза, заменяющий «золотой стандарт», его диагностические характеристики оценены в международных исследованиях.
Ключевые слова
Бактериальный вагиноз, полимеразная цепная реакция, критерии Амселя, баллы Ньюджента.
Бактериальный вагиноз (БВ) - инфекционный невоспалительный синдром полимикробной этиологии, который характеризуется количественным снижением или полным исчезновением лактобактерий, особенно Ш02-продуцирующих, и резким увеличением облигатно- и факультативно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов [1, с.32].
По имеющимся данным, БВ обнаруживают у 5-17% практически здоровых женщин и у 30-38% женщин, предъявляющих жалобы на наличие вагинальных выделений [2, с.58]. Наиболее частым признаком БВ являются беловато-серые выделения из половых путей, часто с неприятным «рыбным» запахом [3, с.3].
К наиболее опасным осложнениям БВ относят следующие: ВЗОМТ; послеоперационные осложнения (тазовый целлюлит, эндометрит); осложнения беременности: самопроизвольные аборты, преждевременные роды, гипотрофия плода, хориоамнионит [4, с. 342].
При диагностике и лечении БВ стоит учитывать, что нормальная микрофлора влагалища, представленная преимущественно лактобактериями (Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus inners), может включать и другие виды бактерий в достаточно высоких концентрациях [5, с.38].
С развитием БВ могут быть ассоциированы более 200 видов микроорганизмов, в связи с чем выявление всех ассоциантов не представляется возможным. Несмотря на то, что поискам микроорганизмов, наиболее значимых в развитии БВ, посвящено огромное количество исследований, наиболее распространённым маркерным микроорганизмом по-прежнему является G.vaginalis, выявляемая у 95-100% пациенток с БВ. Вторым по значимости микроорганизмом при развитии БВ является A. vaginae. Этот возбудитель - второй по частоте обнаружения в составе биопленки после G.vaginalis. Было продемонстрировано, что количественное выявление G.vaginalis, A. vaginae и лактобактерий обеспечивает высокую диагностическую чувствительность и специфичность в диагностике БВ [6, с.4611].
Диагностика БВ.
В соответствии с европейскими руководствами, для диагностики БВ могут применяться следующие подходы:
• Клинические критерии (критерии Amsel) [7, с.21];
• Микроскопический метод с оценкой баллов Nugent [8, с.300].
Клинические критерии Amsel и диагностика на основании подсчёта баллов Nugent в РФ используется крайне редко (2 лаборатории).
Целью данной работы стала разработка и валидация молекулярно-биологического метода диагностики
БВ.
Данное научное исследование проводится при поддержке Фонда содействия развитию малых форм
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №04-3/2017 ISSN 2410-6070_
предприятий в научно-технической сфере по программе «УМНИК» по теме «Разработка молекулярно-биологического метода диагностики бактериального вагиноза» в рамках договора №9754ГУ2/2015 от 15.02.2016г.
Разработка.
Разработан метод диагностики БВ (количественное определение ДНК G.vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp. и общего количества бактерий в биологическом материале), основанный на одновременном проведении реакции амплификации (мультипрайм-ПЦР) участков ДНК G.vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp. и ДНК общего количества бактерий с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени».
На основании расчета коэффициентов соотношений концентраций выявленных микроорганизмов автоматически выдаются следующие заключения:
• «Соотношения концентраций ДНК микроорганизмов соответствуют бактериальному вагинозу» ,
• «На основании соотношений концентраций ДНК микроорганизмов БВ не установлен»,
• «Соотношения концентраций ДНК микроорганизмов соответствуют промежуточному состоянию микрофлоры».
Валидация.
Завершено 3 исследования по валидации данного набора реагентов:
1) В исследовании были использованы образцы биологического материала от 222 женщин репродуктивного возраста, обратившихся к акушеру-гинекологу с жалобами на дискомфорт и выделения из половых путей. Материалом для исследования служило отделяемое влагалища, полученное стерильным ватным зондом.
Использованы следующие методы диагностики БВ: критерии Amsel, метод Nugent и метод ПЦР в режиме реального времени (разработанный тест «Флороценоз-БВ»).
Результат: Получены следующие диагностические характеристики набора «Флороценоз-Бактериальный вагиноз»: ДЧ=98,5%, ДС=96,8%.
2) В исследование были включены 100 женщин, проходящих ежегодную диспансеризацию. При осмотре от каждой пациентки получали 3 вагинальных образца: два образца для проведения микроскопии нативного и окрашенного препарата и один образец для проведения ПЦР («Флороценоз -БВ»). Микроскопическое исследование проводили в Бельгии (проф. Дондерс). Исследование с помощью теста «Флороценоз -БВ» проводили в ФБУН ЦНИИЭ. Далее проводили сопоставление полученных результатов.
Результат: Получены следующие диагностические характеристики набора «Флороценоз-Бактериальный вагиноз» ДЧ = 92,8%, ДС = 85,7%.
3) В исследование были включены образцы от 163 пациенток. Диагноз БВ устанавливался на основании критериев Амселя и методики пиросеквенирования (в ранее проведенном исследовании). В рамках данной работы эти образцы были дополнительно протестированы с применением набора «Флороценоз-БВ», далее было проведено сравнение полученных результатов с референсными данными, а также оценены возможности оптимизации интерпретации данных, полученных с применением разработанного набора реагентов.
Результат: Получены следующие диагностические характеристики набора «Флороценоз-Бактериальный вагиноз» ДЧ = 100%, ДС = 91% (относительно критериев Амселя) и ДЧ = 98%, ДС = 91% (относительно пиросеквенирования). При изменении параметров интерпретации возможно улучшение показателей и диагностика БВ с точностью 99-100%. Список использованной литературы:
1. Гомберг, М.А. Бактериальный вагиноз и новые инфекции, с ним ассоциированные / М.А. Гомберг // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2010. - № 2. - С. 32-34.
2. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually Transmitted Disease Treatment Guidelines, 2010. / USA:MMWR, 2015. -116c.
3. Лабораторная диагностика бактериального вагиноза: методические рекомендации / под общ. ред. Савичевой А.М. - С.-Петербург: Н-Л, 2011. - 28с.
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №04-3/2017 ISSN 2410-6070_
4. Решетько, О.В. Бактериальный вагиноз при беременности: современное состояние проблемы и значение фармакотерапии / О.В. Решетько, К.А. Луцевич // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2007. - № 4. - С. 337-350
5. Руководство по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта / под общ. ред. Домейки М., Савичевой А. М. - С.-Петербург: Н-Л, 2012. - 288с.
6. Beverly, E. Shа. Utility of Amsel Criteria, Nugent Score, and Quantitative PCR for Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, and Lactobacillus spp. for Diagnosis of Bacterial Vaginosis in Human Immunodeficiency Virus-Infected Women / Beverly E. Sha, Hua Y. Chen, Qiong J. Wang, M. Reza Zariffard, Mardge H. Cohen, Gregory T. Spear. // Journal of Clinical Microbiology. - 2005. - vol. 43 no. 9. - С. 4607-4612
7. Amsel, R. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations / R. Amsel, P.A. Totten, C.A. Spiegel, K.C. Chen, D. Eschenbach, K.K. Holmes // American Journal of Medicine. - 1983. - 74. - С. 14-22. doi: 10.1016/0002-9343(83)91137-3
8. Nugent, R.P. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation / R.P. Nugent, M.A. Krohn, S.L. Hillier // Journal of Clinical Microbiology 1991. - 29. - С. 297-301
© Румянцева Т.А., 2017
