CC BY
119
Получена: 4 сентября 2016 / Принята: 11 октября 2016 / Опубликована online: 31 октября 2016 УДК 616.12
РАЗРАБОТКА HALOPLEX ПАНЕЛИ И ПОДГОТОВКА ДНК-БИБЛИОТЕК ДЛЯ ТАРГЕТНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ
СЕРДЕЧНЫХ АРИТМИЙ
Айнур Ж. Ахметова1, Жаннур М. Абилова1,
Махаббат С. Бекбосынова2, Katrin Panzitt3,
Slave Trajanoski3, Christian Guelly3, Айнур Р. Акильжанова1
1 National Laboratory Astana, Назарбаев Университет, г. Астана, Казахстан;
2 Национальный научный кардиохирургический центр, г. Астана, Казахстан;
3 Центр медицинских исследований, Медицинский университет г. Грац, г. Грац, Австрия.
Резюме
В данной статье подробно описана методика создания пользовательской HaloPlex кардиогенетической панели (Agilent Technologies) и метод подготовки ДНК-библиотек для таргетного секвенирования 96 генов ассоциированных с сердечными аритмиями. Онлайн программа SureDesign Online Design software (Agilent Technologies) была использована для создания HaloPlex кардиогенетической панели. Финальный дизайн панели был создан для платформы Illumina c помощью Human Genome version 19, GRCh 37. Программой было разработано 19958 ампликонов, 99,46% всех таргетных регионов были покрыты удачно. С использованием данной кардиогенетической панели были подготовлены ДНК-библиотеки для 48 образцов.
Ключевые слова: HaloPlex кардиогенетическая панель, таргетное секвенирование, сердечные аритмии.
Abstract
DEVELOPMENT OF HALOPLEX PANEL AND PREPARATION OF DNA LIBRARIES FOR TARGETED SEQUENCING OF CARDIAC ARRHYTHMIAS
Ainur Akhmetova1, Zhannur Abilova1, Makhabbat Bekbosynova2, Katrin Panzitt3, Slave Trajanoski3, Christian Guelly3, Ainur Akilzhanova1
1 National Laboratory Astana, Nazarbayev University, Astana, Kazakhstan;
2 National Research Cardiac Surgery Center, Astana, Kazakhstan;
3 Center for Medical Research, Medical University of Graz, Graz, Austria
Method of preparation of custom HaloPlex cardiogenetic panel (Agilent Technologies) and method of preparation of dNa libraries for targeted sequencing of 96 genes associated with cardiac arrhythmias were described in details in this article. SureDesign Online Design software (Agilent Technologies) was used to create the HaloPlex panel. Final design was developed for Illumina platform using Human Genome version 19, GRCh 37. 19958 amplicons were generated by the program, 99,46% of all target regions were covered successfully. DNA libraries were prepared for 48 samples using the custom HaloPlex cardiogenetic panel.
Keywords: HaloPlex cardiogenetic panel, targeted sequencing, cardiac arrhythmias.
Работа выполнена в рамках проекта ««Интеграционный геномный и метаболомный анализ кардиометаболических нарушений в казахской популяции»» по бюджетной программе МОН РК 3907/ГФ4 «Грантовое финансирование научных исследований» на 2015-2017 гг.
43
ty^h
HALOPLEX ПАНЕЛ1Н ЭЗ1РЛЕУ ЖЭНЕ ЖУРЕК АРИТМИЯЛАРЫН ТАРГЕТТ1 СЕКВЕНИРЛЕУГЕ ДНК-К1ТАПХАНАЛАРЫН ДАЙЫНДАУ
Айнур Ж. Ахметова 1, Жаннур М. Абилова 1,
Махаббат С. Бекбосынова 2, Katrin Panzitt3, Slave Trajanoski 3,
Christian Guelly 3, Айнур Р. Акильжанова 1
1 National Laboratory Astana, Назарбаев Университет^ Астана, Казакстан;
2 ¥лттык гылыми кардиохирургия орталыгы, Астана, Казахстан;
3 Медициналык зерттеулер орталыгы, Грац каласынын Медициналык университету Грац, Австрия
Мак;алада жYрек аритмияларымен ассоциацияланган 96 гендi TapreTTi секвенирлеуге арналган HaloPlex пайдаланушы кардиогенетикалык; панелш (Agilent Technologies) эзipлeу эдiстeмeсi жэне ДН^-ютапханаларын дайындау эдiсi толы^тай сипатталган. HaloPlex кардиогенетикалык; naнeлiн дайындауда SureDesign Online Design software (Agilent Technologies) онлайн багдарламасы крлданылды. Панель дизайн Human Genome version 19, GRCh 37 квмeгiмeн Illumina платформасына арнап дайындалды. Багдарламамен 19958 ампликон эзipлeндi, барлык; тapгeттi айма^тардыц 99,46% сэтт Yлeстipiлдi. Аталган кардиогенетикалык; панель квмепмен 48 Yлгiгe ДН^-ютапханалары дайындалды.
ty^h свздер: HaloPlex кардиогенетикалык; пaнeлi, таргетт секвенирлеу, жYpeк аритмиялары.
Библиографическая ссылка:
Ахметова А.Ж., Абилова Ж.М., Бекбосынова М.С., Panzitt K., Trajanoski S., Guelly C., Акильжанова А.Р. Разработка HaloPlex панели и подготовка ДНК-библиотек для таргетного секвенирования сердечных аритмий / / Наука и Здравоохранение. 2016. №5. С. 43-52.
Akhmetova A., Abilova Zh., Bekbosynova M., Panzitt K., Trajanoski S., Guelly C., Akilzhanova A. Development of HaloPlex panel and preparation of DNA libraries for targeted sequencing of cardiac arrhythmias. Nauka i Zdravookhranenie [Science & Healthcare]. 2016, 5, pp. 43-52.
Ахметова А.Ж., Абилова Ж.М., Бекбосынова М.С., Panzitt K., Trajanoski S., Guelly C., Акильжанова А.Р. HaloPlex панелЫ эзiрлеу жэне жYрек аритмияларын таргетп секвенирлеуге ДНК;-ютапханаларын дайындау / / Гылым жэне Денсаулык сактау. 2016. №5. Б. 43-52.
Введение
Внезапная сердечная смерть (ВСС) является одной из наиболее острых нерешенных проблем современной кардиологии. В промышленно развитых странах частота случаев ВСС принимает угрожающие размеры. Она ежегодно уносит из жизни множество активных, трудоспособных людей, причем около 20% умерших от ВСС не имеют явного кардиологического заболевания [4, 5, 7, 10]. ВСС наступает в течение от нескольких минут до 24 часов с момента первого появления симптомов и происходит в результате остановки сердечной деятельности
на фоне внезапной асистолии или фибрилляции желудочков у людей, находящихся до этого в физиологически и психологически стабильном состоянии. Отсутствие выраженных симптомов болезни перед смертью не является показателем того, что данные лица были здоровы.
Причины внезапной сердечной смерти различаются в зависимости от возраста пациента. ВСС у детей представлена: I) синдромом внезапной смерти детей младенцев (СВСМ); II) ВСС у детей с известными сердечными заболеваниями (жизнеугрожающие нарушения ритма сердца,
кардиомиопатии, врожденные пороки сердца, первичная легочная гипертензия, аритмогенная дисплазия правого желудочка и др); III) ВСС у считающихся здоровыми детей, когда жизнеугрожающее состояние является первым симптомом болезни. [4] Аритмиям принадлежит ведущая роль в патофизиологии ВСС.
Механизмами, лежащими в основе развития внезапной сердечной смерти, в подавляющем большинстве случаев являются желудочковая тахикардия (ЖТ) и фибрилляция желудочков (ФЖ) - 95%, а оставшиеся 5% приходятся на долю брадиаритмий и асистолии [2, 3, 6, 8, 13]. Желудочковые аритмии часто встречаются в молодом возрасте при структурно неизмененном сердце [9, 11, 14, 15], и у пожилых людей, и их частота возрастает при наличии структурного заболевания сердца, встречаясь у 70-80% людей старше 60 лет [1].
Несмотря на наличие большого количества современных инструментальных методов оценки функционального состояния сердечнососудистой системы, их не пользование для оценки риска внезапной смерти не всегда является информативным и, в сочетании со значительной стоимостью, ограничивает возможности массового применения. В связи с этим, актуальным является поиск биологических маркеров предрасположенности к внезапной смерти и, прежде всего генетических, позволяющих выявлять повышенный риск смертельного исхода задолго до его наступления и соответственно предпринять необходимые лечебно-профилактические мероприятия для его предупреждения. Одним из наиболее эффективных подходов к выявлению генетической компоненты мультифакторналь-ных заболеваний является изучение ассоциаций с полиморфизмами генов-кандидатов [12].
Размер полного генома человека составляет 3 200 000 000 пар оснований (3,2 млрд. пар оснований / Гб), ~ 1 % генома кодирует экзом (белок - кодирующие гены), что составляет около 30000 генов. 1-15 генов, как правило, достаточно для рутинного диагностического тестирования для покрытия
> 65% случаев всех случаев аритмий. Секвенирование нового поколения (NGS) произвело революцию в области генетики, позволяя лабораториям определить вариации последовательности геномов быстро и экономически эффективно. Для того, чтобы использовать мощности секвенирования следующего поколения для определения генетических аномалий, связанных с конкретными болезненными состояниями, очень важно выбрать целевые конкретные области генома.
Agilent HaloPlex панели - конструкции, которые сосредоточены на целевых наборах генов для конкретных приложений. В настоящее время Agilent предлагает две HaloPlex кардиогенетической панели -HaloPlex кардиомиопатия (HaloPlex Cardiomyopathy) HaloPlex аритмия (HaloPlex Arrhythmia). Панели HaloPlex кардиомиопатия и HaloPlex аритмия являются панелями генов для целевого обогащения таргетных последовательностей для последующего секвенирования на платформах NGS, разработанные специально для наследственных форм кардиомиопатии и аритмии [16]. После тщательного анализа публикаций по кардиомиопатиям, а также информации, полученной от GeneReviews в NIH интернет-ресурсе, 34 гена, связанных с гипертрофической кардиомиопатией,
дилатационной кардиомиопатией, и аритмогенной кардиомиопатии правого желудочка были включены в данную панель. Панель Аритмия включает 21 ген, коррелирующих с синдромами удлиненного интервала QT, короткого интервала QT, синдрома Бругада и катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии. Есть существенное совпадение некоторых генов, связанных с различными типами кардиомиопатий, аритмий. Панели дают возможность просеквенировать все гены одновременно для клинических образцов в одном экономически эффективном запуске платформы NGS. Но, эти панели исследования не учитывают все гены, которые могут привести к нарушениям ритма сердца.
Нашей целью было разработать новую кардиогенетическую панель секвенирования
на основе изучения генов-кандидатов с помощью технологии Haloplex (Agilent Technologies) для диагностики и исследований сердечных аритмий, включающую 96 генов. Методы
1. Дизайн HaloPlex кардиогенетической панели
Онлайн программа SureDesign Online design software (Agilent Technologies) была
Сердечные гены и аритмогенные синдромы.
использована для создания пользовательской HaloPlex кардиопанели для Таргетного секвенирования 96 генов ассоциированных с сердечными аритмиями с использованием метода Таргетного обогащения. Список аритмогенных синдромов и генов ассоциированных с развитием сердечных аритмий показан в Таблице 1.
Таблица 1.
Аритмогенные синдромы Гены
Синдром удлиненного QT KCNQ1, KCNH2, SCN5A, KCNE1, KCNE2, ANK2, KCNJ2, CACNAIc, Cav3, SCN4b, AKAP9, KCNJ5, SNTA1
Синдром укороченного QT KCNQ1, KCNH2, KCNJ2
Синдром Бругада (Brugada - BrS) SCN5A, CACNB2, GPD1L, SCNIb, KCNE3, SCN3b, CACNAIc, MOG1, KCNE5, KCND3, HCN4
KCNA5, KCNE2, KCNQ1, NPPA, NUP155, LMNA, SCN5A, KCNJ8, ABCC9, GJA5, KCNJ2
Идиопатическая желудочковая тахикардия RyR2, CASQ2, KCNJ2
Катехолзависимая полиморфная желудочковая тахикардия -Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia (CPVT) PKP2, DSG2, DSC2, DSP, JUP, TMEM43, TGFB3, RyR2
Аритмогенная правожелудочковая кардиомиопатия (Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy -ARVC) LMNA, LDB3, TNNT2, PLN, MYH7, MYBPC3, SCN5A, DES, SGCD, CSRP3, TCAP, ACTC, TNNC1, TNNI3, TTR, ILK, EMD, CRYAB, BAG3, CHRM2, SGCB, DSP, TPM1, NEBL, DSG2, TTN, EYA4, ABCC9, TMPO, PSEN1, PSEN2, ACTN2, TAZ, VCL, ANKRD1, FKTN, LAMP2, NEXN, TBX20, DTNA, MYPN, LAMA4, FHL2, LAMA2, DMD, RBM20, SERCA2A, MYH6
До создания дизайна панели новый аккаунт был зарегистрирован на веб-странице Agilent SureDesign
https://earray.chem.agilent.com/suredesign/. Advanced wizard option был использован для разработки дизайна из multiple probe groups. В нашем случае нужно было включить в нашу HaloPlex кардиопанель три probe group. Две probe group уже были в составе двух предварительно разработанных панелях Agilent Technologies - HaloPlex Кардиомиопатия (HaloPlex Cardiomyopathy) и HaloPlex Аритмия (HaloPlex Arrhythmia). Данные панели включали в себя 34 и 21 ген отвечающих за наследуемые формы кардиомиопатии и аритмии, соответственно. Третья probe group, которая должна содержать в себе 41 генов ассоциированных с
различными аритмогенными синдромами на основе литературного обзора должна была сконструирована нами. Следующие шаги были выполнены для того, чтобы объединить все три probe group и разработать одну кардиопанель, которая состоит из 96 генов:
ШАГ 1. Создание первого дизайна с одной probe group, который включает в себя 41 генов. Дизайн (под названием 'CP_241012_opt') с одной probe group, который имеет 41 генов ассоциированных с сердечными аритмиями был произведен путем выбора соответствующей платформы секвенирования (Illumina) и длины рида (150 п.о). Все таргеты были вписаны в онлайн программу с использованием символов генов. Далее, выбрали всю базу данных аннотаций. Зонды или ампликоны были разработаны для
экзомов. Таким образом, когда регионы (экзомы) были определены онлайн программой, программа автоматически создала зонды или ампликоны, которые максимально покрывают данные регионы. Количество регионов (экзомов), покрытие и геномные позиции были просмотрены в Target Summary. Все наши таргетные регионы также были проверены при помощи UCSC Genome Browser. Новый probe group был назван как 'Probe group 1'. Таким образом, наш первый дизайн 'CP_241012_opt' с одной probe group 'Probe group 1', который состоит из 41 генов был создан.
Далее, скачали дизайн 'CP_241012_opt' из веб-страницы SureDesign. Скаченная папка состояла из общего отчета по дизайну в PDF и текстовых файлах, файла с таргетами. Также имелись 4 так называемых BED файла, где была показана информация по регионам или экзонам (какие регионы были определены программой), ампликонам (какие ампликоны были созданы для покрытия регионов), покрытым регионам (какие регионы были покрыты, не все регионы всегда покрываются так как существует ограничение по числу ампликонов, создаваемых Agilent Sure Design) и по всем отчетам. Таким образом, информация содержащая в 'CP_241012_opt' дизайне была оценена отдельно от программы с использованием UCSC Genome Browser для того, чтобы удостовериться, что зонды разработанные в дизайне подходят для наших экспериментов.
ШАГ 2. Создание второго дизайна, который состоит из 55 генов путем объединения двух probe group из двух существующих панелей Agilent Technologies. Второй дизайн (под названием 'ZMF96cardio_1') с одной probe group, который имел 55 генов был подготовлен путем объединения двух probe group с использованием двух существующих панелей компании Agilent Technologies. В первую очередь, с помощью Advanced wizard option зонды были выбраны из probe group панели HaloPlex Кардиомиопатия (HaloPlex Cardiomyopathy), которая включает в себя 34 гена, затем выбраны из дизайна HaloPlex Аритмия (HaloPlex Arrhythmia), который
состоит из 21 гена. Новый разработанный probe group был назван 'Probe group 2'. В дальнейшем, дизайн 'ZMF96cardio_1' был скачен из веб-страницы онлайн программы. Оценка всей необходимой информации в Отчете дизайна была проведена тщательно таким же образом, как описано в Шаге 1. В итоге, наш второй дизайн 'ZMF96cardio_1' с одной (смешанной) probe group 'Probe group 2', который состоит из 55 генов был конструирован.
ШАГ 3. Создание окончательного (финального) дизайна, который состоит из 96 генов. После того как две probe group 'Probe group 1' и 'Probe group 2', которые имеют 41 кардио генов и 55 кардио генов были разработаны, новый скомбинированный дизайн, который содержит в себе 96 кардио генов был подготовлен с помощью Advanced Wizard option для разработки дизайна из нескольких probe group. Таким образом, три probe group были смешаны из разных дизайнов для создания объединенного дизайна под названием 'ZMF96cardio', который имеет 96 кардио генов ассоциированных с сердечными аритмиями.
2. Подготовка библиотек генов-кандидатов с использованием HaloPlex кардиопанели
Библиотеки генов-кандидатов были подготовлены с помощью набора HaloPlex Custom Panel Tier 1 kit, Agilent Technologies (ILMFST, p/h G9901C) согласно протоколу производителя «HaloPlex Target Enrichment System for Illumina Sequencing» (версия D.3., декабрь 2012) для 48 ДНК образцов: 23 пациента с атриовентрикулярной блокадой (14 женщин и 9 мужчин) и 25 пациентов с синдромом слабости синусового узла (14 женщин и 11 мужчин).
Протокол исследования, информированное согласие и все виды рекрутинга были рассмотрены на Локальном этическом комитете «Центра наук о жизни» (выписка из протокола №16 от 11.03.2015г. заседания Этической комиссии ЧУ «Центра наук о жизни», АОО «Назарбаев Университет»). Форма информированного согласия была прочитана и подписана каждым пациентом.
HaloPlex протокол оптимизирован для усвоения 225 ng геномной ДНК. В качестве контроля использовали обогащенную контрольную ДНК (Enrichment Control DNA, ECD), поставляемую вместе с набором. Количественный и качественный анализ всех 48 ДНК образцов был проведен с помощью флуориметра Qubit 2.0 и 2% агарозного геля, соответственно.
Протокол состоит из 10 этапов. Процедура обогащения образцов ДНК была проведена в зоне пре-амплификации, в то время как дальнейшие эксперименты с амплифици-рованными, обогащенными образцами ДНК были выполнены в пост-амплификационной рабочей зоне.
IM IM гм IM IM (M IM гм §
-3 * ей Ü ч—< s ш iL <3 X
_i § § s g § g g s с э
70 СЮ--
2000 — -
1000 -- -
600 - -
500----------
400-------
300--
200 - -
150 — __
100 -
L1234S6789
Рисунок 1. Валидация результатов фрагментации на 2100 Bioanalyzer. L: ДНК маркер (DNA ladder), дорожка 1-8: фрагментированная обогащенная ДНК, пробирка 1-8, дорожка 9: не фрагментированная обогащенная контрольная ДНК
ЭТАП 1. Фрагментация геномной ДНК рестрикционными ферментами. На
первом этапе, в 45 pl очищенной от нуклеаз воде растворили 225 ng каждого образца геномной ДНК (финальная концентрация ДНК - 5 ng/pl). После чего, образцы геномной ДНК были разрезаны на фрагменты (различной длины) с помощью 16 различных ферментов в 8 различных рестрикционных пробирках (реакциях) при 370C в течении 30 минут. Обогащенная контрольная ДНК (Enrichment Control DNA, ECD) была использована в качестве контроля, результаты фрагментации были валидированы на биоанализаторе (Bioanalyzer 2100) (Рисунок 1).
Результаты электрофореза на 2100 Bioanalyzer показали, что все образцы фрагментированной обогащенной ДНК (дорожка 1-8) имели 3 бэнда - 125 bp, 225 bp и 450 bp согласно протоколу. Обогащенная ДНК имеет геномную ДНК смешанную с ПЦР
продуктом, который состоит из всех рестрикционных сайтов для всех 16 ферментов, использованных в фрагментации. Поэтому не фрагментированная обогащенная контрольная ДНК (дорожка 9) показала бэнд ПЦР продукта 800 bp как и ожидалось.
ЭТАП 2. Гибридизация
фрагментированных ДНК с На1оР1ех зондами для таргетного обогащения и индексирование образцов. Гибридизация коллекции фрагментов геномной ДНК с На1оР1ех зондами (которые были разработаны для выборочной гибридизации с фрагментами таргетных регионов генома и для непосредственной циркуляризации таргетных ДНК фрагментов) была проведена в гибридизационном мастер миксе при 540С в течении 3 часов. Гибридизационая смесь включала в себя 50 гибридизационного раствора и 20 На1оР1ех зонда. На данном этапе библиотека зондов была гибридизирована к обеим концам таргетных фрагментов для создания кольцевых ДНК молекул. Также 48 разных индекс сиквенсов были добавлены к 48 образцам ДНК (к таргетным регионам) во время процесса гибридизации для дальнейшей идентификации образцов во время биоинформатического анализа. В итоге, мы получили биотинилированные циркуляризированные фрагменты таргетной ДНК, которые включали в себя баркод (индекс сиквенсы) и сиквенс специфические адаптеры.
ЭТАП 3. Захват таргетных ДНК. На этом этапе, циркуляризированные гибриды таргетная ДНК-На1оР1ех зонды, содержащие биотин были захвачены на магнитных
Подготовка ПЦР мастер микса.
ЭТАП 6. Промывка захваченных ДНК NaOH раствором. На этом этапе, захваченные ДНК библиотеки промыли в 100 pl SSC Buffer для исключения не лигированных циркулизированных гибридов HaloPlex зонд -таргетная ДНК. Затем, захваченные ДНК
стрептавидиновых шариках (HaloPlex Magnetic Beads). Сначало, HaloPlex магнитные шарики (HaloPlex Magnetic Beads) были ресуспендированы в 40 |jl Capture solution и добавлены в 160 jl гибридизационную реакцию. Затем, связанные с шариками образцы промыли в 100 jl Wash Solution и инкубировали в термоциклере при 460С в течении 10 минут для устранения ДНК фрагментов, которые не были гибридизированы к HaloPlex зонду. Также, было подготовлено 50 mM NaOH раствора из стоковой концентрации 10 N NaOH для использования на этапе 6.
ЭТАП 4. Лигирование захваченных, циркуляризированных фрагментов. На этой фазе, в реакцию захвата была добавлена ДНК-лигаза для соединения
циркуляризированных гибридов таргетная ДНК-HaloPlex зонды. Пробирки с образцами были инкубированы в термоциклере при 550С в течении 10 минут для лигации.
ЭТАП 5. Подготовка ПЦР мастер микса. На данном этапе приготовили ПЦР мастер микс для амплификации захваченных таргетных ДНК (Таблица 2).
В ПЦР реакцию была добавлена 2М уксусная кислота для нейтрализации NaOH раствора, который будет использован при элюции на следующем этапе.
Таблица 2.
библиотеки были элюированы 25 р1 свежеприготовленным 50 тМ №ОН раствором. Использование №ОН раствора с высоким качеством на данном этапе является очень важным для оптимальной промывки и восстановления ДНК.
Объем для 1 реакции, Ml Объем для 12 реакций (включая излишек), Ml
Реагент
5XHerculase II Reaction Buffer 10 130
dNTPs (100mM, 25 mM каждого dNTP) 0.4 5.2
*Primer Forward (25 |jM) 1 13
*Primer Reverse (25 jM) 1 13
2 M уксусная кислота 0.5 6.5
Herculase II Fusion DNA Polymerase 1 13
Nuclease-free water 16.1 209.3
Всего 30 390
ЭТАП 7. ПЦР-амплификация захваченных таргетных библиотек. На этом этапе, 20 р1 захваченных ДНК после промывки 50 тМ NaOH раствором добавили в 30 р1 ПЦР мастер микс, приготовленный на этапе 5. ПЦР-амплификация захваченных таргетных ДНК библиотек была проведена при температуре отжига 600С, количество циклов - 20.
ЭТАП 8. Очистка амплифицированных таргетных библиотек. На данном этапе, амплифицированные таргетные ДНК библиотеки были очищены с использованием АМРиге ХР шариков. Сначало, амплифицированные таргетные ДНК на шариках промыли 70% свежеприготовленным этанолом 4 раза для удаления маленьких
ДНК-фрагменты, такие как адаптеры, затем амплифицированные таргетные библиотеки элюировали 10 тМ Т^-НС1 раствором.
ЭТАП 9. Валидация обогащения и определение количества обогащенных таргетных ДНК. Оценка качества и количества полученных ДНК библиотек была проведена на Вюапа^ег 2100. Длина ампликонов была в диапазоне 175-625 Ьр, где большинство продуктов имели размер 225-525 Ьр, как и ожидалось (Рисунок 2). Диапозон размеров ампликонов 175-625 Ьр был включен для количественной оценки обогащенных таргетных ДНК. Средняя концентрация подготовленных ДНК библиотек составила 90 пд/\А.
D=U]
500-
JL
ИТ
35
ТТТ 150
300
Г Г 11 5О0
ТЛ"
~п—
1ОЗВ0
(Ьр]
Рисунок 2. ДНК библиотека с хорошим качеством (образец №1) на 2100 Bioanalyzer.
ЭТАП 10. Объединение образцов с различными индексами для
мультиплексного секвенирование. На этом этапе, образцы с разными индексами и с эквимолярным количеством (концентрации ДНК библиотек, полученные с использованием Биоанализатора) были объединены вместе для проведения мультиплексного секвенирования на HiSeq 2000.
Результаты
Была создана HaloPlex кардиогенетическая панель для таргетного секвенирования 96 генов ассоциированных с аритмиями при помощи онлайн программы SureDesign Online Design software (Agilent Technologies). После подготовки дизайна HaloPlex кардиопанели, панель была скачена и все наши таргеты были просмотрены с использованием UCSC Genome Browser, где необходимо. Финальный дизайн был создан с помощью Генома
человека, версия 19 (Human Genome version 19, GRCh 37, February 2009) для платформы Illumina, длина ридов 150 bp. Общее число таргетов - 96 генов, ассоциированных с различными сердечными аритмиями. Размер таргетного региона составляет 463.767 kbp. Программой было создано 19958 ампликонов для того, чтобы покрыть все таргетные регионы. Таким образом, 99,46% всех таргетных регионов были покрыты удачно. Несмотря на то, что 0,54% всех таргетов не были покрыты и пропущены, процент покрытых таргетов довольно хороший (Рисунок 3).
Часть отчета дизайна нашей кардиопанели по покрытию таргетов показана на Рисунке 4.
Когда 'ZMF96cardio' дизайн был завершен и был оценен как правильный, панель была заказана с SureDesign аккаунта онлайн.
Design Name: ZMF96cardio Design ID: 22408-1387190209
Species: H. sapiens (H. sapiens, hg19r GRCh37, February 2009) Platform: lllumina Read Length: 150 bp
Probegroup Summary Number of Probegroups: 2 Probegroup 1 : CP_241012_opt Probegroup 2: ZMF96cardio_1
Target Summary
Target Region Size : 463.767 kbp
Amplicon Summary
Total Amplicons: 19958
Total Target Bases Analyzable: 406.062 kbp
Total Sequenceable Design Size: 1.039 Mbp
Target Coverage: 99.46 %
Recommended Minimum Sequencing per Sample: 207.994 Mbp Pricing: lllumina Tier 1 (Probe Region Size = 0 - 499 kbp; up to 20K probes)
Рисунок 3. Общая информация по дизайну
Рисунок 4. Отчет дизайна по покрытию таргетов на один ген.
Для подготовки библиотек генов-кандидатов, сначала ДНК образцы были поделены на фрагменты 16 различными рестрикционными ферментами и денатурированы. Затем, библиотека зондов была гибридизирована к обеим концам таргетных фрагментов для создания кольцевых ДНК молекул. 48 разных индекс сиквенсов были добавлены к 48 образцам. В дальнейшем, HaloPlex зонды были биотинилированы и таргетные фрагменты были захвачены магнитными стрептавидиновыми шариками. Кольцевые молекулы ДНК были соединены вместе в реакции лигации. Затем,
таргетные фрагменты были амплифицированы, в итоге создавая обогащенные и индексированные продукты амплификации, которые готовы для секвенирования.
Выводы. Была создана новая На1оР1ех кардиогенетическая панель для таргетного секвенирования 96 генов ассоциированных с аритмиями. Подготовлено 48 ДНК-библиотек с использованием данной панели, все образцы были секвенированы на Шитта HiSeq 2000. В настоящее время проводится биоинформа-тический анализ полученных данных секвенирования.
У авторов статьи нет конфликта интересов.
Литература:
1. Aronow W.S. Treatment of ventricular arrhythmias in older adults. J Am Geriatr Soc 1995;43:688-95.
2. Bauce B., Rampazzo A., Basso C., Bagattin A., Daliento L., Tiso N., Turrini P., Thiene G., Danieli G.A., Nava A. Screening for ryanodine receptor type 2 mutations in families with effort-induced polymorphic ventricular arrhythmias and sudden death: early diagnosis of asymptomatic carriers. J Am Coll Cardiol 2002, 40:341-349.
3. Chen Q., Kirsch G.E., Zhang D., Brugada R., Brugada J., Brugada P., Potenza D., Moya A., Borggrefe M., Breithardt G., Ortiz-Lopez R., Wang Z., Antzelevitch C., O'Brien R.E., Schulze-Bahr E., Keating M.T., Towbin J.A., Wang Q. Genetic basis and molecular mechanism for idiopathic ventricular fibrillation. Nature 1998, 392:293-296.
4. Corrado В., Basso C., Thiene G.. Sudden cardiac death in young people with apparently normal heart, Cardiovasc. Res. 50 (2001) 399-408.
5. Keating M.T., Sanguinetti M.C. Molecular and cellular mechanisms of cardiac arrhythmias. Cell 2001, 104:569-580
6. Laitinen P.J., Brown K.M., Piippo K., Swan H., Devaney J.M., Brahmbhatt B., Donarum E.A., Marino M., Tiso N., Viitasalo M., Toivonen L., Stephan D.A., Kontula K. Mutations of the cardiac ryanodine receptor (RyR2) gene in familial polymorphic ventricular tachycardia. Circulation 2001, 103:485-490.
7. Martin C.A., Huang C.L., Matthews G.D. Recent developments in the management of patients at risk for sudden cardiac death. Postgrad Med. 2011 Mar;123(2):84-94. doi: 10.3810/pgm. 2011.03.2266.
8. Priori S.G., Napolitano C., Tiso N., Memmi M., Vignati G., Bloise R., Sorrentino V., Danieli G.A. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation 2001, 103:196-200.
9. Priori S.G., Napolitano C., Memmi M., Colombi B., Drago F., Gasparini M., DeSimone L., Coltorti F., Bloise R., Keegan R., Cruz Filho F.E., Vignati G., Benatar A., DeLogu A. Clinical and molecular characterization of patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation 2002, 106:69-74.
10. Puranik R., Chow C.K., Duflou J.A., Kilborn M.J., McGuire M.A. Sudden death in the young. Heart Rhythm 2 (2005) 1277-1282.
11. Reid D.S., Tynan M., Braidwood L., Fitzgerald G.R. Bidirectional tachycardia in a child. A study using His bundle electrography. Br Heart J 1975, 37:339-344.
12. Roden D.M., American Heart Association. Cardiovascular genetics and genomics. Chichester: Wiley-Blackwell; 2009.
13. Splawski I., Shen J., Timothy K.W., Lehmann M.H., Priori S., Robinson J.L., Moss
A.J., Schwartz P.J., Towbin J.A., Vincent G.M., Keating M.T. Spectrum of mutations in long-QT syndrome genes. KVLQT1, HERG, SCN5A, KCNE1, and KCNE2. Circulation 2000, 102:1178-1185.
14. Swan H., Piippo K., Viitasalo M., Heikkila P., Paavonen T., Kainulainen K., Kere J., Keto P., Kontula K., Toivonen L. Arrhythmic disorder mapped to chromosome 1q42-q43 causes malignant polymorphic ventricular tachycardia in structurally normal hearts. J Am Coll Cardiol 1999, 34:2035-2042.
15. Tiso N., Stephan D.A., Nava A., Bagattin A., Devaney J.M., Stanchi F., Larderet G., Brahmbhatt
B., Brown K., Bauce B., Muriago M., Basso C., Thiene G., Danieli G.A., Rampazzo A. Identification of mutations in the cardiac ryanodine receptor gene in families affected with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy type 2 (ARVD2). Hum Mol Genet 2001, 10:189-194.
16. http://www.chem.agilent.com/library/datas heets/Public/HaloplexCardiomyopathyandArrhyth miaPanelsDataSheet59912525EN.pdf
Контактная информация:
Ахметова Айнур Жармухамбетовна - MSc, научный сотрудник Лаборатории геномной и персонализированной медицины, ЧУ «National Laboratory Astana», Назарбаев университет.
Почтовый адрес: 010000, г. Астана, Проспект Кабанбай батыра, 53, кабинет 3423.
E-mail: ainur.akhmetova2@nu.edu.kz
Телефон: +7 7172 70 93 18
Работа выполнена в рамках проекта «Разработка и клиническая апробация HALOPLEX кардиогенетической панели для выявления генетической предрасположенности и диагностики сердечных аритмий» по бюджетной программе МОН РК 0072/ПЦФ-14 «Создание и развитие основ геномной медицины в Казахстане» на 2015-2017 гг.
52
