CC BY
38
УДК 615.461:616.12-089.843
В. С. Толстоухов, Д. В. Никишин
РАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДА ДЕЦЕЛЛЮЛЯЦИИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАТОВ БЕЗ ПРИМЕНЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ
Аннотация. Рассматривается одна из наиболее актуальных проблем, возникающих при производстве биологических имплантов животного происхождения. Основной проблемой на этапе разработки подобного рода продуктов является децеллюляция, а именно удаление из тканей животных клеток и остатков клеточных элементов. По методикам, существующим на данный момент, сырье подвергается воздействию ферментов. Показано, что данные реактивы достаточно агрессивны по отношению не только к клеткам, но и к соединительной ткани материала, что существенно снижает его дальнейшие показатели. Мы предлагаем к рассмотрению инновационный протокол обработки, предусматривающий децеллюля-цию при помощи физико-химического воздействия, без использования ферментов, которая способна стать достойной альтернативой методам обработки, используемым сегодня.
Ключевые слова: ксеноматериалы, децеллюляция, протокол обработки, биологические импланты, ферменты, клетки, клеточные элементы.
В настоящее время как в России, так и за рубежом проводится колоссальное количество операций с использованием материалов, восполняющих или замещающих собственные ткани организма. Большое внимание в этой сфере уделяется материалам, изготавливаемым из сырья животного происхождения, или ксеноматериалам [1—3]. Связано это главным образом с тем, что данные импланты обладают высокой степенью сродства с органами и тканями человека, и при этом крайне доступны.
Одним из видов ксенотрансплантатов являются пластины на основе коллагеновых волокон биологического происхождения, которые представляют собой фрагмент ткани животного толщиной до 2 мм и состоят главным образом из соединительнотканного белка коллагена. Сырьем для изготовления подобных пластин могут служить такие ткани, как перикард крупного рогатого скота, твердая мозговая оболочка, надкостница, подсли-зистая основа тонкой кишки свиньи, дерма, брюшина или же иной биологический материал [1, 4, 5].
Подобные импланты могут выполнять функции барьерных мембран, служащих главным образом для закрытия костных дефектов у человека и способствующих ускорению процессов костной регенерации, оберегая при этом область дефекта от прорастания слизистой оболочки и мягких тканей и тем самым максимально сохраняя объем кости. Одной из немаловажных функций барьерных мембран к тому же является способность противостоять воспалительным процессам и отграничивать область дефекта от очага воспаления, например, при закрытии свищевых ходов малого диаметра.
Также пластины на основе коллагена животного происхождения могут использоваться в качестве заплат для закрытия дефектов различного рода тканей и органов, как паренхиматозных, так и полых. При имплантации зубов они могут быть использованы при синус-лифтинге; в торакальной хирургии - при устранении дефектов плевры; в абдоминальной хирургии - при закрытии дефектов передней брюшной стенки; в офтальмологии в качестве склероукрепляющего материала; в ЛОР-хирургии - при пластике барабанной перепонки; в нейрохирургии - при закрытии дефектов твердой мозговой оболочки. Особое место подобные материалы, в особенности ксеноперикард, занимают в
сердечно-сосудистои хирургии, где используются для создания искусственных клапанов сердца и биологических протезов сосудов малого диаметра.
Области применения имплантов на основе соединительной ткани животных достаточно широки уже на данном этапе их развития [4, 6, 7]. И, соответственно, учитывая важность выполняемых ими функций, предъявляются высокие требования к качеству данных материалов. Ксеноматериалы не должны вызывать реакций отторжения, провоцировать реакций воспаления, кальцификации, должны иметь низкие антигенные свойства и высокую степень биосовместимости с органами и тканями реципиента.
Именно для достижения этих целей и выполняется обработка биологического сырья, являющаяся основным фактором, влияющим на качество продукта. Под обработкой в первую очередь подразумевается децеллюляция и стерилизация образцов, а также сшивка материала глутаровым альдегидом и консервация. Стоит отметить, что недостаточная или проведенная не должным образом обработка и стерилизация образцов могут привести, помимо отторжения материала, к серьезным осложнениям для самого пациента, таким, как образование гнойно-воспалительных процессов, флегмон и абсцессов, некрозов, рубцовой ткани, инкапсуляций, а также стать причиной новообразований.
На снимке (рис. 1,а) представлена имплантированная пластина ксеноматериала. Данный материал не подвергался стерилизации и как результат наблюдается выраженный воспалительный процесс в области имплантации и образование абсцесса. На микрофотографии (рис. 1,6) виден процесс отторжения материала, наличие грануляционного вала и воспалительного инфильтрата в прилежащих тканях.
а)
6)
Рис. 1. Фрагмент ксеноматериала не коллагеновой природы из передней стенки брюшной полости крыс, срок имплантации 14 суток: а - макроскопическая картина; 6 - фотография микропрепарата. Окраска гематоксилином и эозином, хюо
Применение практически любой методики обработки ксеноматериалов преследует цель полного удаления из ткани клеточных элементов, водорастворимых белков и концевых теллопептидов коллагена как основных антигенов. При этом важно сохранить коллагеновые волокна, не нарушая их тинкториальных свойств.
Основой любой обработки является децеллюляция. Процесс децеллюляции подразумевает полное удаление из интересующей нас ткани клеток и их фрагментов, которые в большинстве своем являются основными антигенными факторами, приводящими к нежелательным осложнениям после имплантации.
На сегодняшний день существует множество патентов, описывающих подобные методики. Но все они в большинстве своем являются продолжением или вариацией одной и той же техники с использованием химико-ферментативного метода.
В 1988 г. был впервые описан способ подготовки биоткани для ксенопротезирова-ния путем ферментативной обработки террилитином в фосфатном буферном растворе в течение четырех часов при 43 °С, последовательной отмывки в кислотном растворе, в 1 М растворе гидрокарбоната натрия и растворах хлорида натрия, выдержки в многократно заменяемом растворе глутарового альдегида в буферном растворе с возрастающей концентрацией и стерилизации (Авт. св. СССР 1398855, МКИ 6 А 61 Б 2/24, 1988). Недостатком данного способа, как и большинства его модернизаций, является высокая концентрация фермента, вызывающая разрушение коллагеново-эластической основы биоткани, образование кавитаций и нарушение физико-механических свойств трансплантата.
Еще одним не менее важным этапом обработки является сшивка, которая в подавляющем большинстве случаев подразумевает использование глутарового альдегида, который широко применяется в качестве реактива для подготовки биопротезов. ГА-сшивки в коллагеновых тканях значительно снижают скорость биорезорбции материала, что делает его биосовместимым и нетромбогенным при сохранении анатомической целостности. Но при этом создание биорезорбируемых материалов, интерес к которым в настоящее время стремительно растет, не является возможным. К тому же стоит упомянуть, что при всех положительных свойствах глутарового альдегида он обладает высокой долей токсичности, и всегда сохраняется риск того, что данный реагент будет не до конца удален из изготавливаемого импланта, что в свою очередь вновь приведет к осложнениям. Наряду с этим, при применении данного вещества возможность образования кальцина-тов в трансплантате существенно возрастает, а также снижается эластичность материала, что уменьшает срок службы трансплантатов и эффективность их действия.
Таким образом, существующие методы обработки не являются полностью корректными и имеют ряд существенных недостатков, отражающихся главным образом на жизни и здоровье отдельно взятых пациентов. В связи с чем проблема поиска новых способов обработки биологического сырья остается открытой. К тому же стоит отметить, что данная проблематика относится к категории узкоспециализированных, и не так много научных деятелей занимается подобными вопросами.
На кафедре анатомии человека Пензенского государственного университета помимо поиска альтернативных видов ксенотрансплантатов проводится изучение и создание методов их обработки. Первоочередной задачей при рассмотрении данного вопроса стала необходимость найти способ, позволяющий отказаться от ферментативной обработки и прервать более чем 30-летнюю историю использования данного метода, который, по нашему мнению, устарел и уже долгое время не совершенствовался, а также исключить воздействие на материал глутарового альдегида.
Разрабатываемый способ основан на электромагнитном воздействии на клетки, которое приводит сначала к деполяризации мембран, уменьшению их сопротивления и устойчивости, а затем и к разрушению клеточной стенки. При этом одновременно совершается смывка высвобождающихся из клеток их собственных лизирующих ферментов, способных оказать губительное воздействие на соединительнотканные волокна и привести к образованию кавитаций. Смывка осуществляется за счет того, что материал погружается в солевые растворы разной концентрации, которые часто меняются. Данный комплексный метод не предусматривает сшивку глутаровым альдегидом, поскольку нашей целью является не только снизить риск развития возможных осложнений, но и сохранить способность к биорезорбции у полученного в результате обработки материала. Методика была уже неоднократно апробирована, получены первые положительные результаты.
Для исследования эффективности обработки был взят нативный телячий перикард как наиболее часто используемый материал в данной сфере. На гистологическом снимке представлена контрольная группа образцов, то есть необработанный материал (рис. 2).
Рис. 2. Нативный ксеноперикард. Окраска гематоксилином и эозином, х200
После применения вышеописанного метода обработки в течении 60 мин нами были отмечены следующие изменения (рис. 3,а). Количество клеточных элементов в одном поле зрения снизилось более чем на 80 % (в отличие от нативного образца), в некоторых участках клеточные элементы отсутствуют вовсе. Объясняется этот факт неравномерной толщиной пластины на всей ее протяженности и компенсируется увеличением времени воздействия в зависимости от необходимости и особенностей сырья.
При увеличении времени обработки до 80 мин отмечалось практически полное удаление клеточных элементов (98-100 %) из материала (рис. 3,6). При этом после применения предлагаемого вида обработки не обнаруживалось образование кавитаций, раз-волокнения или повреждения соединительнотканных структур.
а)
б)
Рис. 3. Ксеноперикард. Окраска гематоксилином и эозином, х200: а - время обработки 60 мин; б - время обработки 80 мин
Также стоит отметить, что данный метод обработки применим ко всем похожим материалам. Для примера представлен вариант обработки пластины на основе соединительной ткани рыб, являющейся одной из наших разработок, где также наблюдается отсутствие клеточных элементов после воздействия на материал при сохранении структуры коллагеновых волокон (рис. 4).
а)
б)
Рис. 4. Коллаген рыб. Окраска гематоксилином и эозином, х200: а - нативный образец; б - время обработки 80 мин
Была проведена серия лабораторных исследований на экспериментальных животных с целью определения поведения обработанного материала в живом организме. Животные выводились из эксперимента на 14 сутки. Макроскопически не наблюдалось отторжения, выраженного воспалительного процесса, также не отмечалось некроза или образования грубой рубцовой ткани, материал плотно окружен собственной соединительной тканью (рис. 5).
Рис. 5. Ксеноперикард, имплантированный под кожу передней брюшной стенки лабораторного животного. Срок имплантации две недели
При микроскопическом исследовании было выявлено, что уже на второй неделе имплантации наблюдаются начальные стадии биоинтеграции, т.е. волокна собственной
соединительной ткани прорастают между коллагеновыми волокнами импланта (рис. 6,а). Отмечается активное новообразование кровеносных сосудов в области имплантации (рис. 6,6); это свидетельствует о том, что материал не воспринимается как чужеродный. Также наблюдаются начальные стадии деградации соединительнотканных волокон материала, что даже на данном этапе дает все предпосылки рассматривать обработанный материал как биодеградируемый.
а)
б)
Рис. 6. Ксеноперикард, срок имплантации 14 суток. Окраска гематоксилином и эозином, х200: а - биоинтеграция в ксенотранстплантат; 6 - активный неоангиогенез
Таким образом, на основании полученных результатов гистологических исследований, а также проведенного эксперимента, мы можем сделать вывод о состоятельности и эффективности метода обработки ксеноматериалов. Дальнейшая работа будет направлена на корректировку и совершенствование предлагаемого протокола обработки. Ведь именно изучение свойств и разработка новых методик по производству и применению ксеноматериалов может помочь развитию многих направлений медицины.
Список литературы
1. Морфология тканей при использовании протезов из полипропилена и политетрафолена / С. В. Иванов, И. С. Иванов, А. А. Должников, А. А. Мартынцев, А. В. Цуканов, Р. А. Мамедов // Анналы хирургии. - 2009. - № 3. - С. 59-64.
2. Каплунов, О. Ф. К истории оперативного восстановления крестообразных связок коленного сустава / О. Ф. Каплунов // Травматология и ортопедия в России. - 2007. - № 1. - С. 74.
3. Сетчатые импланты из половинилиденфторида в лечении грыж брюшной стенки / В. М. Седов, А. А. Гостевской, С. Д. Тарбаев, А. С. Горелов, А. Б. Чулховин, Г. М. Нутфуллина, В. А. Жуковский // Вестник хирургии. - 2008. - № 2. - С. 16-21.
4. Сравнительный анализ использования аутотрансплантата из связки надколенника и учетверенного сухожильного трансплантата m. semitendinosus и m. gracilis для пластики ПКС / Д. С. Афанасьев, А. В. Скороглядов, С. С. Копенкин, А. Б. Бут-Гусаим, А. В. Зинченко, В. Ю. Ро-заев // VIII Конгресс Российского артроскопического общества : программа и тезисы // под ред. акад. РАН и РАМН С. П. Миронова. - СПб. : Человек и его здоровье, 2009. - 104 с.
5. Егиев, В. Н. Сравнительная оценка степени фиксации фибробластов на синтетических эндо-протезах, используемых для пластики дефектов передней брюшной стенки / В. Н. Егиев // Герниология. - 2006. - № 2. - С. 37-41.
6. Ланина, С. Я. Методологические и методические вопросы гигиены и токсикологии полимерных материалов и изделий медицинского назначения. Научный обзор / С. Я. Ланина. - М., 1982. - С. 61-86.
7. Севастьянов, В. И. Биоматериалы, системы доставки лекарственных веществ и биоинженерия / В. И. Севастьянов // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2009. - Т. XI, № 3. - С. 69-80.
Толстоухов Владислав Сергеевич
студент,
Пензенский государственный университет E-mail: tolstoukhovvs@gmail.com
Никишин Дмитрий Викторович
кандидат медицинских наук, доцент, кафедра анатомии человека, Пензенский государственный университет E-mail: nikishindv@gmail.com
Tolstoukhov Vladislav Sergeevich
student,
Penza State University
Nikishin Dmitriy Viktorovich
candidate of medical sciences, associate professor, sub-department of human anatomy, Penza State University
УДК 615.461:616.12-089.843 Толстоухов, В. С.
Разработка и экспериментальное исследование метода децеллюляции ксенотрансплантатов без применения ферментов / В. С. Толстоухов, Д. В. Никишин // Вестник Пензенского государственного университета. - 2016. - № 2 (14). - С. 67-73.
