CC BY
0Е.В. Сордонова, канд. биол. наук, доц., e-mail: lena_mangsord@mail.ru C-Д. Жамсаранова, д-р биол. наук, проф., e-mail: zhamsarans@mail.ru Д.В. Лыгденов, аспирант, e-mail: dandar-piter@mail.ru Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, г. Улан-Удэ
УДК 641.11:544.141
РАЗРАБОТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ОРГАНИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ ЙОДА И ЦИНКА
В условиях природного дефицита эссенциальных микроэлементов (йод, цинк), а также заболеваний, вызванных недостатком йода и цинка, разработка эффективных способов профилактики и лечения является чрезвычайно актуальной.
В работе предпринята попытка иммобилизации цинка и йода и создания органических форм микроэлементов. В качестве органического носителя был использован гидролизат соевого белка. Разработаны условия ферментативного гидролиза соевого белка. В качестве фермента был использован пепсин. Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены условия иммобилизации цинка и йода. 1 мг полученного комплекса содержал 0,08 мкг йода и 1,74 мг цинка. Изучены способы химического связывания микроэлементов с функциональными группами носителей. Исследованы наличие химических связей, устойчивость полученных комплексов. Установлено образование ковалентной связи с цинком и ионной связи с йодом. Суммарная энергия комплексной молекулы является достаточно малой величиной (- 6535,689 kcal/mol), среднеквадратичный градиент незначительно отличается от нуля (0,06 kcal/Ахмоль), что свидетельствует о сбалансированности энергетических свойств системы и об эффективной минимизации энергии. Величина дипольного момента (3,508 Дебая) характеризует равномерность распределения электронной плотности. Полученные характеристики подтверждают достоверность предложенной гипотетической модели.
Разработка новых способов иммобилизации и получения органических форм микроэлементов с заранее заданной концентрацией дефицитных микроэлементов является приоритетной задачей для профилактики заболеваний, связанных с недостатком микроэлементов в различных регионах Российской Федерации.
Ключевые слова: йод, цинк, соевый гидролизат, иммобилизация.
E.V. Sordonova, Ph.D.
S.D. Zhamsaranova, Dr. Sc. Biology, Prof.
D.V. Lygdenov, P.G.
DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF ORGANIC IODINE AND ZINC DERIVATIVES
The development of effective preventive measures and treatment in conditions of natural deficit of essential microelements (iodine, zinc) is extremely relevant.
An attempt of immobilization of zinc and iodine, and the creation of organic forms of microelements is made in the article. Soy protein hydrolyzate was used as an organic carrier. The conditions of enzymatic hydrolysis of soy protein are developed in the paper. Pepsin was used as an enzyme. The conditions for the immobilization of zinc and iodine have been theoretically substantiated and experimentally confirmed. 1 mg of the obtained complex contained 0.08 p.g of iodine and 1.74 mg of zinc. The methods of chemical binding of microelements with functional groups of carriers have been studied. The presence of chemical bonds and the stability of the obtained complexes are investigated. The formation of a covalent bond with zinc and an ionic bond with iodine has been established. The total energy of the complex molecule is a rather small value (6535.689 kcal / mol), the rms gradient is slightly different from zero (0.06 kcal / А x mol), which indicates the balance of the energy properties of the system and the effective minimization of energy. The magnitude of the dipole moment (3.508 Debye) characterizes the uniformity of the electron density distribution. The obtained characteristics confirm reliability of the proposed hypothetical model.
The development of new methods of immobilization and production of organic forms of microelements with a predetermined concentration of deficient trace elements is a priority taskfor the prevention of diseases associated with the lack of trace elements in various regions of the Russian Federation.
Key words: iodine, zinc, soy hydrolyzate, immobilization.
Введение
Эссенциальные микроэлементы - это микроэлементы (йод, цинк, селен, железо и др.), регулярное поступление которых в течение всей жизни с пищей или водой необходимо для нормального функционирования организма. Уровень поступления микроэлементов в организм зависит от их содержания в пищевых продуктах и воде. Снижение или повышение концентрации определенных микроэлементов в рационе человека связано с недостатком или излишком этих микроэлементов в окружающей среде региона проживания. Формирующийся в организме людей дефицит или избыток определенных микроэлементов приводит к эндемическим заболеваниям.
По данным исследователей, дефицит цинка занимает 1-е место в мире по распространенности среди дефицитных состояний и выявляется у 4,5 млрд. чел. По данным Российского общества микроэлементологии (РОСМЭМ), распространенность дефицита цинка в различных регионах России довольно велика. Так, в России частота выявления недостаточности цинка у детей отмечалась от 30 и 48% в Новосибирске и Москве, до 81 и 92% в Челябинске и Саратове соответственно. Одна из причин указанного дефицита цинка - недостаток указанного элемента в рационах питания [1]. Так, по данным РОСМЭМ, дефицит цинка в рационе питания у женщин 25-34 лет в Москве достигал почти 40%, уступая лишь дефициту йода (65%) и селена (56%) [11].
Практически на всей территории Российской Федерации выявлен дефицит йода (различной степени тяжести), вновь зарегистрировано увеличение частоты случаев кретинизма, связанного с внутриутробным дефицитом йода. По данным исследований, проведенных ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава РФ и Международным советом по контролю за йододефицитными заболеваниями, «распространенность эндемического зоба в России составляет от 15 до 40%. Около 17% женщин имеют нарушения, связанные с недостатком йода в их организме, еще до наступления беременности. Хронический дефицит йода, существующий на всей территории России, приводит к драматическим последствиям: развитию умственной и физической отсталости детей, кретинизму, заболеваниям щитовидной железы, бесплодию. В условиях йодного дефицита в сотни раз возрастает и риск радиационно-индуцированных заболеваний щитовидной железы» [3 ].
В настоящее время недостаток микроэлементов в рационе принято компенсировать введением их в неорганической форме в составе сульфатов, карбонатов, хлоридов. Неорганические формы микроэлементов являются в ряде случаев несовместимыми между собой и характеризуются меньшей биодоступностью: свободные ионы металлов, несущие электрический заряд, с трудом всасываются в организме; в присутствии карбонатов образуются плохо растворимые соединения ионов металлов, не усвояемые организмом; все соли микроэлементов, рекомендуемые к применению, гидролизуются с образованием практически нерастворимых гидроксидов, которые выводятся с экскрементами; ионы металлов из минеральных солей выступают катализаторами окисления витаминов, вводимых в премиксы, при котором ценность премиксов снижается [4]. Поэтому в последние годы внимание ученых сосредоточено на комплексных препаратах, полученных путем синтеза микроэлементов с аминокислотами или другими веществами (и так называемыми хелатными соединениями микроэлементов, входящими в группу биокоординационных соединений) [5].
Одним из эффективных путей коррекции микроэлементной недостаточности является использование иммобилизованных форм микроэлементов. Иммобилизованные формы микроэлементов характеризуются лучшей биодоступностью, меньшей токсичностью, более высокой эффективностью [8]. В литературе приведен ряд примеров эффективного использования
органических форм микроэлементов: пищевая добавка йод-актив в профилактике и лечении эндемического зоба [12], йодсодержащая биологически активная добавка на основе пектина при экспериментальном гипотиреозе [9], кормовая добавка «Йоддар-Zn» в молочном козоводстве [2], другие комплексы эссенциальных микроэлементов с ферментативными гидролиза-тами пищевых белков [6].
Цель данного исследования - разработка способа получения иммобилизованных форм цинка и йода с пептидами соевого гидролизата и характеристика полученного комплекса.
Материалы и методы исследования
В работе использовали: ZnSO4*7H20 (ГОСТ 4174-77); KI (ГОСТ 4232-74); протеин соевый (изолят, Китай); пепсин говяжий (ТУ 9219-95000419779-2000, г. Ростов-на-Дону); HCl (ГОСТ 3118-77); Na2CO3 (ГОСТ 5100-85).
Для количественного определения белка использовали биуретовый метод [7]. В качестве стандарта использовали молочный альбумин.
Для количественного определения несвязанного цинка использовалось комплексономет-рическое титрование с индикатором Эриохром черный Т [13].
Для количественного определения связанного йода использовали роданидно-нитритный метод [14].
Для визуализации молекулы, геометрической оптимизации структуры, выявления молекулярных свойств использовали приложение HyperChem v.8. Расчеты проводили с помощью полуэмпирических методов и методов молекулярной динамики [10].
Статистическая обработка результатов рассчитана в MS Office Excel.
Результаты исследования и их обсуждение
С целью увеличения функциональных групп, способных связывать микроэлементы, был получен гидролизат соевого белка.
Авторами получены низкомолекулярные растворимые пептиды соевого белка и определены оптимальные условия ферментации. Способ получения соевого гидролизата включал добавление в 500 мл раствора 0,1 М соляной кислоты 5 г соевого белка, перемешивание и последующую ферментацию при температуре 37-38°С в течение 24 ч с использованием в качестве фермента 250 мг пепсина. Затем полученный раствор нейтрализовали 10%-ным карбонатом натрия до значения рН 6,5-7,5, далее раствор центрифугировали при 2000 оборотах в течение 20 мин для последующего отделения надосадочной жидкости.
Из таблицы следует, что при концентрации соевого белка, равной 0,5 %, концентрация растворимых пептидов в надосадочной жидкости была мала, при концентрациях белка от 2% и выше объем надосадочной жидкости был мал по сравнению с меньшими концентрациями, что было бы нерациональным ввиду повышенных затрат сырья. Поэтому в дальнейших исследованиях было решено использовать низкомолекулярные пептиды соевого гидролизата, образовавшиеся при воздействии пепсина на соевый белок в концентрации, равной 1 %.
Таблица
Оптимизация процесса получения соевого гидролизата
Концентрация соевого белка, % Объем надосадочной жидкости, мл Концентрация растворимых пептидов в надосадочной жидкости, мг/мл
0,5 430 10,35±0,56
1 400 19,47±0,85
2 280 21,750,86
3 200 23,02±0,89
4 100 22,36±0,87
5 50 24,37±0,89
Исследовано связывание цинка с низкомолекулярными пептидами сои. При концентрации ZnSO4 0,05 М и выше происходили агрегация и осаждение пептидов сои. Оптимальной концентрацией ZnSO4 явилась концентрация, равная 0,01 М, содержание связанного цинка при этой концентрации составляло 34,7±3,12 мкг/мл. При пониженных концентрациях содержание связанного цинка значительно падало: при концентрации ZnSO4 0,005 М содержание связанного цинка было равно 11,56±1,1 мкг/мл.
Подобрана оптимальная концентрация йодида калия, взаимодействующего с пептидами сои. Выявлено, что при концентрации 0,0002 М содержание связанного йода наиболее оптимальное. При концентрации менее 2*10-4 М содержание связанного йода слишком мало, а при более высокой концентрации не выявлено значительного увеличения связанного йода.
Исследованы разные схемы связывания солей цинка и йода с низкомолекулярными пептидами сои. При одновременном введении солей цинка и йода происходило взаимодействие солей друг с другом с появлением осадка. При последовательном введении йода, а затем цинка концентрация связанного цинка составляла 2,85 мкг/мл, а при обратном введении солей -34,7 мкг/мл, это обусловлено, по-видимому, тем, что на образование химических связей с цинком необходимо больше энергии. Таким образом, выявлено, что в первую очередь необходимо провести взаимодействие пептидов белка сои с солями цинка, а затем с солями йода.
На рисунке 1 а показано, что иммобилизация цинка с образованием устойчивых связей с пептидами происходит в течение 2 ч, при этом содержание связанного цинка составило 1,74 мг.
ев И
О -
о
5 с
- ы
и а
а
и п о
и
36 34 32 30 28 26 24 22 20
0,5
1,5
2,5
3,5
4,5
Время связывания, ч а
ев
Ч
о «
о -
о
Я
И Ь
о а « §
а
и п о
и
1,6 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
10
20
Время связывания, ч б
Рисунок 1 - Зависимость степени связывания цинка (а) и йода (б) пептидами сои
от времени инкубации
Была изучена зависимость связывания ионов йода с белковым гидролизатом в зависимости от времени инкубации (рис. 1 б). По результатам проведенных исследований выбрана продолжительность выдержки с водным раствором йодида калия - 24 ч при комнатной температуре. При данных параметрах обработки 1 мг гидролизата белка сои связывал 0,08 мкг йода.
Для доказательства образования химических связей между микроэлементами и пептидами соевого белка было проведено моделирование гипотетической модели в компьютерной среде Нурег^ет. Свидетельством корректности пространственной геометрической оптимизации молекулы являются полученные расчетные характеристики компонентов. Суммарная энергия молекулы является достаточно малой величиной (- 6535,689 кса1/то1), среднеквадратичный градиент незначительно отличается от нуля (0,06 кса!/А*моль), что свидетельствует о
0
сбалансированности энергетических свойств системы и об эффективной минимизации энергии. Величина дипольного момента (3,508 Дебая) характеризует равномерность распределения электронной плотности (рис. 2).
Рисунок 2 - Гипотетическая компьютерная модель йод, цинк-связанного комплекса с пептидами сои
Также в компьютерной среде были рассчитаны электронные спектры атома цинка в полученной молекуле. По методологии расчета электронных спектров цинк может находиться в молекуле в свободном и возбужденном состоянии. Рассчитанные электронные спектры молекулы для гипотетической модели показали образование химических связей цинка с белковым гидролизатом сои с ИК-спектром в диапазоне 903,41-1276,02 см-1 (рис. 3). Рассмотрен также электронный спектр для атомов йода, но данный способ моделирования показал огромный диапазон взаимодействия. Поэтому определить локализацию йода аналогичным способом не представлялось возможным.
Рисунок 3 - Электронные спектры молекулы, содержащей связанный Zn
Был проведен ИК-спектроскопический анализ связанных форм цинка и йода с гидролизатом белка сои (рис. 4). Сравнительный анализ исследуемого спектра (нижняя кривая) со спектрами чистого гидролизата (верхняя кривая) показал возникновение химической связи цинка с пептидами гидролизата сои при длине волны 1105 см-1. Данный пик входит в диапазон ИК-спектра гипотетической модели, что доказывает наличие образования химической связи цинка с гидролизатом белка.
3500 3000 2500 2000 1500 1000
Wavenumher em-1
Рисунок 5 - ИК-спектроскопический анализ связанных форм цинка и йода
с гидролизатом белка сои
Изменений, характерных для образования ковалентных связей с йодом на ИК-спектре полученных образцов, не выявлено, что указывает на возможность образования только ионных взаимодействий. Калия йодид имеет кристаллическую ионную решетку, следовательно, при растворении в воде происходит процесс сольватации, ионы отделяются друг от друга и поступают в раствор. В результате калий и йод существуют в растворе в виде К+ и I-. Поэтому при внесении калия йодида в гидролизат сои возможно возникновение ионной связи между протонированными группами NH3+ гидролизата сои и I-.
Выводы
Разработан способ получения органических форм цинка и йода за счет иммобилизации солей цинка и йода на низкомолекулярные пептиды соевого гидролизата. Исследованы способы химического связывания микроэлементов с функциональными группами носителей; показано наличие ковалентной химической связи для цинка и ионной для йода. В 1 мг полученного комплекса содержится 0,08 мкг йода и 1,74 мг цинка.
Библиография
1. Авцын А.П., Жаворонков A.A., Риш М.А. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология. - М.: Медицина, 1991. - C. 496.
2. Горлов И.Ф., Короткова А.А., Мосолова Н.И. Эффективность применения кормовой добавки «Йоддар-Zn» и препарата ДАФС-25 в молочном козоводстве // Вестник Алтайского гос. аграр. ун-та.
- 2013. - № 3. - С. 78-80.
3. Дедов И.И., Герасимов Г.А. Свириденко Н.Ю. Йододефицитные заболевания в Российской Федерации // Вопросы современной педиатрии. - 2004. - Т. 3, № 3. - С. 8-14.
4. Зайналабдиева Х.М., Арсанукаев Д.Л. Алиментация стабилизированных микронутриентов способ оптимизации физиолого-биохимических показателей крови // Материалы конф. «Ветеринарная медицина - теория, практика и обучение». - СПб., 2006. - С. 38-41.
5. Занкевич А.Ю., Анисимов А.И., Козлов В.П. и др. Кормовая добавка для сельскохозяйственных животных и птицы. ЗАО «Белгород, з. лимон, кислоты» (ЗАО «Цитробел») // № 2000121604/13. - 2001.
- № 3.
6. Зорин С.Н. Получение и физико-химическая характеристика комплексов эссеницальных микроэлементов (цинк, медь, марганец, хром) с ферментативными гидролизатами пищевых белков // Микроэлементы в медицин. - 2007. - № 8. - С. 53-55.
7. Журавская Н.К., Алехина Л.Т., Отряшенкова Л.М. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов: учеб. пособие. - М.: Агропромиздат, 1985. - 296 с.
8. Лыгденов Д.В., Сордонова Е.В., Жамсаранова С.Д. Влияние органических форм цинка и йода на соотношение прооксидантных и антиоксидантных систем организма при йодной недостаточности // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2017. - № 4 (7). - С. 36-43.
9. Мамцев А.Н., Бондарева И.А., Камилов Ф.Х. и др. Оценка физиологической активности йодсо-держащей БАД на основе пектина при экспериментальном гипотиреозе // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2005. - № 12. - С. 81-84.
10. Полещук О.Х., Кижнер Д.М. Методические указания к лабораторным работам по компьютерному моделированию химических реакций. - Томск: Изд-во ТГПУ, 2006. - С. 146.
11. Скальный А.В. Микроэлементы для вашего здоровья. - М.: Мир, 2004. - С. 238.
12. Цыб А.Ф., Белякова Н.А., Дианов О.А. и др. Эффективность органической формы йода в профилактике и лечении эндемического эутиреоидного зоба // Педиатрия. - 2005. - С. 63-65.
13. ГОСТ 10398-76 Комплексонометрический метод определения содержания основного вещества. - М., 1977.
14. ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе. - М., 1988.
Bibliography
1. Avtsyn A.P., Zhavoronkov A.A., Rish M.A. Microelementosis of a man: etiology, classification, organopathology. - M.: Medicine, 1991. - P. 496.
2. Gorlov I.F., Korotkova A.A., Mosolova N.I. The efficiency of use of fodder additive "Yoddar-Zn" and preparation DAFS-25 in dairy goat farming // Bulletin of the Altai State Agrarian University. - 2013. - N 3. - P. 78-80.
3. Dedov I.I., Gerasimov G.A. Sviridenko N. Yu. Iodine deficiency disorders in the Russian Federation // Voprosy sovremennoi pediatrii. - 2004. - Vol. 3, N 3. - P. 8-14.
4. Zainalabdieva Kh.M., Arsanukaev D.L. Almentation of stabilized micronutrients is the way of optimization of physiological and biochemical parameters of blood // Materials of the conference "Veterinary medicine-theory, practice and training ». - SPb., 2006. - P. 38-41.
5. Zankevich A.Yu., Anisimov A.I., Kozlov V.P. et al. Feed additive for farm animals and poultry. ZAO Belgorod, f. lemon acid » (ZAO Citrobel) // № 2000121604/13. - 2001. - N 3.
6. Zorin S.N. Obtaining and physico-chemical characteristics of complexes of essencial trace elements (zinc, copper, manganese, chromium) with enzymatic hydrolysates of food proteins // Trace elements in medicine. - 2007. - N 8. - P. 53-55.
7. ZhuravskayaN.K., AlekhinaL.T., OtryashenkovaL.M. Research and quality control of meat and meat products // Study guide. - M.: Agropromizdat, 1985. - 296 p.
8. Lygdenov D.V., Sordonova E.V., Zhamsaranova S.D. Effect of organic forms of zinc and iodine on the ratio of prooxidant and antioxidant systems of the body with iodine deficiency // Izvestiya vuzov. Applied chemistry and biotechnology. - 2017. - N 4 (7). - P. 36-43.
9. Mamtsev A.N., Bondareva I.A., Kamilov F.Kh. et al. Evaluation of the physiological activity of iodine-containing dietary supplements based on pectin in experimental hypothyroidism // Bulletin of the Orenburg State University. - 2005. - N 12. - P. 81-84.
10. Poleschuk O.Kh., Kizhner D.M. Laboratory operations manual on computer modeling of chemical reactions. - Tomsk: TGPU, 2006. - P. 146.
11. SkalnyA.V. Microelements for your health. - M.: Mir, 2004. - P. 238.
12. Tsyb A.F., BelyakovaN.A., Dianov O.A. Effectiveness ofthe organic form of iodine in the prevention and treatment of endemic euthyroid goiter // Pediatrics. Journal after G.N. Speransky. - 2005. - P. 63-65.
13. GOST 10398-76 Complexometric method for determining the content of the main substance. - M.,
1977.
14. GOST 4517-87 Reagents. Methods of preparation of auxiliary reagents and solutions used in the analysis. - M., 1988.
