РАЗРАБОТКА И ЛАБОРАТОРНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ВИРУСОПОДОБНЫХ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ САПОНИНОВ, ОЦЕНКА ИХ АДЪЮВАНТНЫХ СВОЙСТВ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ МЫШЕЙ ГРИППОЗНЫМИ АНТИГЕНАМИ

Евсеенко В. А.; Гудымо А. С.; Данильченко Н. В.; Святченко С. В.; Таранов О. С.; Рыжиков А. Б.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ / ORIGINAL ARTICLES

УДК 615.371:578.74:578.832.1:615.322 https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-2-170-186

Научная статья | Scientific article

Ц) Check for updates

(«d:

BY 4.0

Разработка и лабораторное получение вирусоподобных иммуностимулирующих комплексов на основе сапонинов, оценка их адъювантных свойств при иммунизации мышей гриппозными антигенами

В.А. Евсеенко н, А.С. Гудымо, Н.В. Данильченко, С.В. Святченко, О.С. Таранов, А.Б. Рыжиков

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Центр геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости, АБК, корп. 12а, р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559, Российская Федерация

El Евсеенко Василий Александрович; [email protected]

Резюме Пандемия COVID-19 обострила потребность общества в эффективных вакцинных препа-

ратах. В этих условиях существенную финансовую поддержку получили разработчики ряда инновационных вакцин, в том числе вакцин, в состав которых входят адъюванты на основе сапонинов. В 2021 г. ВОЗ была одобрена первая противомалярийная вакцина Mosquirix, содержащая сапонины. На стадии одобрения находится вакцина Novavax против COVID-19. Перспективным подходом к созданию вакцин является использование вирусоподобных иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ) на основе сапонинов и создание на их основе комплексов с антигеном (ИСКОМ-антиген). Цель работы: получение и изучение вирусоподобных иммуностимулирующих комплексов на основе сапонинов Квиллайи мыльной (Quillaja saponaria), а также аналогов на основе сапонинов Синюхи голубой (Polemonium caeruleum), полученных из отечественного сырья. Материалы и методы: с применением метода жидкостной хроматографии получали препараты ИСКОМ адъю-вантов - Матрикс-BO и Матрикс-BP. Проведено электронно-микроскопическое исследование препаратов. Иммунизацию мышей BaLb/c препаратами ИСКОМ-антиген проводили интраперитонеально и внутримышечно. Иммунизированных животных заражали адаптированным летальным для мышей штаммом вируса гриппа A/CaLifornia/4/2009 (H1N1) pdm09. Образцы сыворотки крови иммунизированных животных исследовали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Результаты: получены ИСКОМ, содержащие сапонины Синюхи голубой и Квиллайи мыльной. В образцах сыворотки крови животных, однократно внутримышечно иммунизированных препаратом ИСКОМ-антиген, содержащим по 1 мкг гемагглютинина каждого из штаммов вирусов гриппа A/Brisbane/02/2018 (H1N1) pdm09, A/Kansas/14/2017 (H3N2), B/Phuket/3073/2013, значения титров антител в РТГА составили более 1:40 к соответствующим антигенам. При двукратном внутримышечном введении препарата ИСКОМ-антиген, содержащего 50 нг каждого антигена, был выявлен протективный ответ. Максимальные значения титров антител в РТГА выявлены при двукратном интраперитонеальном введении препарата ИСКОМ-антиген и составили 1:20480 к гемагглютинину вакцинного штамма A/Kansas/14/2017 (H3N2). Показано, что двукратное внутримышечное введение 5 мкг, 1 мкг, 200 нг, 50 нг препарата ИСКОМ-антиген и 5 мкг, 1 мкг, 200 нг контрольного антигена коммерчески доступной вакцины мышам, впоследствии зараженным летальным штаммом вируса гриппа A/CaLifornia/4/2009 (H1N1)pdm09, защищает экспериментальных животных от гибели. Выводы: полученные препараты на основе ИСКОМ обладали высокой иммуностимулирующей активностью в исследовании на мыши© В.А. Евсеенко, А.С. Гудымо, Н.В. Данильченко, С.В. Святченко, О.С. Таранов, А.Б. Рыжиков, 2022

ной модели. Представленные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения препаратов на основе ИСКОМ при разработке как противовирусных, так и иммунокорректирующих препаратов.

Ключевые слова: вирусоподобные иммуностимулирующие комплексы; ИСКОМ; адъювант; сапонин; вакцина; иммунизация; грипп; респираторная инфекция

Для цитирования: Евсеенко В.А., Гудымо А.С., Данильченко Н.В., Святченко С.В., Таранов О.С., Рыжиков А.Б.

Разработка и лабораторное получение вирусоподобных иммуностимулирующих комплексов на основе сапонинов, оценка их адъювантных свойств при иммунизации мышей гриппозными антигенами. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(2):170-186. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-2-170-186

Development and laboratory production of virus-like immune-stimulating complexes based on saponins and evaluation of their adjuvant potential using mice immunisation with influenza antigens

V.A. Evseenko A.S. Gudymo, N.V. Danilchenko, S.V. Svyatchenko, O.S. Taranov, A.B. Ryzhikov

State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", World-class genomic research center for biological safety and technological independence, ABK, 12A, Koltsovo, Novosibirsk Region 630559 Russian Federation

El Vasily A. Evseenko; [email protected]

Abstract The COVID-19 pandemic has exacerbated the public's need for effective vaccines. Consequent-

ly, significant financial support has been provided to developers of a number of innovative vaccines, including the vaccines with saponin-based adjuvants. In 2021, the World Health Organisation recommended Mosquirix, the first malaria vaccine, which contains a saponin adjuvant. An anti-covid vaccine by Novavax is in the approval phase. A promising approach to vaccine development is presented by the use of virus-like immune-stimulating complexes (ISCOMs) containing saponins and by the creation of combinations of ISCOMs with antigens. The aim of the study was to develop, produce and characterise virus-like immune-stimulating complexes based on saponins of Quillaja saponaria, as well as similar saponins of Russian-sourced Pole-monium caeruleum. Materials and methods: The ISCOM adjuvants, Matrix-BO and Matrix-BP, were produced using liquid chromatography and examined using electron microscopy. Balb/c mice were immunised intraperitoneally and intramuscularly with ISCOM-antigen preparations. Afterwards, the immunised animals were challenged with the influenza virus strain, A/Califor-nia/4/2009(H1N1)pdm09, adapted and lethal to mice. The serum samples were examined using haemagglutination inhibition (HI) tests. Results: The authors produced the ISCOMs containing saponins of Quillaja saponaria and Polemonium caeruleum. After one intramuscular injection of either of the ISCOM-antigen preparations with 1 |g of each of A/Brisbane/02/2018 (H1N1) pdm09, A/Kansas/14/2017 (H3N2), and B/Phuket/3073/2013 haemagglutinin antigens (HAs), HI tests detected serum antibody titres to the corresponding antigens of £1:40. Two intramuscular injections of the ISCOM-antigen preparation containing 50 ng of each of the HAs and Matrix-BO resulted in a protective response. In some animals, two intraperitoneal injections of ISCOM-antigen preparations resulted in the maximum antibody titre to the A/Kansas/14/2017 (H3N2) vaccine strain of 1:20,480. Two intramuscular injections of a test preparation containing 5 |g, 1 |g, 200 ng, or 50 ng of each of the HAs and Matrix-BO or a control preparation containing 5 |g, 1 |g, or 200 ng of each of the HAs (commercially available vaccines) to the mice that

were afterwards infected with the lethal influenza strain protected the experimental animals from death. Conclusions: The ISCOM-based preparations had high immunostimulatory activity in the mouse-model study. The presented results indicate the potential of further studies of ISCOM-based preparations in terms of both vaccine and immunotherapeutic development.

Key words: virus-like immune-stimulating complexes; ISCOM; adjuvant; saponin; vaccine; immunisation;

influenza; respiratory infection

For citation: Evseenko V.A., Gudymo A.S., Danilchenko N.V., Svyatchenko S.V., Taranov O.S., Ryzhikov A.B.

Development and laboratory production of virus-like immune-stimulating complexes based on saponins and evaluation of their adjuvant potential using mice immunisation with influenza antigens. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie = Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2022;22(2):170-186. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-2-170-186

Введение

Пандемия коронавирусной инфекции COVID-19 обострила проблемы, связанные с иммунопрофилактикой респираторных заболеваний вирусной природы. Для заболеваний, вызываемых респираторно-синцитиальным вирусом, сезонным коронавирусом, риновирусом, пара-миксовирусом и другими, вакцины не применяются, а противогриппозные вакцины не обеспечивают продолжительную защиту. Одной из инновационных технологий является разработка вакцин на основе иммуностимулирующих комплексов - ИСКОМ (immune-stimulating complexes, ISCOM), в том числе создание вирусоподобных ИСКОМ на основе сапонинов. Сапонины относятся к семейству амфипатиче-ских растительных гликозидов и структурно состоят из липофильных тритерпеновых производных [1]. Отличительной особенностью некоторых растительных сапонинов является высокая аффинность к холестерину. Вирусоподобные комплексы размером около 40 нм, состоящие из сапонинов Квиллайи мыльной (Quillaja saponaria), холестерина и лецитина, имеющие выраженные иммуномодулирующие свойства при парентеральном введении, исследуются с середины 80-х годов прошлого века [1]. Первые образцы обладали высокой цитотоксичностью, и использование ИСКОМ в низкой концентрации в препарате не имело преимуществ по сравнению с хорошо зарекомендовавшим себя адъю-вантом - гидроокисью алюминия. С развитием биотехнологических систем фракционирования компонентов при разработке и производстве биопрепаратов стало возможным проводить сложные исследования, результаты которых продемонстрировали уникальные свойства этих наночастиц. Сапонинсодержащие адъюванты стимулируют врожденный и адаптивный клеточный иммунитет, а также гуморальный ответ, характеризующийся продукцией всех изотипов

IgG, таким образом, наблюдается формирование смешанного Th1/Th2 типа иммунного ответа. В ряде работ, в которых для иммунизации использовали сапонинсодержащие адъюванты, был выявлен выраженный клеточный иммунный ответ на растворимые белки, и в частности на овальбумин [2-4]. Была установлена основная роль дендритных клеток в этом процессе [4]. Для сравнения, препараты, содержащие гидроокись алюминия или масляные адъюванты, в основном стимулируют Т1л2-иммунный ответ. Показано, что именно сапонины в составе ИСКОМ являются молекулярным компонентом, формирующим инфламмасомы [5]. Уникальные особенности ИСКОМ на основе сапонинов и установленные молекулярные механизмы их действия позволяют рассматривать их как перспективные адъювантные компоненты профилактических и терапевтических вакцин для борьбы с инфекционными и онкологическими заболеваниями.

Получение ИСКОМ возможно с применением различных биотехнологических методик. Это обусловлено сильным биохимическим сродством сапонинов, лецитина и холестерина, которые в растворе детергента при понижении его концентрации формируют идентичные корпускулярные структуры, устойчивые при фракционировании. В физиологических растворах ИСКОМ заряжены отрицательно и при добавлении полярно заряженных вирусных антигенов связываются с ними, формируя комплексы ИСКОМ-антиген. Эти свойства позволяют проектировать аминокислотную последовательность антигенов таким образом, чтобы в их составе были положительно заряженные кластеры аминокислот, и формирование препарата ИСКОМ-антиген происходило с ожидаемой эффективностью [6]. Для получения ИСКОМ нами была использована гель-фильтрация (SEC).

Аналитические исследования указывают на высокую перспективность вакцин, содержа-

щих компонент на основе ИСКОМ, в частности адъювант Matrix-M (Novavax, США) [7]. Опасения, связанные с высокой реактогенностью Matrix-M, не оправдались. Препараты, содержащие Matrix-M, находятся на завершающих стадиях клинических исследований (КИ): вакцина против сезонного гриппа NanoFLu (Novavax, США) для применения в возрастной группе 65 лет и старше прошла фазу 3 КИ; вакцина против респираторного синцитиального вируса RSV F (Novavax, США) - фазу 3 КИ1 [8]. Препарат для профилактики новой коронавирусной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, NVX-CoV2373 (Novavax, США), успешно прошел клинические испытания [9] и официально одобрен.

В Российской Федерации активно применяются гриппозные вакцины, содержащие адъюван-ты Совидон и Полиоксидоний [10, 11]. В мировой практике применение адъювантов в гриппозных вакцинах произошло с запозданием. В настоящий момент доступны препараты, содержащие масляный адъювант MF59 [12]. В то же время, помимо незначительной экономии антигена, использование данных соединений не привело к существенным изменениям производственного процесса, при котором необходима ежегодная аттестация производственных штаммов ВОЗ, или кардинальному снижению заболеваемости гриппом.

Цель работы - получение и изучение вирусоподобных иммуностимулирующих комплексов на основе сапонинов Квиллайи мыльной (Quillaja saponaria), а также аналогов на основе сапонинов Синюхи голубой (Polemonium caeruleum), полученных из отечественного сырья.

Материалы и методы

Материалы:

- лаурил саркозинат натрия (Sodium LauroyL Sarcosine, Amerco #0719-500G); холестерин (Cholesterol, PanReac AppLichem #A0807); лецитин (Lecithin, PanReac AppLichem #A0893); сапонины Quillaja saponaria (Saponin, Quillaja saponaria, PanReac AppLichem #A2542); шпри-цевая фильтрующая насадка с размером пор 0,22 мкм (Minisart NML, Sartorius); гель-филь-трующий носитель Sephadex G-100 Superfine (GE HeaLthcare #17006101); фосфатно-солевой буфер (ФСБ) pH 7,4 (VWR #E404-200TABS);

- стандартные антигены вируса гриппа: A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019

(H1N1)pdm09; A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2); B/Washington/02/2019 (B/Victoria); B/Phuket/3073/2013 (B/Yamagata); A/Bris-bane/02/2018 (H1N1)pdm09; B/CoLo-rado/06/2017; A/Kansas/14/2017 (H3N2) (ООО «ППДП», Санкт Петербург, Россия); - антигены A/YANAO/1/2019 (H1N1)pdm09, A/Russia/01/2009 (H1N1)pdm09, A/SoLomon IsLands/03/06 (H1N1), A/New CaLedonia/ 20/1999 (H1N1), A/Texas/50/2012 (H3N2), A/SwitzerLand/9715293/2013 (H3N2), A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2), B/Brisbane/60/2008 (B/Victoria) (предоставлены отделом зооноз-ных инфекций и гриппа ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). В работе были использованы мыши линии BaLb/c (предоставлены виварием ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора).

Методы

Получение иммуностимулирующих комплексов.

В пробирку объемом 15 мл (Corning #430055) вносили 3 мл деионизованной воды, в которую далее, работая в респираторе 3M (PPP), аккуратно, не допуская распыления, вносили навеску 500±50 мкг лаурил саркозината натрия. Далее встряхивали пробирку на вортексе до полного растворения детергента. Пробирку центрифугировали при 5000 g до исчезновения пены. Далее в пробирку вносили 30±5 мг холестерина и 30±5 мг лецитина. Смесь встряхивали на вор-тексе с интервалом 30 мин в течение 3 ч при комнатной температуре. За 30 мин до завершения инкубации отдельно в 2 мл деионизованной воды растворяли навеску 400±50 мг сапонинов Квиллайи мыльной (550000±26540 гемолитических единиц). После растворения сапонинов раствор фильтровали с использованием фильтрующей насадки с размером пор 0,22 мкм и вносили в смесь детергента, холестерина и лецитина. Смесь тщательно перемешивали на вортексе в течение 1 мин и далее инкубировали в течение 24 ч при комнатной температуре с периодическим встряхиванием на вортексе. После завершения инкубации смесь центрифугировали при 10000 g, шприцем на 15 мл с иглой отбирали содержимое из центра пробирки, не касаясь осадка и поверхностной пленки. Эту реакционную смесь фильтровали с использованием фильтрующей насадки с размером пор 0,22 мкм, после чего наносили на хроматографическую колонку HK-50 (GE HeaLthcare) c носителем

1 Safety and immunogenicity study to evaluate single- or two-dose regimens of RSV F vaccine with and without aluminum phosphate or Matrix-M1™ adjuvants in clinically-stable older adults. NCT03026348. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT03026348

Sephadex G-100, уравновешенную ФСБ pH 7,4 и соединенную с хроматографом AKTA pure (General Electric Healthcare). Нанесение препарата на колонку осуществляли при скорости потока 200 мкл/мин. Хроматографию проводили при скорости потока 200 мкл/мин в течение 12 ч, а затем при скорости 500 мкл/мин в течение приблизительно 1,5 ч. Выход частиц фиксировали в первом характерном пике при длине волны 280 нм. Раствор с частицами обладал выраженными опалесцирующими свойствами. В зависимости от лабораторной серии выход продукта составлял 30-40 мл. Непосредственно после завершения процедуры проводили стерилизующую фильтрацию с использованием фильтрующей насадки с размером пор 0,22 мкм. Препарат хранили до иммунизации при 4 °С не более 30 сут. Срок хранения, установленный с помощью определения 50% летальной дозы для мышей при интраперитонеальном введении (ИМЛД50), на момент публикации составил 7 мес. (методика определения ИМЛД50 приведена далее). Замораживание препарата не допускается, так как часть препарата агрегирует и выпадает в осадок.

ИСКОМ на основе сапонинов Синюхи голубой изготавливали идентичным способом со следующими изменениями. В реакционную смесь добавляли сапонины Синюхи голубой, стандартизованные в гемолитической реакции (550000±36562 ед.). Выделение сапонинов из Синюхи голубой проводили согласно методике, описанной ранее [13]. Оптическую плотность раствора частиц измеряли спектрофотометри-чески при длине волны 280 нм для сравнительной оценки потерь [14].

Определение единицы дозирования иммуностимулирующих комплексов на основе сапонинов Синюхи голубой (Матрикс-BP) и Квиллайи мыльной (Матрикс-BQ). Для некоторых биопрепаратов, например для токсинов, ферментов и др., биологическая активность может не в полной мерее соответствовать концентрации, определяемой физико-химическими методами. Методов биологической стандартизации ИСКОМ ранее не описано. В данной работе мы применили биологическую пробу, аналогичную проводимой для токсинов. Природа токсичности при интра-перитонеальном введении ИСКОМ связана с гиперпродукцией цитокинов, приводящей к шоку и гибели животного. В ходе предварительных тестов с вирусоподобными иммуностимулиру-

ющими комплексами Матрикс-BP и Матрикс-BO было установлено, что при интраперитонеальном введении ИСКОМ наблюдалась гибель мышей на первые или вторые сутки. При этом цитолитической активности у препаратов не наблюдалось при внесении даже 20-кратного концентрата исходного продукта. Также не наблюдалось цитотопатического эффекта для культур клеток MDCK и Vero при внесении 20-кратных концентратов исходного продукта ИСКОМ. В связи с этим было принято решение проводить стандартизацию и дозирование препаратов на основе 50% летальной дозы для мышей при интраперитонеальном введении (ИМЛД50), принятой за 1 ед. активности. Мышам линии BaLb/c (5 мышей, самцы 18-20 г в группе) интра-перитонеально вводили 200 мкл 5-кратных разведений полученных препаратов в ФСБ (pH 7,4). Учитывали гибель животных на 1-3 сут после введения. Рассчитывали ИМЛД50 по методу Рида и Менча [15].

Иммунизация и заражение экспериментальных животных. Протокол исследования с использованием лабораторных животных был одобрен Биоэтической комиссией № 1 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (протокол ГНЦ ВБ «Вектор»/03-04.2021). До начала иммунизации экспериментальные животные находились на адаптационном карантине и стандартном рационе вивария ad libitum.

Инфицирование животных вирусом гриппа A/CaLifornia/04/2009 (H1N1)pdm09 проводили интраназально дозой 25 ЛД50 в объеме 50 мкл. Животных перед заражением наркотизировали с использованием комбинации препаратов Зо-летил 100 и Ксила, которые вводили внутримышечно. После инфицирования, начиная с 3 сут, регистрировали гибель животных в течение 21 сут. Далее оставшихся животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации с соблюдением правил гуманного обращения с животными2. В случае, если у животного в результате тяжелого течения заболевания развивалось состояние, не совместимое с жизнью, выражавшееся в потере более 20% изначальной массы тела, на пике болезни проводили эвтаназию животного.

Для проведения интраперитонеаль-ной иммунизации было сформировано 7 групп по 5 животных. Мышей линии BaLb/c иммунизировали интраперитонеально посредством введения 200 мкл препарата ИСКОМ-

2 Руководство по работе с лабораторными животными для сотрудников ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, занятых проведением доклинических испытаний. М.: Изд-во ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова; 2015.

антиген, в состав которого входило по 7,5 мкг или по 2 мкг гемагглютинина трех вакцинных штаммов вирусов гриппа и 0,1 ИМЛД50/мл Ма-трикс-BP или Матрикс-ВО. Препарат готовили за 1 ч до иммунизации. Для приготовления препарата ИСКОМ-антиген использовали антигены вакцины гриппозной трехвалентной инактиви-рованной расщепленной, содержащей 15 мкг гемагглютинина каждого из вакцинных штаммов вирусов гриппа A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09, B/CoLorado/06/2017, A/Kansas/14/2017 (H3N2) без адъюванта. В качестве положительного контроля использовали препараты, содержащие аналогичную концентрацию антигенов, но не содержащие ИСКОМ адъювант. Группе отрицательного контроля вводился ИСКОМ Матрикс-ВО. На 142 сут проводили повторную иммунизацию идентичными препаратами. На 14, 28, 142 и 170 сут у мышей отбирали кровь из орбитального синуса для анализа образцов сыворотки крови.

Последующий эксперимент предполагал определение нижней границы концентрации гемагглютининов, вызывающей при внутримышечном введении 10 ИМЛД50 Матрикс-BO образование антител, детектируемых в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Использовали инактивированную четырехвалентную расщепленную вакцину, содержащую антигены A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09, A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2), B/Washington/02/2019 (B/Victoria), B/Phuket/3073/2013 (B/Yamagata). Группы по 5 животных внутримышечно иммунизировали препаратом ИСКОМ-антиген, содержащим 5, 1, 0,2 или 0,05 мкг каждого гемагглютинина, дозу 10 ИМЛД50/мл Матрикс-BO. В качестве положительного контроля было сформировано 4 группы по 5 животных, которых иммунизировали внутримышечно 5, 1, 0,2 или 0,05 мкг каждого гемагглютинина без ИСКОМ адъюванта. В качестве отрицательного контроля использовали мышей, которым внутримышечно вводили дозу 10 ИМЛД50/мл Матрикс-BO. Использование препарата, содержащего только сапонины Квиллайи мыльной, обусловлено коммерческой доступностью сырья для изготовления. Доза адъюванта при внутримышечном введении была выбрана исходя из того, что доза 10 ИМЛД50 ИСКОМ Матрикс-BO при введении мышам внутримышечно не вызывала определяемых визуально нарушений поведения, циркадных ритмов, а также нарушения динамики набора веса. Эта доза может быть неоптимальной и, возможно, потребует уточнения при дальнейших работах с более крупными животными. Кровь у животных отбирали на 21

сут после первой иммунизации, в этот же день осуществляли вторую иммунизацию и на 21 сут после второй иммунизации также отбирали кровь для анализа сыворотки в РТГА. На 42 сут после первой иммунизации всех животных заражали адаптированным к мышам летальным штаммом вируса гриппа A/CaLifornia/04/2009 (H1N1)pdm09 в дозе 25 ЛД50. За мышами наблюдали в течение 21 сут, учитывали погибших животных. На 27 сут после заражения у выживших животных отбирали кровь для анализа образцов сыворотки в РТГА. РТГА и гемолитическую реакцию проводили согласно методике, описанной V. Evseenko c соавт. [16]. Для вычисления значений средних геометрических титров (СГТ) и погрешностей измерения считали, что титр ниже предела детекции равен 1:10.

Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопического исследования полученные препараты, подвергшиеся стерилизующей фильтрации через фильтр-насадку 0,22 мкм, наносили в объеме 15 мл в мембранный центрифужный концентратор с мембраной 100 кДа (MiLLipore). Центрифугировали в течение 1 ч при 1500 g (ротор 12150-Н, Sigma). Концентрат переносили в пробирки в объеме 150 мкл. Изображения получены методом негативного контрастирования 1% уранилацетатом с анализом на просвечивающем электронном микроскопе JEM-1400 (JEOL, США).

Определение остаточной концентрации детергента. Остаточный детергент в препаратах Матрикс-BP, Матрикс-BO определяли в реакции гемолиза. Лаурил саркозинат натрия, применяемый при изготовлении ИСКОМ Матрикс-BO и Ма-трикс-BP, является детергентом и в следовых количествах обладает способностью лизировать эритроциты. Для оценки гемолитической активности использовали эритроциты петуха. Гемолитическую активность препаратов сравнивали с гемолитической активностью стандартного раствора детергента. Для приготовления стандартного раствора детергента навеску лаурил саркозината натрия 0,015±0,002 г растворяли в 1 мл ФСБ (pH 7,4).

Гемолитическую реакцию проводили в микроварианте в 96-луночных полистироловых планшетах [16]. На одном планшете готовили двукратные разведения исследуемых растворов ИСКОМ (Матрикс-BP и Матрикс-BO) и стандартного раствора детергента в повторах, после чего добавляли по 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов петуха. При завершении оседания эритроцитов в контрольных лунках учитывали лизис эритроцитов в стандартных и экспериментальных лунках. Рассчитывали предельные

разведения препаратов, вызывающие лизис эритроцитов.

Результаты

Предложенная лабораторная технология позволила получать препараты ИСКОМ адъюван-тов в объеме 42,0±5,7 мл (15 серий): Матрикс-ВР-или Матрикс-ВО-содержащих растворов (в 1 мл 77,9±8,3 ИМЛД50). Растворы характеризуются выраженной опалесценцией. При фильтрации через фильтр-насадку 0,22 мкм контролировали потерю активного компонента спектрофотоме-трически при длине волны 280 нм. В препаратах Матрикс-BP, Матрикс-ВО минимальная концентрация, вызывающая лизис эритроцитов, составила 107±11 мкг/мл.

Частицы, полученные с использованием сапонинов Квиллайи мыльной, имели размер около 40 нм и характерную клетчатую (cage-like) структуру (рис. 1A, 1D). Данные характеристики аналогичны ранее описанным ИСКОМ, в том числе препарату Matrix-M, входящему в состав вакцины NVX-CoV2373 (Novavax, США) для профилактики COVID-19 [9].

Изучая снимки препарата до и после инкубации с антигенами вирусов гриппа, можно оценочно сделать вывод о том, что антиген распределен по поверхности частицы. Важно отметить, что не наблюдается свободного антигена в поле зрения (рис. 1В, 1F).

Частицы, изготовленные с использованием сапонинов Синюхи голубой, имеют размер 250330 нм и слабовыраженную клетчатую структуру (рис. 1C, 1E). При стерилизующей фильтрации фиксировались потери 8,3±4,0%. По сравнению с частицами с размером 40 нм на основе Квил-лайи мыльной в препаратах на основе Синюхи голубой более отчетливо видна ассоциация антигенов вирусов гриппа с частицами, визуально представленная в виде электронно-прозрачного вещества на поверхности частицы (рис. 1C, 1F).

Оценка эффективности интраперитонеальной иммунизации мышей иммуностимулирующими комплексами

Результаты проведения РТГА с образцами сыворотки крови мышей, иммунизированных интраперитонеально, представлены в виде значений СГТ антител на рисунках 2A, 2В и 3A, 3В. Для анализа и обсуждения выбраны группы, в которых значения СГТ составили 1:40 и выше для выбранного типа антигена (про-тективный уровень)3.

В сыворотке крови животных, взятой на 14 сут после иммунизации, только у некоторых животных фиксировалась сероконверсия (рис. 2А). К 28 сут после иммунизации препаратом во всех экспериментальных группах и группах положительного контроля наблюдался подъем значений титров антител к компонентам А/(Нт^т09 и ^(^N2). На компонент вируса гриппа В значения титров 1:40 и выше были только в группе животных, иммунизированных препаратом ИСКОМ-антиген: комплексом 2 мкг каждого антигена + 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВО. Внутри экспериментальных групп и групп положительного контроля не отмечено статистически значимых отличий (Р=0,95) между значениями СГТ на А/(Нт^т09 и A/(H3N2) компоненты на 28 сут. Важно отметить, что значения СГТ к АДНШ1^т09 и ^(^N2) компонентам в группах, иммунизированных препаратами ИСКОМ-антиген: комплексом 2 мкг антигена + 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВР; комплексом 7,5 мкг антигена + 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВО; комплексом 2 мкг антигена + 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВО, были статистически достоверно выше (Р=0,95) в 3,0; 3,5; 5,3 раза (в случае антигенного компонента А/(НШ1^т09) и в 5,3; 6,0; 13,9 раза (в случае антигенного компонента A/(H3N2)) в сравнении со значениями СГТ в ответ на препарат положительного контроля, содержащий 7,5 мкг каждого антигена без ИСКОМ адъюванта. Наиболее сильный ответ был отмечен для препарата, содержащего по 2 мкг антигена и 0,1 ИМЛД50 Ма-трикс-ВО (рис. 2В).

На 142 сут (около 4,5 мес.) после иммунизации наблюдалось снижение титров ко всем антигенным компонентам во всех группах, иммунизированных препаратами ИСКОМ-антиген. Из-за неоднородности ответа снижение у разных животных происходило по-разному. Статистически достоверные различия (Р=0,95) наблюдались между группами животных, иммунизированных препаратами ИСКОМ-антиген: комплексом 2 мкг антигена + 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВР; комплексом 7,5 мкг антигена + 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВО; комплексом 2 мкг антигена + 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВО в сравнении с группой положительного контроля, иммунизированной 2 мкг каждого антигена без ИСКОМ адъюванта (рис. 3А). Важно отметить, что во всех группах также не было статистически достоверных различий (Р=0,95) СГТ на антигенные компоненты А/(Н1№^т09 и А/(Н3№). Во всех группах фактически не определялся ответ на антиген гриппа В или был на пределе определения (рис. 3А).

3 Методические указания МУ 3.1.3490-17 Изучение популяционного иммунитета к гриппу у населения Российской Федерации (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 27.10.2017); 2017.

Рис. 1. Фотографии частиц иммуностимулирующих комплексов, полученных с использованием сапонинов Квиллайи мыльной: А - 100-кратный концентрат Матрикс-BO, В - 100-кратный концентрат Матрикс-BO после инкубации с антигенами гриппозной вакцины. Ультраструктура частиц иммуностимулирующих комплексов: С - частицы Матрикс-BP, изготовленных с использованием сапонинов Синюхи голубой; D - частицы Матрикс-BO, изготовленных с использованием сапонинов Квиллайи мыльной. Фотографии частиц иммуностимулирующих комплексов, полученных с использованием сапонинов Синюхи голубой: E - 100-кратный концентрат Матрикс-BP, F - 100-кратный концентрат Матрикс-BP после инкубации с антигенами гриппозной вакцины.

Fig. 1. Images of the immune-stimulating complexes containing Quillaja saponaria saponins: (A) a concentrate (100*) of Matrix-BO, (B) a concentrate (100*) of Matrix-BO after incubation with influenza vaccine antigens. Ultrastucture of immune-stimulating complexes: Matrix-BP particles containing Polemonium caeruleum saponins (C); Matrix-BO particles containing Quillaja saponaria saponins (D). Images of the immune-stimulating complexes containing Polemonium caeruleum saponins: (E) a concentrate (100*) of Matrix-BP, (F) a concentrate (100*) of Matrix-BP after incubation with influenza vaccine antigens.

■ A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09

■ A/Kansas/14/2017 (H3N2)

■ B/Colorado/06/2017 (B/Victoria lineage)

Рис. 2. Данные реакции торможения гемагглютинации с образцами сыворотки крови иммунизированных интраперитоне-ально мышей, взятыми на 14 (А) и 28 (В) сутки после иммунизации. Ось абсцисс - группы экспериментальных животных: 1 -Матрикс-ВР + 7,5 мкг антигена; 2 - Матрикс-ВР + 2 мкг антигена; 3 - Матрикс-ВО + 7,5 мкг антигена; 4 - Матрикс-ВО + 2 мкг антигена; 5 - 7,5 мкг антигена; 6 - 2 мкг антигена; 7 - Матрикс-ВО без антигена (отрицательный контроль). Ось ординат -среднее геометрическое значений обратных титров антител. В легенде указаны антигены вирусов гриппа, использованные для иммунизации. Вертикальные маркеры погрешностей указывают значения доверительного интервала при P=0,95.

Fig. 2. Data on haemagglutination inhibition in mouse serum samples taken on days 14 (А) and 28 (В) after intraperitoneal immunisation. The X-axis shows the experimental animal groups: (1) Matrix-ВР + 7.5 |g of each antigen; (2) Matrix-ВР + 2 |g of each antigen; (3) Matrix-ВО + 7.5 |ig of each antigen; (4) Matrix-ВО + 2 |ig of each antigen; (5) 7.5 |ig of each antigen; (6) 2 |ig of each antigen; (7) the negative control group of Matrix-ВО without antigens. The K-axis represents geometric means of reciprocal antibody titres. The legend indicates the influenza virus antigens used for immunisation. Whiskers reflect confidence intervals at P=0.95.

После проведенной повторной интраперито-неальной иммунизации идентичными препаратами ИСКОМ-антиген в образцах сыворотки крови, взятых на 28 (170) сут после второй иммунизации, был отмечен значительный подъем значений титров. Анализ результатов РТГА показывает наличие статистически достоверных различий (Р=0,95) значений СГТ на антигенные компоненты A/(H1N1)pdm09, A/(H3N2) и B/Victoria между группами, иммунизированными препаратами, содержащими ИСКОМ адъюванты, и группами, иммунизированными без ИСКОМ адъювантов (рис. 3B). Достоверных различий (Р=0,95) значений СГТ к A/(H1N1)pdm09, A/(H3N2) и B/Victoria между группами, иммунизированными препаратом, содержащим 7,5 мкг или 2 мкг каждого антигена, нет. Существенным образом изменился титр антител к компоненту вируса гриппа В. Если на 142 сут он не определялся, то после второй инъекции достоверные различия (Р=0,95) между значениями СГТ к компонентам A/(H1N1)pdm09 и B/Victoria отсутствуют (рис. 3B). Максимальное значение СГТ к антигену B/CoLorado/06/17 (B/Victoria) составило 1:2413 в группе, иммунизированной комплексом 7,5 мкг антигена +

0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВО. Существенным образом выросли титры к A/(H3N2) компоненту. У некоторых животных, иммунизированных препаратами, содержащими ИСКОМ адъювант, титры были 1:20480, что для реакции торможения гемагглютинации можно назвать рекордными значениями. Значения СГТ к компоненту A/(H3N2) в конкретной группе животных, иммунизированных с ИСКОМ адъювантом, были в 4-7 и 4,6-8,3 раза выше, чем к компонентам А/(НШ1^т09 и В^сЪопа соответственно. Сравнивая экспериментальные группы и группы положительного контроля, можно заключить, что в ответ на введение препаратов с ИСКОМ адъювантом значения СГТ в РТГА были выше в 4,6-12,1 раза в зависимости от типа антигена (рис. 3В).

Ранее полученные экспериментальные данные, а также данные, представленные в требованиях методических указаний, позволяют считать титры 1:40-1:80 протективными, а титры 1:320 и выше защищающими не только от тяжелого течения гриппа, но и от заражения [16]. Нами определены титры кросс-реактивности сывороток, полученных в этой работе, в РТГА с антигенами штаммов вирусов гриппа, ранее

600 560 520 480 440 400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 0

А

22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

■ A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09

■ A/Kansas/14/2017 (H3N2)

■ B/Colorado/06/2017 (B/Victoria lineage)

Рис. 3. Данные реакции торможения гемагглютинации с образцами сыворотки крови иммунизированных интраперитоне-ально мышей, взятыми на 142 сутки после иммунизации (А) и на 28 сутки после повторной иммунизации (170 сутки после иммунизации) (В). Ось абсцисс - группы экспериментальных животных: 1 - Матрикс-ВР + 7,5 мкг антигена; 2 - Матрикс-ВР + 2 мкг антигена; 3 - Матрикс-BO + 7,5 мкг антигена; 4 - Матрикс-BO + 2 мкг антигена; 5 - 7,5 мкг антигена; 6 - 2 мкг антигена; 7 - Матрикс-BO без антигена (отрицательный контроль). Ось ординат - среднее геометрическое значений обратных титров антител. В легенде указаны антигены вирусов гриппа, использованные для иммунизации. Вертикальные маркеры погрешностей указывают значения доверительного интервала при P=0,95.

Fig. 3. Data on hemagglutination inhibition in mouse serum samples taken on 142 day after intraperitoneal immunization (А) and 28 day after boosting second immunization (170 day after immunization) (В). The X-axis shows the experimental animal groups: (1) Matrix-BP + 7.5 |g of each antigen; (2) Matrix-BP + 2 |g of each antigen; (3) Matrix-BO + 7.5 |g of each antigen; (4) Matrix-BO + 2 |g of each antigen; (5) 7.5 |ig of each antigen; (6) 2 |ig of each antigen; (7) the negative control group of Matrix-BO without antigens. The K-axis represents geometric means of reciprocal antibody titres. The legend indicates the influenza virus antigens used for immunisation. Whiskers reflect confidence intervals at P=0.95.

использовавшимися для производства вакцин, эпидемическими штаммами, выделенными в культуре клеток от людей с диагнозом грипп, и допандемическим штаммом A/Solomon Islands/03/06 (H1N1). Результаты определения значений СГТ представлены в таблице 1.

Оценка эффективности внутримышечной иммунизации мышей иммуностимулирующими комплексами

Значения титров антител в образцах сыворотки крови мышей, иммунизированных препаратами ИСКОМ-антиген с адъювантом Матрикс-BO, взятых на 21 сут после внутримышечной иммунизации, а также значения титров антител в образцах сыворотки крови контрольных животных, определенные в РТГА, представлены на рисунке 4A. Животные экспериментальных групп, иммунизированных препаратами ИСКОМ-анти-ген: комплексом 1 мкг антигена + Матрикс-BO или комплексом 5 мкг антигена + Матрикс-BO, в РТГА против четырех антигенов A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09, A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2), B/Washington/02/2019 (B/Victoria), B/Phuket/3073/2013 (B/Yamagata) имели протективные значения СГТ 1:40 и выше.

В группе животных, иммунизированных комплексом ИСКОМ-антиген в дозе 200 нг антигена + Матрикс-BO, протективное значение СГТ 1:92 наблюдалось для A/Guangdong-Maonan/ SWL1536/2019 (H1N1)pdm09. Для остальных антигенов детектируемые в РТГА титры фиксировались у единичных животных. В группе мышей, иммунизированных комплексом ИСКОМ-анти-ген в дозе 50 нг антигена + Матрикс-BO, только у одного животного в РТГА детектировались титры к антигенам A/Guangdong-Maonan/ SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 и B/Phuket/ 3073/2013 (B/Yamagata lineage), которые, тем не менее, не достигали уровня 1:40. У мышей из этой группы не было выявлено титров к остальным антигенам. В группах положительного и отрицательного контролей антитела в сыворотке крови не детектировались в РТГА.

Значения титров антител в образцах сыворотки крови мышей, иммунизированных антигенами с ИСКОМ адъювантом Матрикс-BO, взятых на 42 сут после первой иммунизации (повторная иммунизация проводилась на 21 сут после первой), а также значения титров антител в образцах сыворотки крови контрольных животных, определенные в РТГА, представлены

Таблица 1. Результаты реакции торможения гемагглютинации в образцах сыворотки крови мышей, двукратно интраперито-неально иммунизированных 7,5 мкг или 2 мкг антигена вируса гриппа каждого субтипа (A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09; B/Colorado/06/2017 (B/Victoria); A/Kansas/14/2017 (H3N2)) в составе препарата ИСКОМ Матрикс-BO

Table 1. Results of hemagglutination inhibition reactions in serum samples of mice immunised twice intraperitoneal^ with 7.5 |ig or 2 |g of each haemagglutinin of A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09, B/Colorado/06/2017, and A/Kansas/14/2017 (H3N2) influenza strains, adjuvanted with Matrix-BO

Штамм, использованный в РТГА в качестве антигена Strains used as HI antigens Значения СГТ антител в образцах сыворотки крови животных, иммунизированных препаратами Serum antibody GMTs in animals immunised with the preparations

Матрикс-ВО + 7,5 мкг антигена" Matrix-BQ + 7.5 yg antigen" Матрикс-ВО + 2 мкг антигена" Matrix-BQ + 2 yg antigen"

A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm096 2425 (3068-1917) 2111 (2671-1668)

A/YANA0/1/2019 (H1N1)pdm0c 5382 (7558-3832) 4525 (6699-3057)

A/Russia/01/2009 (H1N1)pdm09c 3675 (5884-2295) 3200 (4335-2361)

A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 800 (1393-459) 566 (837-382)

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

A/Solomon Islands/03/06 (H1N1)" 113 (167-76) 57 (84-38)

A/New Caledonia/20/1999 (H1N1)" <20 <20

A/Kansas/14/2017 (H3N2)6 11143 (13503-9195) 14703 (21063-10264)

A/Texas/50/2012 (H3N2) 673 (1289-351) 1600 (2786-919)

A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) 2690 (3779-1916) 3805 (5344-2710)

A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2) 283 (419-191) 400 (696-230)

B/Colorado/06/2017 (B/Victoria)6 2414 (3046-1913) 1766 (2759-1130)

B/Brisbane/60/2008 (B/Victoria) 1903 (2672-1355) 2263 (5439-941)

B/Washington/02/2019 (B/Victoria) 226 (335-153) 452 (893-229)

B/Phuket/3073/2013 (B/Yamagata) <20 <20

Примечание. РТГА - реакция торможения гемагглютинации; СГТ - среднее геометрическое титров антител. a Доверительный интервал при P=0,95.

b Гомологичные вакцинные штаммы, использованные при иммунизации. с Изоляты вируса гриппа «дикого» типа, выделенные в культуре клеток MDCK. d Штаммы являются допандемическими.

Note. HI-haemagglutinin inhibition reaction; GMT-geometric mean antibody titre. a Confidence intervals are at P=0.95. b Homologous vaccine strains used for immunisation. c Wild-type influenza virus isolates obtained in MDCK. d Prepandemic strains.

1280 1120 960 800 640 480 320 160 0

А

2880 2560 2240 1920 1600 1280 960 640 320 0

7

8

9

1

2

3

4

A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 B/Phuket/3073/2013 (B/Yamagata lineage) A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2) B/Washington/02/2019 (B/Victoria lineage)

Рис. 4. Данные реакции торможения гемагглютинации с образцами сыворотки крови иммунизированных внутримышечно мышей, взятыми на 21 (А) и 42 (В) сутки после иммунизации. Ось абсцисс - группы экспериментальных животных: 1 - Ма-трикс-ВО + 5 мкг антигена; 2 - Матрикс-ВО + 1 мкг антигена; 3 - Матрикс-BO + 200 нг антигена; 4 - Матрикс-BO + 50 нг антигена; 5 - 5 мкг антигена; 6 - 1 мкг антигена; 7 - 200 нг антигена; 8 - 50 нг антигена; 9 - Матрикс ВО без антигена (отрицательный контроль). Ось ординат - среднее геометрическое значений обратных титров антител. В легенде указаны антигены вирусов гриппа, использованные для иммунизации. Вертикальные маркеры погрешностей указывают значения доверительного интервала при P=0,95.

Fig. 4. Data on hemagglutination inhibition in mouse serum samples taken on days 21 (А) and 42 (В) after intramuscular immunisation. The X-axis shows the experimental animal groups: (1) Matrix-BO + 5 |ig of each antigen; (2) Matrix-BO + 1 |ig of each antigen; (3) Matrix-BO + 200 ng of each antigen; (4) Matrix-BO + 50 ng of each antigen; (5) 5 |ig of each antigen; (6) 1 |ig of each antigen; (7) 200 ng of each antigen; (8) 50 ng of each antigen; (9) the negative control group of Matrix-BO without antigens. The K-axis represents geometric means of reciprocal antibody titres. The legend indicates the influenza virus antigens used for immunisation. Whiskers reflect confidence intervals at P=0.95.

B

1

2

3

4

5

6

5

6

7

8

9

на рисунке 4B. Значения СГТ антител в образцах сыворотки крови животных из экспериментальных групп, иммунизированных препаратами ИСКОМ-антиген: комплексом 1, 0,2 или 0,05 мкг каждого антигена с адъювантом Матрикс-BO, после повторной иммунизации достоверно (P=0,95) выросли против всех четырех использованных антигенов. Наибольший рост значений титров зафиксирован в группе мышей, иммунизированных комплексом 0,05 мкг антигена + Ма-трикс-BO, который составил 147, 95, 73 и 24 раза соответственно против A/(H1N1)pdm09, A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2), B/Victoria, B/Yamagata антигенов. В группах животных, внутримышечно иммунизированных препаратами антигенов в дозе 5 и 1 мкг без ИСКОМ адъюванта, не наблюдалось достоверного нарастания значений титров, а в группах, иммунизированных 0,2 и 0,05 мкг, антитела не детектировались в РТГА. Рассматривая вопрос достоверности различий между экспериментальными группами, необходимо отметить, что различия детектировались только между значениями СГТ антител против некоторых антигенов в некоторых группах. То есть в совокупности можно сде-

лать заключение, что при двукратном введении препаратов ИСКОМ-антиген в предложенных концентрациях дозозависимого эффекта не наблюдалось и введение 50 нг антигена вызывает ответ, схожий с ответом на введение 5 мкг.

Результаты оценки выживаемости экспериментальных животных, иммунизированных внутримышечно, инфицированных адаптированным штаммом вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1)pdm09, на 42 сут после первой иммунизации представлены на рисунке 5. Гибель животных из группы отрицательного контроля фиксировалась с 4 сут после заражения. На 9 сут 100% животных погибли. Также гибель животных на 8-15 сут после заражения фиксировалась в группе, дважды иммунизированной препаратом без ИСКОМ адъюванта, смесью антигенов по 50 нг гемагглютинина штаммов A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09, A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2), B/Washington/02/2019, B/Phuket/3073/2013. Неожиданно, но в группе животных, иммунизированных дважды препаратом без ИСКОМ адъюванта, содержащим 200 нг каждого гемаг-глютинина, притом, что ни у одного животного

не фиксировалось титров антител методом РТГА, гибели мышей не наблюдалось.

У выживших животных на 27 сут после заражения были отобраны пробы крови, и сыворотка была исследована в РТГА. Значения титров к компоненту Д/(Н1№^т09 представлены на рисунке 6. Были определены значения титров к исследовавшимся четырем компонентам, но достоверные различия со значениями титров до заражения зафиксированы только для компонента Д/(Н1№^т09. Для животных, иммунизированных препаратами ИСКОМ-антиген в дозе 5 мкг, 1 мкг, 200 нг, 50 нг, имевших высокие титры антител в РТГА перед заражением, характерно снижение титров. На основании статистически достоверных различий (Р=0,95) можно сделать вывод о том, что в группах мышей, иммунизированных препаратами ИСКОМ-антиген: комплексом 5 мкг антигена + Матрикс-ВО и комплексом 50 нг антигена + Матрикс-ВО, падение значений СГТ антител составило 1,52 и 2,3 раза соответственно. В то же время у животных, иммунизированных препаратом без ИСКОМ адъюванта, титры значительно выросли. В группе животных,

иммунизированных препаратом в дозе 50 нг без ИСКОМ адъюванта, выжило 2 животных. В группе отрицательного контроля (Матрикс ВО без антигена) все животные погибли.

Обсуждение

Данные, обсуждаемые в этом исследовании, получены при интраперитонеальной и внутримышечной иммунизации мышей препаратами ИСКОМ-антиген в сравнении с антигенами без ИСКОМ адъюванта. Эти модели дают ряд преимуществ, таких как доступность линейных животных, возможность введения препарата в объеме, рассчитанном исходя из предполагаемого введения человеку, и др. В то же время при внутримышечном введении возможен иной уровень ответа по сравнению с интраперитоне-альным, и для этого были изготовлены препараты с небольшим объемом введения.

Растительные сапонины давно известны и применяются в медицине. С развитием иммунологии стали известны уникальные особенности сапонинов, которые обуславливают выраженные адъювантные свойства, в основном

Сутки Days

Рис. 5. Выживаемость экспериментальных животных, двукратно иммунизированных внутримышечно, после заражения адаптированным штаммом вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)pdm09. В легенде приведены наименования групп: указана доза каждого гемагглютинина в смеси штаммов A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09, A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2), B/Washington/02/2019, B/Phuket/3073/2013 в комплексе с компонентом ИСКОМ Матрикс-BO или без него, а также отрицательный контроль - Матрикс-BO без антигена.

Fig. 5. Survival rates of experimental animals infected with mouse-adapted A/California/04/2009 (H1N1)pdm09 after two intramuscular immunisations. The legend names the study groups, indicating hemagglutinin concentrations of each strain (A/Guang-dong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09; A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2); B/Washington/02/2019; B/Phuket/3073/2013) in the mixtures with or without Matrix-BO, and the negative control group of Matrix-BO without antigens.

2880 2560 2240

Рис. 6. Данные реакции торможения гемагглютинации с образцами сыворотки крови иммунизированных двукратно внутримышечно мышей, инфицированных адаптированным летальным штаммом вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)pdm09. Ось абсцисс - группы экспериментальных животных: 1 - Матрикс-ВО + 5 мкг антигена; 2 - Матрикс-ВО + 1 мкг антигена; 3 - Матрикс-ВО + 200 нг антигена; 4 - Ма-трикс-ВО + 50 нг антигена; 5 - 5 мкг антигена; 6 - 1 мкг антигена; 7 - 200 нг антигена; 8 - 50 нг антигена; 9 - Матрикс ВО без антигена (отрицательный контроль). Ось ординат -среднее геометрическое значений обратных титров антител. На гистограмме указаны данные о титрах антител до заражения животных штаммом A/California/04/2009 (H1N1) pdm09 ( ) и после заражения ( ). Вертикальные маркеры погрешностей указывают значения доверительного интервала при P=0,95.

Fig. 6. Data on hemagglutination inhibition reactions in mice serum samples after two intramuscular immunisations and infection with the A/California/04/2009 (H1N1)pdm09 strain adapted and lethal to mice. The X-axis shows the experimental animal groups: (1) Matrix-ВО + 5 |ig of each antigen; (2) Matrix-ВО + 1 |ig of each antigen; (3) Matrix-ВО + 200 ng of each antigen; (4) Matrix-ВО + 50 ng of each antigen; (5) 5 |ig of each antigen; (6) 1 |ig of each antigen; (7) 200 ng of each antigen; (8) 50 ng of each antigen; (9) the negative control group of Matrix-ВО without antigens. The K-axis represents geometric means of reciprocal antibody titres. The boxes indicate antibody titres to A/California/04/2009 (H1N1)pdm09 before ( ) and after infection ( ■ ). Whiskers reflect confidence intervals at P=0.95.

обусловленные Th1 иммунным ответом [17]. В ходе исследования было установлено, что единообразно стандартизованные и полученные по одной технологии на основе сапонинов Синюхи голубой и Квиллайи мыльной иммуностимулирующие комплексы обладают аналогичными свойствами.

Образцы сыворотки крови, полученные в после интраперитонеального введения комплексов ИСКОМ с антигенами вируса гриппа, имеют сопоставимые значения титров. Коммерчески доступны сапонины Квиллайи мыльной. Сапо-

нины Синюхи голубой могут быть получены в больших количествах, так как это растение пригодно для промышленного культивирования. Данные адъюванты показали перспективные свойства с точки зрения производственных стратегий, предполагающих рациональное использование антигенов. Даже после однократного интраперитонеального введения, на 28 сут после иммунизации, препараты ИСКОМ-ан-тиген, содержавшие комплексы 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВР или 0,1 ИМЛД50 Матрикс-ВО с 2 мкг гемагглютинина каждого вакцинного штамма A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09, A/Kansas/14/2017 (H3N2), B/Colorado/06/2017, вызывали достоверное кратное увеличение титров по сравнению с введением антигена (7,5 мкг антигена) без ИСКОМ адъюванта. В экспериментальных работах, проведенных ранее, было показало, что антитела в титре в РТГА более 1:320 к антигену (H1N1)pdm09 способны защищать животное от заражения вирусом гриппа данного подтипа, а значения титров более 1:40 - от гибели [16]. Полученные в этом исследовании результаты свидетельствуют о том, что от летального исхода при заражении адаптированным к мышам штаммом вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1)pdm09 защищает иммунизация такими концентрациями антигенов, ответ на которые не фиксируется в РТГА, то есть менее 1:10. Несмотря на то что гриппозные антигены, производимые в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), могут иметь серологические отличия от эпидемических штаммов и их культуральных изолятов, иммунный ответ, формируемый на двукратное внутримышечное введение таких низких доз антигенов, полученных с использованием РКЭ, как 0,2 мкг, не приводящий к выработке антител в количествах, детектируемых в РТГА, может являться протективным и предотвращать гибель экспериментальных животных при заражении культуральным штаммом вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)pdm09, прошедшим 8 пассажей на мышах.

После двукратного введения препаратов ИСКОМ-антиген у мышей сформировались такие высокие титры антител в сыворотке крови, уровень которых гипотетически может способствовать формированию стерилизующего иммунитета к вирусам гриппа, при достижении которого можно было бы стремиться к эрадикации гриппа наравне с корью и полиомиелитом при широком распространении такого типа вакцин. Это требует подтверждения в экспериментах с использованием более крупных животных, у которых возможно взятие назальных смывов для количественных исследований репликации вируса.

Можно предположить возможность рассмотрения вопроса об универсальной гриппозной вакцине. В настоящее время под универсальной вакциной в основном понимают препарат равноэффективный в отношении всех вирусов гриппа в течение продолжительного периода времени. Для этих целей рассматривают возможность иммунизации высококонсервативными компонентами вириона - матриксным белком или нуклеопротеином [18]. Серологический анализ, проведенный нами в данном исследовании, показывает, что при использовании препаратов ИСКОМ-антиген антитела имеют кросс-реактивность к циркулировавшим ранее штаммам гриппа на протективном уровне. Наиболее ярким свидетельством этого является то, что значения СГТ антител к допан-демическому штамму A/SoLomon Islands/03/06 (H1N1) при двукратной интраперитонеаль-ной иммунизации антигенами, входившими в вакцину сезона 2019-2020 гг., составили 113,2 (167,5-76,5) и 56,6 (83,7-38,2) для групп животных, иммунизированных препаратами ИСКОМ-антиген: комплексами 7,5 и 2 мкг каждого антигена и 0,1 ИМЛД50 Матрикс-BO соответственно. Эти значения статистически неразличимы со значениями титров антител к использовавшемуся при иммунизации штамму A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09 на 28 сут в группе животных, однократно интраперито-неально иммунизированных вакциной в дозе 7,5 мкг. Штаммы разделяет не только 12-летний интервал циркуляции, но и то, что предшественник A/Brisbane/02/2018 (H1N1)pdm09 в это время циркулировал в популяциях свиней.

Также заслуживает внимания факт, что образцы сыворотки крови мышей, полученные при иммунизации компонентом вакцины B/Colorado/06/2017 (B/Victoria), имеют значения СГТ антител к штамму B/Brisbane/60/2008 (Victoria) в интервале 1:1902,7-1:2262,7 в зависимости от группы животных, и эти титры статистически неразличимы (P=0,95) в сравнении с титрами к гомологичному штамму B/Colorado/06/2017 (B/Victoria). Для исследованных негомологичных штаммов подтипа H3N2 значения СГТ антител были ниже по сравнению со значениями титров в РТГА со штаммом A/Kansas/14/2017 (H3N2), использовавшимся при иммунизации, но они также позволяют говорить не только о протективном, но и, вероятно, стерилизующем иммунитете для временного интервала 10 лет.

Отдельно стоит обратить внимание на данные по кросс-реактивности полученных сывороток с изолятами вируса гриппа «дикого» типа, выделенными на клеточной культуре MDCK.

Для исследованных в этой работе антигенов штаммов А/(НШ1^т09 нет достоверных различий между образцами, полученными в РКЭ, и культуральными изолятами, циркулировавшими 11 лет назад (табл. 1). В Российской Федерации производство инактивированных гриппозных вакцин основано на культивировании штаммов-продуцентов в РКЭ. За счет адаптации к клеткам птиц вирус изменяется, и после иммунизации наблюдается снижение кросс-реактивности с изолятами вируса гриппа «дикого» типа. Анализ образцов сыворотки крови, полученных в этом исследовании при иммунизации мышей антигенами, полученными в РКЭ, в составе комплекса ИСКОМ-антиген, показал, что между значениями СГТ, определенными при постановке РТГА с использованием штаммов-продуцентов, адаптированных к РКЭ, и «диких» культураль-ных изолятов подтипа А/(НШ1^т09 не выявляется статистически достоверных различий. Эти данные сопоставимы с аналогичными результатами, полученными ранее [19, 20].

Заключение

В результате выполнения данной работы создана лабораторная технология получения ИСКОМ адъювантов с использованием сапонинов Синюхи голубой и Квиллайи мыльной. Структура препаратов была изучена с помощью электронной микроскопии, установлена идентичность ИСКОМ адъюванта Матрикс-ВО адъю-ванту Ма^х-М (Novavax, США). Исследование биологических свойств показало, что полученные нами препараты аналогичны адъювантам, используемым в производстве вакцины против COVID-19 NVX-CoV2373 и гриппозной вакцины №noFlu (Novavax, США).

Результатом внедрения ИСКОМ адъюван-тов Матрикс-ВО и Матрикс-ВР может стать существенное снижение потребности в антигенах вирусов при производстве вакцин. Опираясь на полученные данные, можно высказать предположение, что при использовании Матрикс-ВР и Матрикс-ВО или аналогичных адъювантов возможно достигнуть экономии антигенов в 15-30 раз для препаратов, вводимых однократно, и 150-300 раз для препаратов, вводимых двукратно и более. Эффективность использования препаратов Матрикс-ВР и Матрикс-ВО в разработке вакцин для профилактики инфекционных заболеваний, показанная в нашем исследовании, позволяет считать целесообразным рассмотрение возможности их применения также и при разработке иммунокорректиру-ющих препаратов.

Литература/References

1. Morein B, Sundquist B, Hoglund S, Dalsgaard K, Osterhaus A. Iscom, a novel structure for antigenic presentation of membrane proteins from enveloped viruses. Nature. 1984;308(5958):457-60. https://doi. org/10.1038/308457a0

2. Villacres MC, Behboudi S, Nikkila T, Lovgren-Bengts-son K, Morein B. Internalization of Iscom-borne antigens and presentation under MHC class I or class II restriction. Cellular Immunology. 1998;185(1):30-8. https://doi.org/10.1006/cimm.1998.1278

3. Cibulski SP, Mourglia-Ettlin G, Teixeira TF, Ouirici L, Roehe PM, Ferreira F, Silveira F. Novel ISCOMs from Quillaja brasiliensis saponins induce mucosal and systemic antibody production, T-cell responses and improved antigen uptake. Vaccine. 2016;34(9):1162-71. https://doi.org/10.1016/j~.vaccine.2016.01.029

4. den Brok MH, Bull C, Wassink M, de Graaf AM, Wagenaars JA, Minderman M, et al. Saponin-based adjuvants induce cross-presentation in dendritic cells by intracellular lipid body formation. Nat Commun. 2016;7:13324. https://doi.org/10.1038/ ncomms13324

5. Marty-Roix R, Vladimer GI, Pouliot K, Weng D, Bugli-one-Corbett R, West K, et al. Identification of OS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. J Biol Chem. 2016;291(3):1123-36. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.683011

6. Barr IG, Mitchell GF. ISCOMs (immunostimulat-ing complexes): the first decade. Immunol Cell Biol. 1996;74(1):8-25. https://doi.org/10.1038/icb.1996.2

7. Черникова МИ, Васильев ЮМ. Вакцины против гриппа с иммуноадъювантами: данные прямых сравнительных исследований. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2015;(5):88-102. [Chernikova MI, Vasiliev YuM. Adjuvanted influenza vaccines: data from direct comparative studies. Zhurnal mikrobiologii, èpidemiologii i immunobiologii=Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2015;(5):88-102 (In Russ.)]

8. Shinde V, Cho I, Plested JS, Agrawal S, Fiske J, Cai R, et al. Comparison of the safety and immunogenicity of a novel Matrix-M-adjuvanted nanoparticle influenza vaccine with a quadrivalent seasonal influenza vaccine in older adults: a phase 3 randomised controlled trial. Lancet Infect Dis. 2022;22(1):73-84. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(21)00192-4

9. Keech C, Albert G, Cho I, Robertson A, Reed P, Neal S, et al. Phase 1-2 trial of a SARS-CoV-2 recombinant spike protein nanoparticle vaccine. N Engl J Med. 2020;383:2320-32. https://doi.org/10.1056/NEJ-Moa2026920

10. Лиознов ДА, Харит СМ, Ерофеева МК, Зубко-ва ТГ, Горчакова ОВ, Николаенко СЛ. Оценка ре-актогенности и иммуногенности вакцины гриппозной четырехвалентной инактивированной субъединичной. Эпидемиология и вакцинопрофи-лактика. 2018;17(3):57-62. [Lioznov DA, Kharit SM, Erofeeva MK, Zubkova TG, Gorchakova OV, Nikolaenko SL. Assessment of reactogenicity and immunogenicity of the quadrivalent live attenuated influenza vaccine. Epidemiologiya i

vaccinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2018;17(3):57-62 (In Russ.)] https://doi. org/10.31631/2073-3046-2018-17-3-57-62

11. Никифорова АН, Миронов АН, Бушменков ДС, Меркулов ВА, Степанов НН. Безопасность и иммуно-генность инактивированной гриппозной вакцины с адъювантом совидон производства ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011;(2):30-4. [Nikiforova AN, Mironov AN, Bushmenkov DS, Merkulov VA, Stepanov NN. Safety and immunogenicity of inactivated influenza vaccine associated with sovidon, developing by «Microgen». Epidemiologiya i vaccinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2011;(2):30-4 (In Russ.)]

12. Ko EJ, Kang SM. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Hum Vaccin Immunother. 2018;14(12):3041-5. https://doi.org/10.1080/21645 515.2018.1495301

13. Evseenko VA, Gudymo AS, Danilchenko NV, On-khonova GS, Vu LT, Ryzhikov AB. Saponins extracted from Polemonium caeruleum have adjuvant activity in guinea pig intranasal immunization with trivalent influenza antigens. Frontiers Drug Chemistry Clinical Res. 2020;3:1-5. https://doi.org/10.15761/FDC-CR.1000142

14. El Barky AR, Hussein SA, Alm-Eldeen AA, Hafez YA, Mohamed TM. Anti-diabetic activity of Holo-thuria thomasi saponins. Biomed Pharmacother. 2016;84:1472-87. https://doi.org/10.1016/j.bio-pha.2016.10.002

15. Ашмарин ИП, Воробьев АА. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. [Ashmarin IP, Vorob'ev AA. Statistical methods in microbiological research. Leningrad: Medgiz; 1962 (In Russ.)]

16. Evseenko VA, Kolosova NP, Gudymo AS, Maltsev SV, Bulanovich JA, Goncharova NI, et al. Intranasal immunization of guinea pig with trivalent influenza antigen adjuvanted by Cyclamen europaeum tubers extract. Arch Virol. 2019;164(1):243-7. https://doi. org/10.1007/s00705-018-4023-3

17. Song X, Hu S. Adjuvant activities of saponins from traditional Chinese medicinal herbs. Vaccine. 2009;27(36):4883-90. https://doi.org/10.1016/j.vac-cine.2009.06.033

18. Nguyen OT, Choi YK. Targeting antigens for universal influenza vaccine development. Viruses. 2021;13(6):973. https://doi.org/10.3390/v13060973

19. Cox F, Saeland E, Baart M, Koldijk M, Tolboom J, Dekking L, et al. Matrix-M™ adjuvation broadens protection induced by seasonal trivalent virosomal influenza vaccine. Virol J. 2015;12:210. https://doi. org/10.1186/s12985-015-0435-9

20. Rimmelzwaan GF, Baars M, van Beek R, de Lijster P, de Jong JC, Claas EC, Osterhaus AD. Influenza virus subtype cross-reactivities of hemagglutination inhibiting and virus neutralising serum antibodies induced by infection or vaccination with an IS-COM-based vaccine. Vaccine. 1999;17(20-21):2512-6. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(99)00063-8

Вклад авторов. В.А. Евсеенко — разработка технологии и получение иммуностимулирующих вирусоподобных комплексов, существенный вклад в концепцию и дизайн работы; анализ, интерпретация результатов работы, написание текста рукописи; А.С. Гудымо — комплекс экспериментальных работ с лабораторными животными; Н.В. Данильченко — комплекс экспериментальных работ с лабораторными животными; С.В. Святченко — наработка и подготовка вируса гриппа, адаптированного к мышам, написание текста рукописи; О.С. Таранов — проведение комплекса электронно-микроскопических исследований; А.Б. Рыжиков — утверждение окончательного варианта статьи для публикации. Соответствие принципам этики. Протокол исследования с использованием лабораторных животных был одобрен Биоэтической комиссией № 1 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (протокол ГНЦ ВБ «Вектор»/03-04.2021).

Благодарности. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2019-1665). Комплекс серологических исследований в данной работе был выполнен старшим научным сотрудником отдела зоонозных инфекций и гриппа ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора Дурымановым Александром Гавриловичем (1951-2021). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Authors' contributions. V.A. fvseenko-development of the production technology and production of the immune-stimulating virus-like complexes, a significant contribution to the concept and design of the work, analysis and interpretation of the results of the work, drafting of the manuscript; A.S. Gudymo-experimental work with laboratory animals; N.V. Danilchenko-experimental work with laboratory animals; S.V. Svyatchenko—development and preparation of the influenza virus adapted to mice, drafting of the manuscript; O.S. Taranov-elec-tron microscopic studies; A.B. Ryzhikov-approval of the final version of the article for publication. Ethics approval. The animal study protocol was approved by Bioethics Committee No. 1 of the SRC VB "Vector" (approval No. 03-04.2021).

Acknowledgements. This work was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (Agreement No. 075-15-2019-1665). The serologic studies reported in this article were performed by Alexander G. Durymanov (1951-2021), senior research scientist, Department of zoonotic diseases and influenza, SRC VB "Vector".

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest requiring disclosure in this article.

Об авторах / Authors

Евсеенко Василий Александрович, канд. биол. наук.

ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6720-1040

[email protected]

Гудымо Андрей Сергеевич. ORCID: https://orcid.

org/0000-0001-6952-6412

[email protected]

Данильченко Наталья Викторовна. ORCID: https://

orcid.org/0000-0003-2655-4629

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

[email protected]