CC BY
63
УДК 615.072:543.544.5.068.7 http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-12-184-188
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДСТВЕННЫХ ПРИМЕСЕЙ В СУБСТАНЦИИ НОВОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СОЕДИНЕНИЯ НООТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ - VMA-10-13 Волокитина Д.С., Лазарян Д.С., Волокитин С.В., Морозов А.В. Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУВО ВолгГму, г. Пятигорск, Российская Федерация Аннотация. Новое биологически активное соединение производное хиназолин-4(3Н) -она:3-[2-(2-Метилфениламино) -2-оксоэтил]-хиназолин-4(3Н)-он (лабораторный шифр VMA-10-13). Родственную примесь (исходный продукт синтеза) - незамещенный хиназолин-4(3Н)-он, определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с градиентом растворителя. Определены оптимальные условия, разработана методика определения родственной примеси в субстанции VMA-10-13 и проведена ее валидация. Доказана специфичность, линейность, правильность и прецизионность разработанной методики. Ключевые слова: производное хиназолин-4(3Н)-она, родственные примеси, валидация, биологически активное соединение. DEVELOPMENT AND VALIDATION OF THE METHOD OF DETERMINING RELATED IMPURITIES IN THE SUBSTANCE OF NEW BIOLOGICALLY ACTIVE CONNECTION OF NOOTROPIC ACTION - VMA-10-13 Volokitina D.S., Lazaryan D.S., Volokitin S. V., Morozov A. V. Рyatigorsk medical pharmaceutical institute of Volgograd state medical university, Pyatigorsk, Russian Federation Annotation. New biologically active compound derived quinazolin-4 (3H) -one: 3- [2- (2-Methylphenylamino) -2-ox-oethyl] -quinazolin-4 (3H) -one (laboratory code VMA -10-13). A related impurity (starting product of the synthesis), unsubsti-tuted quinazolin-4 (3H) -one, was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) with a solvent gradient. Optimal conditions were determined, a method for determining the related impurity in the substance VMA-10-13 was developed and validated. The specificity, linearity, accuracy and precision of the developed method are proved. Key words: quinazolin-4 (3H) -one derivative, related impurities, validation, biologically active compound.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК [1 ] Государственная Фармакопея Российской Федерации. Изд. XIV, т.1. М., 2018. URL: http://femb.ru/femb/phar-macopea.php [2] Руководство для предприятий фармацевтической промышленности / Методические рекомендации. - М.: «Спорт и культура-2000», 2007. - 192 с. [3] Производные хиназолина, обладающие ноотропной и антигипоксической активностью: пат. 2507198 Рос. Федерация. № 2012138665/04; заявл. 10.09.2012; опубл. 20.02.2014. Бюл. № 5. - 12 с. [4] Шатц В.Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология применения в лекарственной химии / В.Д. Шатц, О.В. Сахартова -Рига: Зинатне, 1988.- 390 с. [5] Moldoveanu S.C., David V. Essentials in Modern HPLC Separations. - Amsterdam: Elsevier, 2013. - 533 p. REFERENCES [1] Gosudarstvennaja Farmakopeja Rossijskoj Federacii. Izd. XIII. Vol. 1. Moscow, 2015. Available at: http://feml.scsml.rssi.ru/feml. [2] Guide for enterprises of the pharmaceutical industry / Methodical recommendations. - M.: «Sport and Culture-2000», 2007. - 192 p. [3] Quinazoline derivatives, possessing nootropic and antihy-poxic activity: patent 2507198 Rus-sian federation. № 2012138665/04; date of filing: 10.09.2012; date of publication: 20.02.2014 Bull. 5.- 12 pp. [4] Schatz V.D. High Performance Liquid Chromatography: Fundamentals of Theory. Methodology of use in medicinal chemistry / V.D. Schatz, O.V. Sakhartova - Riga: Zinatne, 1988.- 390 p. [5] Moldoveanu S.C., David V. Essentials in Modern HPLC Separations. - Amsterdam: Elsevier, 2013. - 533 p.
В настоящее время одним из перспективных направлений в фармацевтической практике является разработка и внедрение эффективных препаратов для
улучшения мозгового кровообращения, обладающих наименьшим количеством побочных эффектов.
Указанными свойствами обладает новое биологически активное соединение (БАС) УМЛ-10-13
синтезированное в Волгоградском государственном медицинском университете и являющееся производным хиназолина [3]. По химической структуре VMA-10-13 представляет собой: 3-[2-(2-метилфениламино)-2-оксоэтил]-хинозолин-4(3Я)-он. Исходя из схемы получения VMA-10-13, родственной примесью в его субстанции может быть незамещенный хиназолин-4(3Я)-он.
Целью настоящего исследования явилась разработка и валидация методики определения родственной примеси незамещенного хиназолин-4(3Я)-он в субстанции нового БАС VMA-10-13 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с градиентом растворителя [1, 4, 5].
Материалы и методы исследования. В исследованиях использовалась хроматографическая система для ВЭЖХ «Стайер» (компания «Аквилон», Россия), колонка Luna C-18, 4,6*150 мм. Для приготовления подвижной фазы использовали 1 М фосфорную кислоту, воду для ВЭЖХ, ацетонитрил для хроматографии. В работе использовали пять лабораторных серий субстанции VMA-10-13.
Результаты исследований и их обсуждение. В результате проведенных исследований для определения примеси незамещенного хиназолин-4(3Я)-она в субстанции VMA-10-13 были выбраны следующие хроматографические условия:
- подвижная фаза: ацетонитрил (А) - кислота фосфорная 0,05М (Б);
- режим элюирования - градиентный (от 0-6 мин 10% подвижной фазы А - 90% подвижной фазы Б; от 6-12 мин 40% подвижной фазы А и 60% подвижной фазы Б; от 12-20 мин 90% подвижной фазы А и 10% подвижной фазы Б);
- температура колонки - 25±2°С;
- скорость потока подвижной фазы - 1,0 мл/мин;
- объем вводимой пробы - 20 мкл;
- детектор - спектрофотометрический;
- длина волны детектирования - 226 нм;
- время регистрации хроматограммы - около 20 минут.
Валидацию методики проводили по параметрам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость), предел обнаружения и предел количественного определения [1, 2].
Для подтверждения специфичности проанализирована модельная смесь, состоящая из раствора субстанции \МА-10-13 (0,2 мг/мл) и примеси незамещенного хиназолин-4(3Я)-она (0,2 мкг/мл). Идентификацию веществ на хроматограмме (рис. 1) осуществляли путем сравнения времен удерживания испытуемых веществ и стандартных образцов. Анализ «холостой» хроматограммы (растворителя - этанола 96%) показал отсутствие мешающих посторонних пиков.
При анализе модельной смеси оценены параметры специфичности: время удерживания коэффициент разделения (К), коэффициент асимметрии (А), количество теоретических тарелок (Ы), а также относительное стандартное отклонение площадей пиков (RSD, %). Коэффициент разделения (Я^) пика примеси хиназолин-4(3Я)-она и основного вещества составил 80,48, это свидетельствует о хорошем разделении (критерий приемлемости не менее 2). Количество теоретических тарелок составило более 1500. Коэффициент асимметрии пика хиназолин-4(3Я)-она равен 1,13 (критерий приемлемости от 0,8 до 1,5). Относительное стандартное отклонение (RSD) площадей пиков исследуемой примеси составило не более 2%. Полученные данные свидетельствует о приемлемом разрешении и воспроизводимости хроматографической системы.
Рис. 1. Хроматограмма раствора модельной смеси VMA-10-13 и незамещенного хиназолин-4(3Я)-она
Линейность методики определяли на 7 уровнях концентраций незамещенного хиназолин-4(3Я)-она в подвижной фазе (0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5% от содержания основного вещества - субстанции \МА-10-13). Каждый раствор хроматографировали не менее трех раз и по полученным результатам строили прямую зависимости аналитического сигнала (площади пика) от концентрации вещества в растворе (табл.1, рис.1).
Как следует из полученных результатов (табл. 1), выполнение неравенства: свободный член уравнения линейной зависимости (а) меньше или равен его доверительному интервалу (Аа) показывает отсутствие
систематической погрешности методики. Коэффициент корреляции (г>0,9980) показывает жесткость линейной связи. Поэтому, данную методику можно считать валидированной по показателям линейность и правильность.
Используя параметры линейной зависимости (стандартное отклонение свободного члена линейной зависимости и угол ее наклона Ь), были рассчитаны предел обнаружения (ПО) и предел количественного определения (ПКО) [1, 2]:
ПО=3,3^а/Ь =3,3^ 1,42/185,1=0,025 мкг/мл ПК0=10-§а/Ь =10^ 1,42/185,1=0,077 мкг/мл
Таблица 1
Результаты определения линейной зависимости площадей пика от концентрации растворов
незамещенного хиназолин-4(3Н)-она
Концентрация примеси, МКГ/МЛ (Xi) Количество примеси (%) от со-держанияУМА-10-13 Площадь пика, тУсек(у) Параметры линейной зависимости у=bx+a
0,100 0,050 17,56 b = 185,1 Sb = 2,488 Ab = 6,4 a = 0,731 Sa = 1,420 Aa =3,650 S0 = 1,995 r = 0,9995 у =185,1 X +0,731
0,199 0,101 37,11
0,299 0,151 57,67
0,398 0,202 76,22
0,598 0,302 109,33
0,797 0,403 150,44
0,996 0,504 183,55
Критерии приемлемости параметров линейной зависимости
Критерий Полученные значения Вывод
|а| <Да=и95%, n-2) • Sa 0,731<3,650 Выполняется
r > 0,9980 0,9995>0,9980 Выполняется
0.0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Концентрация, мкг/ мл
Рис. 2. График зависимости площади хроматографического пика от концентрации незамещенного хиназолин-
4(3Н)-она
Определение прецизионности (сходимости) проводили по девяти точкам на трех уровнях содержания незамещенного хиназолин-4(3Н)-она (0,05%; 0,1% и 0,15% от содержания субстанции \МА-10-13). Для этого по 0,05 г (точная масса) субстанции УМА-10-13 помещали в 9 мерных колб вместимостью 250 мл, прибавляли 100 мл этанола 96% и обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут, прибавляли растворы незамещенного хиназолин-4(3Н)-она с концентрацией 5 мкг/мл до получения концентраций, соответствующих 0,05%; 0,1% и 0,15% от содержания основного вещества и доводили объем колб этанолом 96% до метки. Каждый из растворов хроматографировался не менее 3 раз.
Концентрацию незамещенного хиназолин-4(3Н)-она в модельных растворах, мкг/мл (Х) рассчитывали по формуле:
5 • С0
Х = -¡Г
- площадь пика хиназолин-4(3Н)-она в модельном растворе;
5о - площадь пика в растворе стандартного образца хиназолин-4(3Н)-она;
Со - концентрация раствора стандартного образца хиназолин-4(3Н)-она, мкг/мл.
Полученные результаты определений приведены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты определения прецизионности (сходимости) методики
Уровень Взято примеси, мкг/мл Площадь пика, iriV-сек Найдено примеси, мкг/мл Найдено примеси, % Метрологические характеристики
1 0,0994 18,09 0,0958 96,35 X = 96,95 S = 1,57 % = 0,52 RSD =1,62% АХ =3,75 АХ = 1,21 £ = 3,87% £ = 1,25% 5= \Х - 100\ = 3,05
18,72 0,0991 99,70
17,85 0,0945 95,07
2 0,2028 37,15 0,1967 96,98
36,34 0,1924 94,87
36,84 0,1950 96,17
3 0,3012 55,57 0,2942 97,67
56,12 0,2971 98,64
55,24 0,2924 97,09
Со = 0,198; So = 37,4
Критерии приемлемости прецизионности (сходимости)
Тест Максимально допустимая неопределенность анализа (maxAAs), % Требования критерия AX < maxAAs Вывод
Предельные тесты 16 3,75 < 16 Соответствует
Количественные тесты 5 3,75 < 5 Соответствует
Как следует из данных таблицы 2 методика определения примеси незамещенного хиназолин-4(3Я)-она характеризуется достаточной прецизионностью (сходимостью).
На основании проведенных исследований нами была разработана методика определения родственных примесей в субстанции УМА-10-13.
Испытуемый раствор: около 0,05 г (точная навеска) субстанции УМА-10-13 помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл этанола 96% и обрабатывают ультразвуком в течение 15 минут, объем раствора доводят тем же растворителем до метки и перемешивают.
Раствор стандартного образца примеси: около 0,05 г (точная навеска) стандартного образца (СО) примеси незамещенного хиназолин-4(3Я)-она помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл этанола 96%, обрабатывают ультразвуком в течение 15 минут, объем раствора доводят тем же растворителем до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки этанолом 96% и перемешивают. 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки этанолом 96% и перемешивают.
Приготовленный раствор центрифугируют в течение 3 минут при скорости 8000 об/мин. Хроматографи-руют 20 мкл раствора стандартного образца и 20 мкл испытуемого раствора и определяют площади пика примеси.
Содержание примеси незамещенного хиназолин-4(3Я)-она Х (%) вычисляют по формуле:
_ 5 • а0 • 250-1-1-100 _ 5 • а0 Х = 50 • а • 100 • 50-50 = 50 • а • 10 £ - площадь пика примеси на хроматограмме испытуемого раствора;
80 - площадь пика незамещенного хиназолин-4(3Я)-она на хроматограмме раствора СО примеси; а - масса навески испытуемой субстанции, г; ао - масса навески СО примеси незамещенного хи-назолин-4(3Я)-она, г.
По разработанной методике был проведен анализ пяти серий лабораторных образцов субстанции УМА-10-13. В образцах всех пяти серий лабораторных образцов субстанции УМА-10-13 была обнаружена лишь одна примесь - незамещенного хиназолин-4(3Я)-она (время удерживания около 6,3), содержание которой в отдельных образцах не превышало 0,1% (в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0023.18) [1]. Выводы:
1. Разработана методика определения примеси незамещенного хиназолин-4(3Я)-она в субстанции УМА-10-13 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с градиентом растворителя.
2. Проведена валидация разработанной методики по параметрам специфичность, линейность, предел обнаружения и предел количественного определения, повторяемость (сходимость), правильность.
3. С помощью разработанной методики был проведен анализ пяти серий лабораторных образцов субстанции УМА-10-13, который показал присутствие в образцах примеси незамещенного хиназолин-4(3Я)-она в содержании, не превышающем 0,1%.
---—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
