CC BY
76
ния хроматографического метода количественного определения.
Разработанный метод количественного определения является высокоселективным и высокочувствительным, что позволяет эффективно использовать его для проведения фармакокинетических исследований соединения VMA-99-82.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дерфель К. Статистика в аналитической химии. — М.: Мир, 1994.
2. Петров В. И., Озеров А. А., Новиков М. С. и др. // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. — 2004. — № 11. — С. 21—24.
3. Петров В. И., Озеров А. А., Новиков М. С. и др. // Фундаментальные исследования. — 2004. — № 1. — С. 78—79.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р У. Хабриева. — М., 2005.
5. Guideline on bioanalytical method validation (EMEA 2012). www.ema.europa.eu
6. Petrov V. I., Ozerov A. A., Novikov M. S. // Chemistry of Heterocyclic Compounds. — 2003. — Vol. 39 (9). — P 1218—1226.
Контактная информация
Сучков Евгений Александрович — м. н. с. лаборатории фармакологической кинетики НИИ фармакологии, ВолгГМУ, e-mail: [email protected]
УДК 543.544.32:615.453.66
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА В ТАБЛЕТКАХ КЕМАНТАНА МЕТОДОМ ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
А. В. Толкачева, Л. Н. Грушевская, Н. И. Авдюнина, Б. М. Пятин, Л. М. Гаевая,
А. С. Михеева, В. И. Прокофьева, Е. В. Блынская
Научно-исследовательский институт фармакологии им. В. В. Закусова, Москва,
Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова
Задача настоящего исследования состояла в разработке и валидации методики количественного определения кемантана в таблетках методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ-ПИД). Хроматографическое разделение проводили на кварцевой капиллярной колонке — WCOT Fused Silica CP-WAX 52 CB: 50 м, 0,32 мм, 1,2 мкм. Определены параметры пригодности хроматографической системы и факторы устойчивости методики. Разработанная методика валидирована, проведен анализ нескольких серий образцов таблеток кемантана.
Ключевые слова: кемантан, таблетки, 5-гидроксиадамантан-2-он, количественный анализ, валидация, газожидкостная хроматография.
DEVELOPMENT AND VALIDATION
OF ASSAY FOR KEMANTANE TABLETS BY GAS LIQUID CHROMATOGRAPHY
A. V. Tolkacheva, L. N. Grushevskaya, N. I. Avdyunina, B. M. Pyatin, L. M. Gaevaya,
A. S. Miheeva, V. I. Prokofeva, E. V. Blinskaya
The objective of this study was to develop and to validate a new assay of the active ingredient in Kemantane tablets by GC-FID. Chromatographic separation was performed on the fused silica capillary column - WCOT Fused Silica CP-WAX 52 CB: 50 m, 0,32mm, 1,2 ^m. Parameters of the chromatographic system suitability and robustness of the technique were determined. The developed technique was validated; several serial samples of Kemantane tablets 100 mg were analyzed.
Key words: kemantane, tablets, 5-hydroxyadamantan-2-one, assay, validation, gas liquid chromatography, GLC.
Кемантан (5-гидроксиадамнатан-2-он) по своей структуре представляет собой производное ада-мантана, обладающее выраженной фармакологической активностью. Показано, что кемантан обладает антипаркинсоническим, иммунотропным действием, способностью устранять алкогольный абстинентный синдром, а также высокой цереброваскулярной активностью, усиливая кровоснабжение ишемизированного мозга [2, 3].
В ФГБУ «НИИ фармакологии им. В. В Закусова» РАМН была создана лекарственная форма кемантана— таблетки дозировкой 100 мг. Ранее для количественного определения кемантана в таблетках применялся спектрофотометрический метод [1]. Однако разработанная методика обладала низкой чувствительностью и воспроизводимостью, в связи с чем было принято решение о разработке новой методики количественного определения с помощью метода газожидкостной хроматографии (ГЖХ).
Выпуск 1 (49). 2014
97
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Разработать методику количественного определения кемантана в таблетках методом газо-жидкостной хроматографии и провести ее валидацию.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования являлись серийные образцы таблеток кемантана дозировкой 100 мг, разработанные и полученные в лаборатории технологии готовых лекарственных форм ФГБУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» РАМН.
В качестве свидетелей использовали образцы субстанции кемантана, а также образцы технологических примесей кемантана: адамантан-2,6-дион и адамантан-2-он. В качестве внутреннего стандарта использовали 1 -адамантанэтанол (Aldrich Chem. Co.: CAS № 6240-11 -5).
Методика количественного определения была разработана и валидирована на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором (Varian GC-450, Нидерланды) и автосамплером (Varian CombiPALAutosampler, Нидерланды). Обработку сигнала и полученных результатов осуществляли при помощи программы Galaxie (Galaxie Chromatography Data System, версия 1.9.302.952).
Разделение проведено на кварцевой капиллярной колонке «СР-WAX 52СВ» длиной 50 м и внутренним диаметром 0,32 мм с нанесенной неподвижной фазой — полиэтиленгликолем (толщина слоя 1,2 мкм) (СР-WAX 52СВ, Varian, Нидерланды).
В качестве растворителя для подготовки проб использовали спирт этиловый, 95%-й.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных исследований были выбраны следующие условия: температура испарителя — 220 оС, температура термостата—200 оС, температура детектора — 230 оС, скорость газа-носителя (азот) — 5 мл/мин, скорость газа-поддува (азот)—25 мл/мин, скорость водорода — 30 мл/мин, скорость воздуха — 300 мл/мин, деление потока—1:40, объем пробы—1 мкл.
Анализ модельных смесей кемантана, технологических примесей и внутреннего стандарта с концентрацией каждого из соединений 0,5 мг/мл показал, что в выбранных условиях происходит полное разделение исследуемых соединений (рис. 1).
На хроматограмме извлечения из плацебо, кроме пика растворителя, дополнительных пиков не наблюдалось.
С целью выбора рабочей концентрации кеманта-на в испытуемых растворах нами была изучена зависимость площади пика от концентрации растворов кемантана и внутреннего стандарта (1-адамантанэтанола).
Линейная зависимость и для растворов кемантана, и для растворов 1-адамантанэтанола, наблюдалась в интервале от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл, значения коэффициентов корреляции составляли не менее 0,999 (рис. 2).
Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси кемантана, технологических примесей и внутреннего стандарта:
I — адамантан-2-он, II — 1-адамантанэтанол,
III — адамантан-2,6-дион, IV — кемантан
Рис. 2. Зависимость площади пика от концентрации растворов кемантана (I) и 1-адамантанэтанола (II)
Предел обнаружения кемантана — 0,00025 мкг, 1-адамантанэтанола — 0,000125 мкг. Предел количественного определения кемантана—0,00125 мкг, 1-ада-мантанэтанола — 0,00025 мкг.
На основании полученных данных была выбрана рабочая концентрация для растворов кемантана и 1-адамантанэтанола (внутреннего стандарта) — 0,5 мг/мл.
Определение полноты извлечения кемантана из таблеточной массы проводили на модельных смесях субстанции кемантана и плацебо с содержанием вспомогательных веществ, аналогичным содержанию в таблетке, и с содержанием кемантана (100 ± 20) % от номинального.
Извлечение кемантана из таблеток проводили на ультразвуковой бане в течение 10 мин, к полученным пробам прибавляли раствор внутреннего стандарта, а затем фильтровали через фильтр «Мил-липор» с диаметром пор 0,45 мкм. Параллельно готовили раствор для расчета поправочного коэффициента с концентрацией кемантана и 1-адамантанэ-танола — 0,5 мг/мл.
Полученные растворы хроматографировали, получая не менее 3 хроматограмм каждого раствора, результаты усредняли.
98
Выпуск 1 (49). 2014
Поправочный коэффициент вычисляли по следующей формуле:
Ss х С
■ г _ st кем
К “ S х С t ,
кем st
где Sst — площадь пика внутреннего стандарта, мВ х мин; S^ — площадь пика кемантана, мВ х мин; Сй — концентрация раствора внутреннего стандарта, мг/мл; Скем — концентрация раствора кемантана, мг/мл.
Расчет содержания кемантана в модельном растворе (мг/мл) проводили по следующей формуле:
v S х К х Ct X = ----х——---st---,
Sst
где S)< — площадь пика кемантана в испытуемом растворе, мВ х мин; Sst — площадь пика внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мВ х мин; Cst — концентрация внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мг/мл; K—поправочный коэффициент.
Полученные результаты представлены в табл. Результаты анализа модельных растворов показали, что относительная ошибка однократного опреде-
Результаты количественного определения кемантана в модельных растворах методом ГЖ
Взято кемантана, мг/мл Найдено, мг/мл Абсолютная ошибка однократного определения Относительная ошибка однократного определения, % Метрологические характеристики, Р = 95 % Найдено в среднем, % Метрологические характеристики, Р = 95 %, n = 9
0,405 0,414 0,416 +0,009 +0,011 2,22 2,72 X = 0,410 S = 0,0064 101,23 X (%) = 100,65
0,404 - 0,001 0,25 А X = 0,0102 S = 1,000825
0,404 - 0,001 0,25 е = 2,49 % Sx = 0,333608
0,427 0,429 +0,002 0,47 X = 0,429 100,47 АХ = 0,77 %
0,428 +0,001 0,23 S = 0,00153 е = 0,77 %
0,431 +0,004 0,94 АХ = 0,00380
е = 0,89 %
0,451 0,451 0 0 X = 0,455 100,89
0,455 +0,004 0,89 S = 0,0040
0,459 +0,008 1,77 ax = 0,00993
е = 2,18 %
0,475 0,480 +0,005 1,05 X = 0,477 100,42
0,475 0 0 S = 0,00265
0,476 +0,001 0,21 АХ = 0,00380
е = 0,80 %
0,500 0,490 -0,010 2,00 X = 0,493 98,6
0,493 -0,007 1,40 S = 0,00351
0,497 -0,003 0,60 АХ = 0,00871
е = 1,77 %
0,527 0,530 +0,003 0,57 X=0,529 100,38
0,530 +0,003 0,57 S = 0,002345
0,526 -0,001 0,19
АХ = 0,005822
е = 1,10 %
0,552 0,553 +0,001 0,18 X = 0,557 100,91
0,555 +0,003 0,54 S = 0,00529
0,563 +0,011 1,99 АХ= 0,01313
е = 2,36 %
0,575 0,582 +0,007 1,22 X = 0,589 102,43
0,591 +0,016 2,78 S = 0,00586
0,593 +0,018 3,13 АХ = 0,01455
S = 2,47
0,605 0,614 +0,009 1,49 X = 0,608 100,50
0,611 +0,006 0,99 S = 0,00568
0,602 -0,003 0,50 АХ = 0,00903
0,604 -0,001 0,17 Т = 1,49 %
Выпуск 1 (49). 2014
99
ления количественного содержания кемантана методом ПЖХ не превышает 2,72 %.
Отклонение среднего результата измерения от истинного значения не превышало 2,43 %.
Ошибка методики — 0,77 %. Разброс данных: (100,65 ± 0,77) %.
Проверку пригодности хроматографической системы проводили путем хроматографирования раствора кемантана и 1 -адамантанэтанола с концентрацией каждого из соединений 0,5 мг/мл, по относительному времени удерживания пика кемантана относительно пика внутреннего стандарта 2,15 ± 0,02; числу теоретических тарелок (не менее 10000); фактору асимметрии (не более 2,0) и относительному стандартному отклонению площади пика кемантана (не более 2 %).
Изменение температуры термостата в пределах ± 10 оС и скорости газа-носителя в пределах ± 0,5 мл/мин значительного влияния на разрешение и форму пиков исследуемых соединений не оказывало.
Определение количественного содержания кемантана в таблетках было проведено на пяти серийных образцах.
Испытуемые растворы готовили следующим образом: около 0,1 г (точная навеска) порошка растертых таблеток вносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, добавляли 7 мл спирта этилового 95%-го и помещали на ультразвуковую баню на 10 минут. Затем объем раствора доводили до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали. 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, куда предварительно вносили 5 мл спиртового раствора внутреннего стандарта (1-адамантанэта-нола) с концентрацией 1 мг/мл. Доводили объем раствора до метки тем же растворителем, перемешивали и фильтровали через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм (концентрация кемантана 0,5 мг/мл). Параллельно готовили раствор для расчета поправочного коэффициента. Получали не менее 5 хроматограмм каждого раствора.
Формула расчета содержания кемантана в таблетках (г/табл.):
X =
К х S
C. х m ,
st табл.
V
S t х m
st навески
где m , — средняя масса таблетки, г; m —
m табл. г г-1 ’ ’ навески
масса навески таблеточной массы, г; S)< — площадь
пика кемантана в испытуемом растворе, мВ х мин; Sst — площадь пика внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мВ х мин; Cst — концентрация внутреннего стандарта в испытуемом растворе, мг/мл; V — объем разведения навески таблеточной массы, мл; K—коэффициент пересчета.
Содержание кемантана в таблетках составляло от 0,0971 до 0,1042 г в таблетке.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, нами была разработана методика количественного определения кемантана в таблетках с помощью ПЖХ. Разработанная методика специфична и обладает высокой чувствительностью. На модельных смесях проведена оценка правильности, прецизионности и устойчивости методики. Показано, что извлечение кемантана из таблеточной массы происходит практически полностью, отклонение среднего результата измерения от истинного значения не превышает 2,7 %. Ошибка методики — 0,77 %. Изменение температуры термостата в пределах ± 10 оС и скорости газа-носителя в пределах ± 0,5 мл/мин значительного влияния на разрешение и форму пиков исследуемых соединений не оказывает.
С помощью разработанной методики проведено количественное определение кемантана в таблетках. Показано, что качество таблеток по этому показателю соответствует требованиям Государственной Фармакопеи СССР XI издания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кисляк Н. А. Создание твердых дозированных лекарственных форм производных адамантана: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. — М., 1989.
2. Масленников Д. В., Авдюнина Н. И., Пятин Б. М. // Тез. докл. IV съезда фармакологов России. — Казань, 2012. — С. 129.
3. Мирзоян Р. С., Ганьшина Т. С., Масленников Д. В. и др. // Эксперим. и клин. фармакол. — 2012. — № 75 (6). — С. 27—30.
Контактная информация
Толкачева Анна Валентиновна — м. н. с. ОТО
ФПБУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова», аспирант кафедры фармацевтической и токсикологической химии ПБОУ ВПО Первый МПМУ им. И. М. Сеченова, e-mail: [email protected]
100
Выпуск 1 (49). 2014
