CC BY
154
© коллектив авторов, 2013
УДК 616.98:579.842.23]-078:575.08
м. в. Афанасьев, Е. в. Чипанин, в. Е. Шестаков, А. в. Денисов, Л. А. Фомина, А. С. Остяк, С. в. Балахонов
разработка и использование пцр-системы в режиме реального времени для детекции YERSINIA PESTIS в ПОЯЕвОМ материаяе
ФКУз Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего востока Роспотребнадзора
В работе представлены результаты создания и практического применения ПЦР-тест-системы в режиме реального времени для детекции возбудителя чумы в полевом материале. После демонстрации хороших результатов в лабораторных условиях данная система была применена в условиях полевой лаборатории эпидемиологического отряда при плановом эпи-зоотологическом обследовании Горно-Алтайского природного очага чумы. На большом количестве исследуемого материала (более 1400 объектов) показаны высокая чувствительность и специфичность предлагаемой системы, а ее адаптация для реал-тайм-амплификатора "Smart Cycler" ("Cephid", США), обладающего рядом специфических технических характеристик, позволяет рассматривать предлагаемую тест-систему как эффективный, чувствительный и точный инструмент при скрининговых исследованиях в процессе регулярных эпизоотологических обследований природных очагов чумы.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, Yersinia pestis, полевой материал
M.V. Afanasiyev, Ye.V. Tchipanin, V.Ye. Shestakov, A.V. Denisov, L.A. Fomina, A.S. Ostyak, S.VBalakhonov THE DEVELOPMENT AND IMPLEMENTATION OF POLYMERASE CHAIN REACTION TO DETECT IN REAL-TIME OPERATION MODE YERSINIA PESTIS IN FIELD MATERIAL
The article presents the results of development and practical implementation of system of polymerase chain reaction testing in realtime operation mode to detect agent of plague in field material. In laboratory conditions the system demonstrated good results and hence it was applied in conditions of field laboratory of epidemiologic team during planned epizootologic examination of Gorno-Altaisk hot .spot ofplague. The .sampling consisted of more than 1400 objects. It was demonstrated that high sensitivity and specificity is immanent to proposed system. The adaptation of the system to the real time amplifier "Smart Cycler" (Cephid, USA) having some specific technical characteristics makes it possible to consider the proposed test-system as an effective sensitive and precise instrument for screening studies in the process of regular epizootologic examinations of hot spots ofplague.
Key words: polymerase chain reaction, Yersinia pestis, field material
Чума - особо опасная трансмиссивная природно-очаговая инфекция, вызываемая Yersinia pestis. Активные природные очаги чумы выявлены на всех континентах, за исключением Антарктиды и Австралии, и занимают около 6-7% площади суши. Существует реальная угроза заражения чумой людей, находящихся в пределах активного природного очага, с последующим выносом инфекции за его пределы и в процессе реализации воздушно-капельного механизма передачи быстрого и неконтролируемого распространения инфекции в человеческой популяции. В настоящее время в рамках превентивных мероприятий для предотвращения реализации подобного сценария используют комплексный подход, включающий традиционные микробиологические, эпизоотологические и паразитоло-гические исследования, выполняемые непосредственно в очаге, что позволяет своевременно детектировать изменение активности очага, оценивать и прогнозировать потенциальные риски. Однако такой подход весьма трудоемкий и дорогостоящий, поэтому сегодня на первый план выходят новые методы исследования, основанные на генетической детекции возбудителя в исследуемом материале. Обладая высокой чувствительностью и специфичностью, эти методы позволяют выполнять масштабные скрининговые исследования. В
Для корреспонденции:
Афанасьев Максим Владимирович, вед. науч. сотр. отд. эпидемиологии
Адрес: 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Телефон: (8964)279-70-48 E-mail: afanasev_max@mail.ru
то же время использование в этих целях высокотехнологичного оборудования, требовательного к условиям эксплуатации, необходимость в ряде случаев выполнения дополнительных манипуляций (сложная пробопод-готовка, электрофоретическая детекция результатов исследования) существенно ограничивает использование методов молекулярной диагностики непосредственно при полевых исследованиях в условиях природного очага. Таким образом, цель настоящей работы - разработка высокочувствительной, специфичной, простой, пригодной для использования в полевых условиях диагностической ПЦР-тест-системы в реальном времени (РВ-ПЦР), представляется весьма актуальной.
Материалы и методы. В качестве контрольных использовали 6 штаммов микроорганизмов, относящихся к роду Yersinia: Y. pestis EV НИИЭГ, Y. kristensenii 5658(1), Y. intermedia 267-69 (1), Y. pseudotuberculosis 430, Y. enterocolitica 49 и Y. frederiksenii 120 из коллекции ФКУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора.
Эктопаразиты (блохи и вши) (n = 1206) и мелкие млекопитающие (n = 264) были собраны в процессе планового эпизоотологического обследования ГорноАлтайского природного очага чумы в сентябре 2010 г. на Курайском участке природной очаговости. Сбор, учет, транспортировку, первичную обработку материала, а также его микробиологическое исследование осуществляли в соответствии с действующими нормативно-методическими документами [3, 4].
Выделение тотальной ДНК из культур контрольных штаммов микроорганизмов, а также из суспензий органов мелких млекопитающих осуществляли с использованием набора для выделения ДНК "ДНК-сорб В" (кат.
микробиология
№ К1-2-100, "ИнтерЛабСервис", Москва) в соответствии с инструкциями производителя.
Выделение ДНК из эктопаразитов осуществлялось по следующей методике: объединенные пулы (5-10 особей одного вида, собранные с одной точки/млекопитающего/гнезда) эктопаразитов растирали в ступке в физиологическом растворе. 200 мкл полученной суспензии переносили в 1,5 мл пробирку типа Эппендорф и инкубировали в твердотельном термостате при 990С в течение 30 мин с целью обеззараживания и термоэкстракции ДНК. После инкубации пробы центрифугировали при 13,5 тыс. об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость в количестве 5 мкл использовали в ПЦР.
РВ-ПЦР выполняли, используя универсальный набор реактивов для проведения ПЦР в реальном времени с Taq-ДНК-полимеразой и ингибирующими активность фермента антителами, содержащим интеркалирую-щий краситель SYBR-Green I (кат. № М-427, «Синтол», Москва), в объеме 25 мкл, и набор праймеров 3а-1 (5'-TGTAGCCGCTAAGCACTACCATCC-3') и 3а-2 (5'-GGCAACAGCTCAACACCTTTGG-3') [10]. Амплификацию выполняли на реал-тайм-амплификаторе Smart Cycler («Cephid», США) по следующей программе: предварительная денатурация 940C - 5 мин; 40 циклов 940C - 20 с, 620C - 50 с с детекцией флюоресценции после каждого цикла; анализ кривой плавления полученных ПЦР-продуктов в температурном диапазоне от 60 до 950C со ступенчатым повышением температуры на 0,20C в течение 1 с, с детекцией флюоресценции в конце каждого шага повышения.
Для повторных исследований контрольных штаммов рассчитывали среднее значение температуры плавления, стандартное отклонение (SD) и 95% доверительный интервал (CI95%).
Результаты и обсуждение. ПЦР для детекции возбудителя чумы в эктопаразитах используют достаточно давно, и в подавляющем большинстве исследований показана высокая эффективность данного подхода [1, 2, 6, 7]. Разработаны системы, позволяющие выявлять не только наличие возбудителя, но и параллельно определять его наиболее значимые клинические и эпидемиолого-эпизоотологические характеристики, такие как наличие детерминант вирулентности и па-тогенности, проводить дифференцировку с близкородственными видами или возбудителями других особо опасных и природно-очаговых инфекций [8, 11]. Однако практическое применение этих диагностических систем ограничивалось стенами специализированных лабораторий. В то же время очевидна необходимость разработки и практических испытаний диагностических систем и алгоритмов, позволяющих проводить детекцию возбудителя чумы в исследуемом материале в условиях полевых лабораторий или мобильных лабораторных комплексов.
Исходя из этого, мы попытались создать тест-систему, которая могла бы применяться вне специализированных стационарных лабораторий и отвечала бы таким требованиям, как достаточная чувствительность и специфичность, простая пробоподготовка, простота выполнения анализа, получение однозначных, легко интерпретируемых результатов. При этом учитывали не только требования к реактивам и материалам, но и к формату анализа, приборному обеспечению исследования. Использование детекции продуктов реакции в реальном времени позволило исключить этап электрофо-ретического анализа, уменьшив тем самым количество необходимого оборудования, упростив и ускорив иссле-
дование, уменьшив вероятность контаминации исследуемых образцов продуктами амплификации. Введение в амплификационный протокол этапа анализа кривых плавления дало возможность оценки специфичности полученных продуктов и исключения результатов неспецифической амплификации.
Параметры реакции оптимизировали для амплифика-тора Smart Cycler («Cephid», США); его технические характеристики: небольшие габариты (30 x 30 x 25 см, масса 9,9 кг), широкий диапазон требований по электропитанию (от 100 до 240 В), отсутствие движущихся компонентов, наличие транспортного кофра - делают эту модель очень удобной для эксплуатации в полевых условиях.
В качестве детектируемого локуса выбрали специфический для Y. pestis участок, расположенный между нуклеотидами 2366982 и 2367863 на хромосоме генома Y. pestis СО92, фланкируемый нуклеотидными последовательностями, которые комплементарны праймерной системе 3А, разработанной L. Radnedge и соавт. [10]. Хромосомная локализация исследуемого локуса позволяет детектировать варианты возбудителя, утратившего другие видоспецифические генетические детерминанты, которые локализуют на мобильных генетических элементах (гены капсульного антигена F1, р1а-ген и др., гены острова патогенности) [9], что является очень важным преимуществом при скрининговых исследованиях в природных очагах. Эффективность праймерной системы 3А показана в работе А. Л. Трухачева и соавт. [5], которые с ее помощью успешно детектировали штаммы Y. pestis разных подвидов и разного плаз-мидного состава, выделенные в различных природных очагах чумы на территории России, бывших союзных республик, Индии, Манчжурии, Монголии, Вьетнама, Турции, Кении, Мадагаскара, Сенегала. Однако эти же авторы обнаружили ряд выделенных на Африканском континенте и достаточно долго хранившихся штаммов, не детектируемых данной праймерной системой. Высказано предположение о том, что полученный результат связан с эволюционной древностью этих штаммов. С учетом того, что активные сибирские природные очаги чумы относительно молодые, а эффективность праймерной системы 3А для детекции возбудителя чумы, выделяемого на территории природных очагов Российской Федерации и бывших республик Советского Союза, показана в том числе и в вышеупомянутой работе, данные праймеры использовали в нашей тест-системе.
На первом этапе исследования оценивали чувствительность и специфичность тест-системы в лабораторных условиях. Для тестирования специфичности использовали панель образцов ДНК шести лабораторных штаммов микроорганизмов, относящихся к роду Yersinia. Эксперимент проводили в пяти повторах. Во всех случаях положительный сигнал обнаруживали только в образцах, содержащих ДНК штамма Y. pestis EV НИИЭГ.
Чувствительность анализа составила не менее 10 м.к/мл Y. pestis EV НИИЭГ. Средняя температура плавления продуктов амплификации для 30 образцов, содержащих ДНК штамма Y. pestis EV, составила 88,490C (SD = ±0,120C; CI95% (88,45-88,530C).
На втором этапе исследования изучали возможность использования предложенной системы в полевых условиях функционирования эпидемиологического отряда, работающего в природном очаге чумы.
В процессе эпизоотологического и паразитологи-ческого обследования Курайского участка очаговости
ответственно). Среди исследованных млекопитающих преобладала пищуха монгольская Ochotona pricei (77,3%, 204/264).
Методами традиционного микробиологического анализа выделили 9 культур чумного микроба из блох (Р. сса1опае - 1 образец, Scorodumovi - 2, Amphalius runatus - 1, С. hirticrus - 2) и мелких млекопитающих (О. pricei - 2, Phodopus sungorus - 1).
На основании фенотипиче-ских признаков все изолированные культуры были отнесены к виду Y. pestis подвида altaica.
В РВ-ПЦР зарегистрировали 11 положительных результатов, 9 из которых совпали с положительными результатами микробиологического анализа.
Средняя температура плавления продуктов амплификации для положительных полевых образцов составила 88,50oC (SD = ±0,12oC; CI95% (88,3-88,84oC).
Диагностическая чувствительность и специфичность РТ-ПЦР составила 100 и 99,8% соответственно.
Результаты микробиологического и генодиагностического исследования представлены в таблице.
В процессе работы над системой выявили ряд ограничений, которые необходимо учитывать при ее использовании. Во-первых, как уже упоминалось выше, предлагаемым способом невозможно установить наличие детерминант вирулентности чумного микроба плазмидной локализации. Однако область применения данной системы не подразумевает таких задач, а ориентирована в первую очередь на скрининговые исследования, направленные на выявление возбудителя (в том числе и форм, утративших генетические детерминанты, которые ассоциированы с внехромосомными генетическими элементами) в полевом исследуемом материале. Во-вторых, для прибора smart Cycler требуются оригинальные пластиковые пробирки с уникальной геометрией, более дешевых аналогов которым не существует. В целом представленная тест-система продемонстрировала достаточную диагностическую чувствительность, специфичность и эффективность при полевых исследованиях, что дает возможность рекомендовать ее к широкому использованию в качестве скринингового теста при эпизоотологическом мониторинге природных очагов чумы.
Исследуемый материал и результаты его микробиологического и генетического исследования
Исследуемый материал Результат
Место выделения вид (%: количество/общее количество) микробиологическое исследование РВ-ПЦР
Эктопаразиты
Восточная Amphipsylla primaris primaris (0,33; 4/1206) - -
часть Курай-ского хребта Amphalius runatus (0,75; 9/1206) - -
Callopsylla caspia gaiskii (0,16; 2/1206) Ctenophyllus hirticus (6,2; 75/1206) Citellophilus tesquorum altaicus (0,33; 4/1206) Frontopsylla elata elata (0,08; 1/1206) Frontopsylla frontalis baikal (0,41; 5/1206) Frontopsylla hetera (1,6; 19/1206) Oropsylla alaskensis (0,08; 1/1206) Paradoxopsyllus kalabukhovi (5,22; 63/1206) - -
Paradoxopsyllus scorodumovi (8,79; 106/1206) 2 положительных 2 положительных
Paramonopsyllus scalonae (5,97; 72/1206) 1 положительный 1 положительный
Rhadinopsylla dahurica (0,75; 9/1206) - -
Dermacentor nuttalli (12,6; 152/1206) - -
Централь- A. p. primaris (0,16; 2/1209) - -
ная часть Курайского хребта A. runatus (1,6; 20/1206) 1 положительный 1 положительный
C. hirticus (10,28; 124/1206) Echidnophaga oschanini (2,16; 26/1206) F. f. baikal (0,08; 1/1206) F. hetera (2,32; 28/1206) o. alaskensis (0,16; 2/1206) P. kalabukhovi (1,57; 19/1206) P. scalonae (16,83; 203/1206) p. scorodumovi (9,62; 116/1206) Rhadinopsylla altaica (0,08; 1/1206) Anoplura (0,25; 3/1206) D. nuttalli (11,61; 140/1206) 2 положительных 3 положительных 1 положительный
Млекопитающие (зайцеобразные и грызуны)
Восточная Alticola strelzowi (15,15; 40/264) - -
часть Курай-ского хребта Ochotona daurica (5,68; 15/264) - -
Ochotona pricei (26,89; 71/264) 1 положительный 1 положительный
Phodopus sungorus (0,38; 1/264) 1 положительный 1 положительный
Spermophilus undulatus (0,76; 2/264) - -
Централь- O. daurica (0,38; 1/264) - -
ная часть Курайского хребта O. pricei (50,38; 133/264) 1 положительный 1 положительный
S. undulatus (0,38; 1/264) - -
Горно-Алтайского природного очага чумы исследовали 1206 эктопаразитов 17 разных видов и 264 мелких млекопитающих 5 разных видов. Среди эктопаразитов, включенных в исследование, преобладали клещи БегтасеПюг пийаШ, блохи Paramonopsyllus scalonae, Paradoxopsyllus scorodumovi, CtenophyUus Ыгйсгш (24,2%, 292/1206; 22,8%, 275/1206; 18,4%, 222/1206; 16,5%, 199/1206 со-
микробиология
ЛИТЕРАТУРА
1. Балахонов С. В., Воронова Г. А., Шестопалов М. Ю. и др. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2000; 3: 29-31.
2. Куличенко А. К., Норкина О. В., Гинцбург А. Л. и др. Генетика. 1994; 30 (7): 167-71.
3. Методические указания по отлову, учету и прогнозу численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах инфекций. М.: Информационно-издательский центр Минздрава России; 2001. 88 с.
4. МУ 3.1.2007-01. Методические указания по сбору, учету и подготовке к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций. М.: Информационно-издательский центр Минздрава России; 2001. 63 с.
5. Трухачев А. Л., ИвановаB. C., Арсеньева Т. Е. и др. Клиническая лабораторная диагностика. 2008; 12: 49-52.
6. Campbell J., Lowe J., Walz S. et al. J. Clin. Microbiol. 1993; 31 (2): 758-9.
7. Hinnebusch J., Schwan T. G. J. Clin. Microbiol. 1993; 31 (6): 1511-4.
8. Matero P., Pasanen Т., Laukkanen R. et al. APMIS. 2009; 117 (1): 34-44.
9. Neubauer H., Meyer H., Prior J. et al. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Publ. Health. 2000; 47 (8): 573-80.
10. Radnedge L., Gamez-Chin S., McCready P. M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67 (8): 3759-62.
11. WoronA. M., NdzarianE. J., Egan C. et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2006; 56 (3): 261-8.
Поступила 11.05.12
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2013
УДК 616.155.392.2-036.12-07]:577.21.08
Т. Е. Сизикова, Е. в. мельникова, А. в. маношкин, А. А. Петров, Д. Г. мельников, в. Б. Пантюхов, в. Н. Лебедев, С. в. Борисевич
использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции
Научно-исследовательский центр ФБУ 33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
При постановке полимеразной цепной реакции для обеспечения достоверности полученных результатов используют внешние или внутренние контрольные образцы. С помощью внешних контрольных образцов устанавливают работоспособность реагентов, входящих в состав диагностического набора. Внутренние контрольные образцы позволяют контролировать не только все стадии реакции, но и ход амплификации в каждой индивидуальной пробирке с реакционной смесью.
Ключевые слова: положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, внутренний контрольный образец, обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция
T.Ye. Syzykova, Ye.V. Melnikova, A.V. Manoshkin, A.A. Petrov, D.G. Melnikov, V.B. Pantyukhov, V.N. Lebedev, S.VBorisevitch THE APPLICATION OF EXTERNAL AND INTERNAL CONTROL OBJECTS IN CASE OF USING OF POLYMERASE CHAIN REACTION AND REVERSE TRANSCRIPTION OF POLYMERASE CHAIN
REACTION
The external and internal control samples are used in case ofpolymerase chain reaction application to ensure validity of results. The external control samples are used to establish operability of reagents included into diagnostic kit. The internal control samples make it possible to check not only all the stages of reaction but also the process of amplification in each individual test tube with reaction mixture.
Key words: positive control sample, negative control sample, internal control sample, reverse transcription, polymerase chain reaction
К любому используемому в лабораторной практике диагностическому набору для выявления и идентификации того или иного возбудителя в биологических пробах предъявляют ряд универсальных требований. Это чувствительный специфичный метод выявления возбудителя; удобство и простота использования; стабильность всех компонентов, необходимых для проведения анализа, в течение длительного времени; воспроизводимость результатов анализа независимо от используемой серии
Для корреспонденции: Сизикова Т. Е., канд. биол. наук
Адрес: 141306, Московская обл., Сергиев Посад, ул. Октябрьская, 6 Телефон: (496)552-12-06
набора реагентов; минимизация влияния так называемого человеческого фактора [3].
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для РНК-содержащих вирусов, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью, предъявляет определенные требования к выполнению всех этапов постановки анализа, начиная от взятия клинического материала и заканчивая регистрацией продуктов амплификации. Ошибка на любом из этих этапов может привести к неправильному результату анализа и как возможное следствие к ошибочному диагнозу [3, 15, 16].
Использование как внешних, так и внутренних контрольных образцов позволяет контролировать не только все стадии прохождения реакции, но и ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Изложен-
