CC BY
15
© Коллектив авторов, 2023
Шведова Е.В.1, Клепикова А.Г.1, Фадейкина О.В.1, Шведов Д.В.1, Борисевич И.В.2, Солдатов А.А.1
Разработка фармакопейного стандартного образца для количественного определения активности иммуноглобулина человека антирезус Rho(D)
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное медико-биологическое агентство, 123182, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Фармакологическое действие лекарственных препаратов иммуноглобулина человека (ИГЧ) антирезус КИо(Б) характеризуется специфической активностью -способностью анти-Б-антител (Ат) к избирательному блокированию нежелательного иммунного ответа на антиген Б резус-положительных эритроцитов плода, попавших в кровоток матери, а также дозой вводимого препарата. Дозу препарата рассчитывают исходя из количественного содержания анти-Б-^в-Ат, выраженного в международных единицах (МЕ) или в микрограммах (мкг). Зарубежные производители содержание анти-Б-]^0-Ат в препаратах количественно определяют методами гемагглютинации, проточной цитофлуориметрии и иммуноферментного анализа. Результат выражают в МЕ или мкг (5 МЕ = 1 мкг) по отношению к международному стандартному образцу (МСО) анти-Б-иммуноглобулина или стандартному образцу (СО), откалиброванному относительно МСО. Отечественные производители определяли содержание анти-Б-^в-Ат в титрах с помощью непрямой пробы Кумбса без использования СО. Отсутствие национального СО, аттестованного в МЕ (или в мкг), не позволяло отечественным производителям препаратов ИГЧ антирезус ЯИо(Б) установить норму содержания анти-Б-^в-Ат в препарате в МЕ (или мкг) для расчета дозы введения в соответствии с международными требованиями к его клиническому применению, что могло стать причиной отсутствия требуемого терапевтического эффекта, гемолиза эритроцитов или развития других нежелательных реакций.
Цель исследования - разработать фармакопейный стандартный образец (ФСО) для количественного определения активности ИГЧ антирезус ЯИ (Б).
Материал и методы. В работе использовали образцы кандидата в ФСО, МСО анти-Б-иммуноглобулина, СО Европейской фармакопеи (ЕФ) с содержанием анти-Б-^в-Ат, определяемых в реакции агглютинации (1 : 8), эритроциты человека фенотипов ЯШ! и Я2Я2, гг. Для установления аттестуемой характеристики ФСО использовали иммуно-ферментный анализ и метод гемагглютинации в геле.
Результаты. Разработан национальный ФСО 3.1.000452 Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) «Стандартный образец для определения активности ИГЧ антирезус ЯИ (Б) (содержания анти-Б-антител ^в)» со значением активности 516 МЕ/мл (103 мкг/мл) и расширенной неопределенностью: ±100 МЕ/мл (±20 мкг/мл) (коэффициент охвата 2, доверительный уровень 95%). Установлено, что доступный ва-лидированный иммуноферментный метод с применением эритроцитов фенотипов ЯШ! или Я2Я2 для самостоятельного приготовления иммуносорбента обеспечивает точное количественное определение анти-Б-^в-Ат в ФСО ГФ РФ. Показано, что применение иммуноферментного анализа и метода гемагглютинации в геле для установления аттестуемой характеристики ФСО ГФ РФ обеспечивает прослеживаемость и сопоставимость получаемых результатов.
Заключение. Разработанный ФСО включен в реестр ФСО биологического происхождения ГФ РФ, а также внедрен в нормативную документацию на препарат, производимый в РФ (МНН «Иммуноглобулин человека антирезус ЯИо(Б)»). Применение ФСО позволяет установить значения содержания анти-Б-^в-Ат в препарате в МЕ/мл (или
Для корреспонденции
Шведова Евгения Владимировна -главный эксперт лаборатории иммунологии ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: Моу1коуаЕ¥@ехршеДги https://orcid.org/0000-0002-9229-3677
в мкг/мл), что способствует адекватному расчету дозы введения при его клиническом применении для специфической перинатальной профилактики резус-иммунизации женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови.
Ключевые слова: национальный фармакопейный стандартный образец; иммуноглобулин человека антирезус ЯЬо(Б); количественное определение; анти-Б-антитела ^О
Статья получена 22.03.2023. Принята в печать 25.04.2023.
Для цитирования: Шведова Е.В., Клепикова А.Г., Фадейкина О.В., Шведов Д.В., Борисевич И.В., Солдатов А.А. Разработка фармакопейного стандартного образца для количественного определения активности иммуноглобулина человека антирезус ЯЬ (Б). Иммунология. 2023; 44 (3): 358-367. Б01: Шр8:/Моь о^/10.33029/1816-2134-2023-44-3-358-367 0
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России .№ 056-00052-23-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 121022000147-4).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Шведова Е.В.; экспериментальная работа -Шведова Е.В., Клепикова А.Г.; анализ экспериментальных данных - Фадейкина О.В.; написание текста - Шведова Е.В.; общее руководство - Шведов Д.В.; окончательное утверждение версии для публикации - Борисевич И.В., Солдатов А.А.
Shvedova E.V.1, Klepikova A.G.1, Fadeikina O.V.1, Shvedov D.V.1, Borisevich I.V.2, Soldatov A.A.1
Development of a Pharmacopoeia Standard for the quantitative determination of the activity of human immunoglobulin antirhesus Rho(D)
1 Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russian Federation
2 Federal Medical-Biological Agency, 123182, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The pharmacological effect of human immunoglobulin (HI) antirhesus Rho(D) drugs is characterized by their specific activity - the ability of anti-D antibodies (Ab) IgG to selectively block an undesirable immune response to the D antigen of Rh-positive fetal erythrocytes that have entered the mother's bloodstream, as well as the dose of the administered. The dose of the drug is calculated based on the quantitative content of anti-D-IgG-Ab, expressed in International Units (IU) or in micrograms (mcg). Foreign manufacturers the content of anti-D-IgG-Ab in preparations determined quantitatively by hemagglutination, flow cytofluorimetry and enzyme immunoassay in IU or mcg (5 IU = 1 mcg) in relation to the International Standard (IS) of anti-D immunoglobulin or a standard sample (SS) calibrated relative to the IS. Domestic manufacturers determined the content of anti-D-IgG-Ab in the titers using an indirect Coombs method without using a SS. The absence of a national SS certified in IU (or mcg) did not allow domestic manufacturers of HI anti-rhesus Rho(D) drugs to establish the norm of anti-D-IgG-Ab content in the drug in IU (or mcg) to calculate the dose of administration in accordance with international requirements for its clinical use, which could cause the absence of the desired therapeutic effect, erythrocyte hemolysis or the development of other adverse reactions.
The aim - to develop a Pharmacopoeia Standard (PhS) for the quantitative determination of the activity of HI antirhesus Rho(D).
Material and methods. Samples of the candidate for PhS, IS anti-D immunoglobulin, SS of the European Pharmacopoeia with the content of anti-D-IgG-Ab determined in the agglutination reaction (1:8), human erythrocytes of the phenotypes R1R1 and R2R2, rr were used in study. To establish the certified characteristics of the PhS, the enzyme immunoassay and the hemagglutination in gel were used.
Results. The national PhS 3.1.000452 of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation «Standard sample for determining the activity of IH antirhesus Rho(D) (content of anti-D-IgG-
For correspondence
Evgeniya V. Shvedova -Chief Expert of the Immunology Lab. of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: NovikovaEV@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-9229-3677
Ab)» has been developed with an activity value of 516 IU/ml (103 mcg/ml) and an extended uncertainty: ±100 IU/ml (±20 mcg/ml) (coverage ratio 2, confidence level 95 %). It has been established that the available validated enzyme immunoassay using erythrocytes of the R1R1 or R2R2 phenotypes for self-preparation of an immunosorbent provides an accurate quantitative determination of anti-D-IgG-Ab in the PhS. It is shown that the use of enzyme immunoassay and hemagglutination in gel to establish the certified characteristics of the PhS ensures the traceability and comparability of the results obtained.
Conclusion. The developed PhS is included in the register of PhS of biological origin, as well as implemented in the regulatory documentation for the drug produced in the Russian Federation (INN «Human Immunoglobulin anti-rhesus Rho(D)»). The use of PhS makes it possible to establish the values of the anti-D-IgG-Ab content in the drug in IU/ml (or mcg/ml), which contributes to an adequate calculation of the dose of administration during its clinical use for specific perinatal prevention of Rh-immunization of women with Rh-negative blood affiliation.
Keywords: national pharmacopoeia standard; human immunoglobulin antirhesus Rh (D); quantitative determination; anti-D-antibodies IgG
Received 22.03.2023. Accepted 25.04.2023.
For citation: Shvedova E.V., Klepikova A.G., Fadeikina O.V., Shvedov D.V., Borisevich I.V., Soldatov A.A. Development of a Pharmacopoeia Standard for the quantitative determination of the activity of human immunoglobulin antirhesus Rho(D). Immunologiya. 2023; 44 (3): 358-67. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-3-358-367 (in Russian)
Funding. The study was carried out as part of a publicly funded research project No. 056-00052-23-00 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the Ministry of Health of the Russian Federation (R&D public accounting No. 121022000147-4).
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Research concept and design - Shvedova E.V.; experimental work - Shvedova E.V., Klepikova A.G.; analysis of experimental data - Fadeikina O.V.; writing a text - Shvedova E.V.; general management -Shvedov D.V.; final approval of the version for publication - Borisevich I.V., Soldatov A.A.
Ведение
Препараты иммуноглобулина человека (ИГЧ) антирезус ЯИо(Б) - единственные иммунобиологические лекарственные средства для специфической перинатальной профилактики резус-иммунизации женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови. Они представляют собой концентрат специфических антител (Ат) - анти-Б-^в-Ат, полученный из плазмы крови здоровых доноров, иммунизированных Б-антигеном (Аг) резус-положительных эритроцитов человека 1(0) группы крови [1]. Пассивная иммунизация препаратом ИГЧ антирезус ЯИо(Б) предотвращает резус-иммунизацию более чем в 95 % случаев при достаточности и своевременности дозы введения до начала иммунного ответа матери на воздействие резус-положительных эритроцитов плода [2].
Профилактическую дозу препарата рассчитывают в международных единицах МЕ (или в мкг) после подсчета количества эритроцитов плода, попавших в кровоток матери, с использованием лабораторных методов анализа, например модифицированным методом кислотного вымывания-окрашивания по Кляйхауэру и Бетке, исходя из того, что 50 МЕ или 10 мкг анти-Б-^О-Ат нейтрализует 0,5 мл резус-положительных эритроцитов плода (или 1 мл цельной крови) [3, 4]. Таким образом, необходимым условием получения эф-
фективных и безопасных лекарственных препаратов ИГЧ антирезус Rh (D) является точное количественное определение анти-Э-^О-Ат, способных нейтрализовать резус-положительные эритроциты плода, попавшие в кровоток матери.
Для правильности и удобства расчета профилактических доз введения содержание основного действующего вещества в современных зарубежных препаратах ИГЧ антирезус Rho(D) составляет 125 мкг (625 МЕ), 150 мкг (750 МЕ0), 250 мкг (1250 МЕ), 300 мкг (1500 МЕ). При этом содержание анти-Э-^О-Ат в препаратах оценивают по количеству образовавшихся иммунных комплексов с D-Аг эритроцитов современными инструментальными методами автоматизированной гемагглютинации, иммуноферментного анализа (ИФА) и проточной цитофлуориметрии, стандартизированными применением МСО, аттестованного в МЕ (или в мкг), или СО, откалиброванных относительно МСО [5].
Оценка специфической активности препарата, производимого в РФ, оценивалась без использования СО непрямой пробой Кумбса в титрах, т. е. в условных единицах, характеризующих наибольшее разведение препарата, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов любой интенсивности, и составляла 1 : 1000 или 1 : 2000, что не позволяло точно определить содержание анти-Э-^О-Ат в 1 мл препарата и обеспечить точный расчет дозы введения [6].
Цель исследования - разработать фармакопейный стандартный образец (ФСО) для количественного определения активности ИГЧ антирезус Rho(D).
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) обосновать выбор методического подхода к разработке ФСО Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) «Стандартный образец для определения активности иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) (содержание анти-Э-^в-Ат)»; 2) разработать программу аттестации ФСО; 3) установить аттестуемую количественную характеристику ФСО.
Материал и методы
Исследование проводили с применением 3-го МСО анти-Э-иммуноглобулина ВОЗ с активностью 297 МЕ/ ампула (16/332, NIBSC, Великобритания); СО ЕФ ИГЧ нормального с содержанием анти-Э-^в-Ат, определяемых в реакции агглютинации в разведении 1 : 8 (Y0000540, EDQM, Франция); образцов лекарственного препарата ИГЧ антирезус RhQ(D), раствор для внутримышечного введения доза 1 мл (ампула), титр антител 1 : 1000 (дата выпуска - 27.01.2021, срок годности до 01.01.2024, Россия) (кандидат в ФСО ГФ РФ).
Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в соответствии с разработанной нами методикой [7] с использованием: твердой фазы - полистироловых прозрачных 96-луночных микропланшетов (MaxiSorp, Nunc, кат. N° 44-2404-21, США); эритроцитов фенотипов R1R1, R2R2 (ID-DiaCellI-II-III 5%, ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России); биотинилированных моноклональных анти^-Ат (BRAD-5, 02/230, NIBSC, Великобритания); авидина/стрептавидина, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Sigma Aldrich, кат. № Е2636, США); субстрата паранитрофенил-фосфата (Sigma Aldrich, кат. №7653, США); бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma Aldrich, кат. № А7030, США); папаина (Sigma Aldrich, кат. № P3375, США); раствора глута-рового альдегида (Sigma Aldrich, кат. № G5882, США); натрия гидроксида (Merck, кат. № 106469, США); глю-
козы (Sigma Aldrich, кат. № G7528, США); натрия цитрата (Sigma Aldrich, кат. № S4641, США); натрия ЭДТА (Sigma Aldrich, кат. № Е4884, США); кислоты борной (Merck, кат. № 1.00165, США).
Гемагглютинацию в геле проводили с использованием гелевых карт для проведения непрямой реакции Кумбса (Diagnostic Grifols S.A., кат. № 210342, Испания); стандартных 0,8% папаинизированных D-положительных эритроцитов человека группы крови 1(0) и D-отрицательного фенотипа rr (Diagnostic Grifols S.A., Испания); физиологического раствора - 0,9 % натрия хлорида (ООО НП «ПанЭко», кат. № Р010п, Россия).
Предварительно готовили разведения МСО анти-D-иммуноглобулина ВОЗ и образцов кандидата в ФСО (табл.1, 2).
Далее в 8 дозирующих/инкубационных камер микропробирки гелевой карты вносили по 25 мкл 0,8 % суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови 1(0) или по 25 мкл 0,8 % суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека 1(0) группы крови, затем вносили по 25 мкл соответствующего разведения кандидата в ФСО. Одновременно аналогичным образом готовили гелевую карту с использованием соответствующих разведений МСО. Гелевые карты с образцами инкубировали при температуре 37 ± 0,5 °С в течение 30 мин. По окончании инкубации гелевые карты центрифугировали при 120 g в течение 10 мин и оценивали наличие агглютинации. Агглютинированные эритроциты распределялись в толще гелевой колонки или в ее верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседали на дно микропробирки.
Содержание анти-D-IgG-Ат определяли по максимальному разведению образца, при котором наблюдают агглютинацию любой интенсивности (в титрах). Полученные титры МСО и кандидата в ФСО использовали для расчета содержания анти-D-IgG-Ат в МЕ/мл (или мкг) в ФСО по формуле:
Таблица 1. Последовательность приготовления разведений международного стандартного образца анти-Б-иммуноглобулина Всемирной организации здравоохранения с активностью 297 МЕ/мл
№ разведения Объем раствора МСО, мл Концентрация раствора МСО, титры Объем прибавляемого 0,9 % раствора NaCl, мл Конечная концентрация раствора МСО, титры
1 0,1 - 0,9 1 : 10
2 0,1 1 : 10 0,9 1 : 100
3 0,1 1 : 100 0,9 1 : 1000
4 0,1 1 1000 1,7 1 18000
5 0,1 1 1000 1,9 1 20000
6 0,1 1 1000 2,1 1 22000
7 0,1 1 1000 2,3 1 24000
8 0,1 1 1000 2,5 1 26000
9 0,1 1 1000 2,7 1 28000
10 0,1 1 1000 2,9 1 30000
11 0,1 1 1000 3,1 1 32000
Примечание. Здесь и в остальных таблицах: МСО - международный стандартный образец.
Таблица 2. Последовательность приготовления разведений кандидата в фармакопейный стандартный образец Государственной фармакопеи Российской Федерации
№ разведения Объем раствора ФСО, мл Концентрация раствора ФСО, титры Объем прибавляемого 0,9 % раствора Nad, мл Конечная концентрация раствора ФСО, титры
1 0,1 - 0,9 1 : 10
2 0,1 1 : 10 0,9 1 : 100
3 0,1 1 : 100 0,9 1 : 1000
4 0,1 1 1000 3,4 1 35000
5 0,1 1 1000 3,9 1 40000
6 0,1 1 1000 4,4 1 45000
7 0,1 1 1000 4,9 1 50000
8 0,1 1 1000 5,4 1 55000
9 0,1 1 1000 5,9 1 60000
10 0,1 1 1000 6,4 1 65000
11 0,1 1 1000 6,9 1 70000
Примечание. Здесь и в остальных таблицах: ФСО - фармакопейный стандартный образец.
ния содержания анти-D-IgG-AT в испытуемом образце должен находится в интервале от 80 до 120 % значения отдельного результата определения [8].
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics версии 20. Рассчитывали среднее арифметическое значение (Х ), стандартное отклонение (SD), относительное стандартное отклонение (RSD, %). Доверительный интервал рассчитывали как произведение SD и количества значений в группе данных прир = 95 %, расширенную неопределенность (U) аттестованного значения (X ) кандидата в ФСО вычисляли как ± 2SD от среднего значения (при коэффициенте охвата к = 2, доверительном уровне 95 %) [9, 10].
Для поиска литературы использовались базы данных Scopus, Web of Science, Pubmed, WHO, Global-Health, РИНЦ, EMA, FDA, ГФ РФ, Государственный реестр лекарственных средств (ГРЛС).
Таблица 3. Результаты количественного определения анти-Б-^в-антител в образцах кандидата в фармакопейный стандартный образец иммуноферментным методом
Ана- Применен- С , изм. ср. SD ср. SD RSD для
литик ный фенотип эритроцитов МЕ/мл для аналитика, МЕ/мл для аналитика для метода, МЕ/мл для метода метода, %
522
R1R1 510
1 477 515,5 30,2
552
R2R2 477
545 507,5 29,1 5,7
500
R1R1 503
2 477 499 28,1
465,5
R2R2 504
547
Примечание. Здесь и в табл. 4: Сизм - содержание анти-Б-^О-Ат в фармакопейном стандартном образце; расшифровка других аббревиатур приведена в тексте статьи.
А х Т
МСО ФСО
А =-,
ФСО Т
МСО
где АФСО - содержание анти-Б-^в-Ат в кандидате в ФСО, МЕ/мл; АМСО - содержание анти-Б-^в-Ат в МСО, МЕ/мл; ТФСО - величина, обратная максимальному разведению кандидата в ФСО, при котором наблюдают агглютинацию; ТМСО - величина, обратная максимальному разведению МСО, при котором наблюдают агглютинацию.
При необходимости пересчета МЕ/мл в мкг/мл полученное значение АФСО умножают на коэффициент пересчета 0,2.
Результаты испытаний должны были удовлетворять следующим критериям: в микропробирках, содержащих суспензию Б-отрицательных эритроцитов человека, агглютинация должна была отсутствовать; доверительный интервал (при р = 95%) трех результатов определе-
Таблица 4. Результаты определения анти-Б-^О-антител в образцах кандидата в фармакопейный стандартный образец методом гемагглютинации в геле
Аналитик С изм. в МСО, титры С изм. в ФСО, титры С расчет. в ФСО, МЕ/мл Хср. для аналитика, МЕ/мл Ж для аналитика Хср. для метода, МЕ/мл Ж для метода для метода, %
1 26000 1 55 000 628
1 26000 1 50 000 571
1 28000 1 50 000 530
1 26000 1 40 000 457
1 1 26000 1 45 000 514 526 66,5
1 26000 1 40 000 457
1 30000 1 50 000 495
1 26000 1 40 000 457
1 26000 1 40 000 457 524,6 64 12,2
2 1 28000 1 50 000 530 523 67,6
1 26000 1 50 000 571
1 26000 1 55 000 628
Примечание. С чет - содержание анти-Б-^О-Ат в фармакопейном стандартном образце, рассчитанное по формуле.
Результаты
Проведенный анализ нормативно-правовых документов Евразийского экономического союза, требований и рекомендаций международных регуляторных органов по оценке качества лекарственных препаратов ИГЧ антирезус ЯЬо(Б) показал, что оценка содержания анти-Б-^О-Ат в современных препаратах проводится количественно в МЕ (или в мкг) с помощью методов автоматизированной гемагглютинации, проточной цитофлуориметрии и ИФА с обязательным применением СО.
Сравнительный анализ современных методов количественного определения анти-Б-^О-Ат в лекарственных препаратах ИГЧ антирезус ЯЬ (Б) позволил сделать вывод о том, что проточная цитофлуориметрия и ИФА за счет использования моноклональных Ат (МкАт) и стандартизации фенотипов эритроцитов, используемых в качестве реагента, обладают большей специфичностью и селективностью по сравнению с методом автоматизированной гемагглютинации [11].
В тоже время проточная цитофлуориметрия не оправдывает себя из-за высокой стоимости импортного оборудования и его обслуживания, расходных материалов, сложности методик, требующих оценки прецизионности конъюгата МкАт (анти-Бе, анти-Р(аЪ')2, против цельного 1яО), ограничением в использовании эритроцитов только фенотипа Я1Я1, что не всегда доступно для контрольно-аналитических лабораторий [12].
ИФА обладает высокой специфичностью за счет использования стандартизированных МкАт, производительностью за счет использования многолуночных полистироловых планшетов, отсутствием зависимости от дорогостоящего импортного оборудования. Проведенное нами усовершенствование ИФА позволяет применять как эритроциты фенотипа Я2Я2, рекомендованного ЕФ, так и эритроциты наиболее распространенного в российской популяции фенотипа Я1Я1 для самостоятельного приготовления иммуносорбента в лабораторных условиях, что делает его наиболее при-
емлемым по сравнению с методами автоматизированной гемагглютинации и проточной цитофлуориметрии для установления аттестуемой количественной характеристики (в МЕ или в мкг) активности национального ФСО [7, 13].
В качестве материала кандидата в ФСО были выбраны образцы лекарственного препарата «Иммуноглобулин человека антирезус ЯЬо(Б), раствор для внутримышечного введения доза 1 мл (ампула), титр антител 1 : 1000», полученные на станции переливания крови.
Разработанная программа аттестации включала оценку содержания анти-Б-^О-Ат в кандидате в ФСО двумя методами: референтным ИФА и методом гемаг-глютинации в геле для оценки сопоставимости результатов, получаемых в МЕ (или в мкг) и титрах.
Проведено по 12 испытаний каждым методом на различных образцах кандидата в ФСО в разные дни двумя аналитиками. Для гарантии правильности получаемых результатов был использован 3-й МСО анти-Б-иммуно-глобулина ВОЗ с аттестованным значением активности 297 МЕ/мл [14].
В результате проведенных испытаний установлено, что среднее значение содержания анти-Б-^О-Ат в кандидате в ФСО, определенное в ИФА с применением эритроцитов фенотипов Я1Я1 или Я2Я2 для приготовления иммуносорбента, составило 507,5 МЕ/мл (табл. 3).
Результаты определения титра анти-Б-^О-Ат в образцах МСО с содержанием анти-Б-^О-Ат 297 МЕ/мл и кандидата в ФСО, полученные методом гемагглюти-нации в геле, были использованы для расчета содержания анти-Б-^О-Ат в МЕ/мл в кандидате в ФСО по формуле, указанной выше (табл. 4).
Полученные результаты (п = 24) количественного определения анти-Б-^О-Ат с помощью ИФА и методом гемагглютинации в геле в кандидате в ФСО были использованы для установления аттестованного значения активности ИГЧ антирезус КЬо(0) (X ), а также значений расширенной неопределенности (V) аттесто-
Таблица 5. Результаты количественного определения анти-Б- ^в-антител в образцах кандидата в фармакопейный стандартный образец иммуноферментным методом и методом гемагглютинации в геле
Метод Хср. для метода, МЕ/мл Ж для метода для метода, %
ИФА (п = 12) 507,5 29,1 5,7
Гемагглютинации в геле (п = 12) 524,6 64 12,2
Хср для двух методов (п = 24) 516,03 МЕ/мл (103,2 мкг/мл)
Ж для двух методов (п = 24) 49,4 МЕ/мл (9,9 мкг/мл)
и для Хср (п = 24) 98,8 МЕ/мл (19,8 мкг/мл)
RSD (п = 24) 9,6 %
ванного значения (Хср) при доверительной вероятности 0,05. Аттестованное значение выразили в МЕ/мл (или в мкг/мл) и представили как [Хр ± и] МЕ/мл (или мкг/мл) (коэффициент охвата к = 2, р = 95 %) (табл. 5).
Проведенные исследования позволили установить значение аттестованной характеристики ФСО для количественного определения активности ИГЧ антирезус ИИ (Б) (содержание анти-Б-антител ^в) -516 МЕ/мл (103 мкг/мл) с расширенной неопределенностью: ± 100 МЕ/мл (± 20 мкг/мл) (коэффициент охвата к = 2, р = 95 %) и определить срок годности до 01.01.2024.
Образцу присвоен статус ФСО с включением в реестр ФСО биологического происхождения ГФ РФ: ФСО 3.1.000452 [15].
Обсуждение
Анализ данных научной литературы свидетельствует о том, что нормативная документация по производству и оценке качества всех зарубежных лекарственных препаратов ИГЧ антирезус КИо(Б), зарегистрированных и разрешенных к медицинскому применению на территории РФ, предусматривает проведение испытаний по показателю «Специфическая активность» с использованием МСО анти-Б-иммуноглобулина ВОЗ, стандартного образца ЕФ анти-Б-иммуноглобулина, аттестованного относительно МСО, или СО фирмы, калиброванного по отношению к указанным СО. В нормативных документах отечественных производителей лекарственных препаратов ИГЧ антирезус ИИо(Б) такие требования отсутствуют [16]. В РФ исследования по разработке и аттестации национального ФСО для количественного определения анти-Б-^в-Ат в лекарственных препаратах ИГЧ антирезус ЯЬо(Б) ранее не проводились.
Известно, что использование СО - это необходимое условие, позволяющее выполнять задачи метрологического обеспечения методик оценки качества иммунобиологических лекарственных препаратов, в том числе лекарственных препаратов ИГЧ антирезус ИИо(Б), и оценивать сопоставимость полученных результатов [17]. При этом разработка СО должна включать применение нескольких надежных и валидированных методик для установления аттестуемой характеристики образца, обеспечивающих необходимую точность и прослеживаемость измерений [18].
В программу аттестации в качестве референтного был выбран высокоспецифичный и доступный валиди-рованный ИФА с целью количественного определения
анти-Б-^в-Ат в МЕ (или в мкг) с использованием эритроцитов фенотипов ЮЮ или И2И2 для приготовления иммуносорбента и стандартизированный применением МСО анти-Б-иммуноглобулина ВОЗ с аттестованным значением активности 297 МЕ/мл [19].
Поскольку процесс производства отечественного препарата ИГЧ антирезус ИИо(Б) включает оценку специфической активности концентрата анти-Б-^в-Ат, полученного из сывороток иммунных доноров путем выделения фракции ^в по методу Кона, методом гем-агглютинации (непрямой пробой Кумбса) в титрах, для перехода от оценки в титрах на количественную оценку в МЕ (или в мкг) необходимо было определить содержание анти-Б-^в-Ат в кандидате в ФСО методом гемагглютинации в геле в сравнении с МСО анти-Б-иммуно-глобулина ВОЗ.
Метод гемагглютинации в геле стандартизирован и специфичен в сравнении с непрямой пробой Кумбса за счет применения гелевых карт с МкАт, которые обеспечивают большую прецизионность и достоверность результатов определения анти-Б-^в-Ат, что и позволило включить данный метод в программу аттестации ФСО [20].
В ходе проведенных исследований было установлено, что среднее значение содержания анти-Б-^в-Ат в образцах кандидата в ФСО, определенное с помощью ИФА, составило 507,5 МЕ/мл, при этом относительное стандартное отклонение (КБП) результатов, полученных двумя аналитиками в разные дни, составило 5,7 %, что соответствовало установленным критериям приемлемости результатов, получаемых данным методом (не более 20 %) [19].
Для определения анти-Б-Ат ^в в образцах кандидата в ФСО методом гемагглютинации в геле предварительно определяли титр 3-го МСО анти-Б-иммуно-глобулина ВОЗ с аттестованным значением активности 297 МЕ/мл. Среднее значение величины, обратной разведению МСО, при котором наблюдалась агглютинация, составило 26 666, при этом КББ 12 результатов определения составило 4,9 %, что демонстрировало удовлетворительную внутрилабораторную прецизионность [21]. Для гарантии достоверности результатов, получаемых методом гемагглютинации в геле, в качестве контрольного образца использовали СО иммуноглобулина нормального с содержанием анти-Б-^в-Ат, определяемых в реакции агглютинации в разведении 1 : 8. Результат
определения титра контрольного образца при каждом определении был равен 1 : 8 (п = 12), что соответствовало аттестованному значению [22].
Далее методом гемагглютинации при параллельном воспроизведении определяли титры в образцах МСО и кандидата в ФСО и рассчитывали количественное содержание анти-Б-^О-Ат в ФСО в МЕ/мл относительно МСО. Среднее значение содержания анти-Б-^О-Ат в кандидате в ФСО составило 524,6 МЕ/мл, при этом К8Б 12 результатов определения составило 12,2 %.
Результаты, полученные с помощью ИФА и методом гемагглютинации в геле, в сравнении с МСО демонстрировали воспроизводимость, достоверность и сопоставимость, таким образом, установленное в ходе проведенных исследований аттестованное значение содержания анти-Б-Ат1^ в ФСО - 516 МЕ/мл (103 мкг/мл) с расширенной неопределенностью: ± 100 МЕ/мл (± 20 мкг/мл) (коэффициент охвата к = 2, уровень доверия 95%), обеспечивает прослеживаемость и точность результатов количественного определения активности в лекарственных препаратах ИГЧ антирезус ЯИо(Б).
Срок годности ФСО 3.1.000452 установлен в соответствии со сроком годности лекарственного препарата -
кандидата в ФСО (до 01.01.2024). Оценка стабильности проведена на производственной площадке, что подтверждается нормативной документацией производителя и материалами регистрационного досье на препарат.
Заключение
Разработанный ФСО «Стандартный образец для определения активности иммуноглобулина человека антирезус ЯИо(Б) (содержания анти-Б-антител 1яО)» включен в реестр ФСО биологического происхождения ГФ РФ и внедрен в нормативную документацию на отечественный лекарственный препарат ИГЧ антирезус ЯЬо(Б) [МНН «Иммуноглобулин человека антирезус ЯЬо(0)»], что позволяет производителям установить норму содержания анти-Б-^О-Ат в препарате в МЕ (или в мкг) и обеспечивает расчет дозы введения в соответствии с международными требованиями к прогнозированию безопасности и эффективности его клинического применения для своевременной профилактики резус-конфликта во время беременности и в раннем послеродовом периоде.
■ Литература
1. Савельева Г.М., Курцер М.А., Панина О.Б., Сичинава Л.Г., Клименко П.А., Коноплянников А.Г., Алексеенкова М.В. Диагностика, лечение, профилактика гемолитической болезни плода при резус-сенсибилизации. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2006; 6: 73-8.
2. Оловникова Н.И., Николаева Т.Л., Эршлер М.А. Иммунопрофилактика резус-иммунизации: перспектива создания моноклональ-ного иммуноглобулина для предупреждения гемолитической болезни новорожденных. Иммунология. 2018; 39 (1): 74-80. DOI: http://doi. org/10.18821/0506-4952-2018-39-1-74-80
3. Манылова Н.А., Логинова И.И. Использование теста Клейха-уэра-Бетке для выявления фето-материнской трансфузии и определение факторов риска развития анемии у новорожденных первой недели жизни. Системный анализ и управление в биомедицинских системах. 2008; 7 (1): 142-4.
4. Guideline on the clinical investigation of human anti-D immunoglobulin for intravenous and/or intramuscular use: EMA/CPMP/ BPWG/575/99, rev. 1. URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/doc-ument_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003334.pdf
5. Шведова Е.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И. Методы оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D): современное состояние проблемы. Иммунология. 2020; 41 (3): 256-1. DOI: http://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-3-256-261
6. Вильданова Н.С., Коромщикова Е.С., Калинина Е.Н. Этапы стандартизации препаратов антирезусного иммуноглобулина человека по показателю «Специфическая активность». БИОпрепараты. Профилактика, Диагностика, Лечение. 2022; 22 (3): 241-8. DOI: https://doi. org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-241-248
7. Шведова Е.В., Кудашева Э.Ю., Лешина С.А., Давыдов Д.С. Способ количественного определения анти^-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D). Патент на изобретение № 2777845 от 11.08.2022, Российская Федерация, МПК: А61К35/12,15; G01N33/53; заявитель и патентообладатель ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, заявка № 2021137704 от 20.12.2021.
8. Испытания на анти-D антитела в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. 0ФС.1.8.2.0004.15 Государственная фармакопея Российской Федерации XIV изд. Электронный ресурс. URL: https://femb.ru/record/pharmacopea14
9. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. Москва : Практика; 1999. 459 с.
10. Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество. Береговых В.В. (ред.) Санкт-Петербург : Профессия, 2017: 768 с.
11. 2.7.13. Assay of Human Anti-D Immunoglobulin 01/2008:20713. European Pharmacopoeia, 11th ed. Strasboung : Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe.
12. Трусов Г.А., Чапленко А.А., Семенова И.С. Применение проточной цитометрии для оценки качества биомедицинских клеточных продуктов. БИОпрепараты. Профилактика, Диагностика, Лечение. 2018; 18 (1): 16-4. DOI: https://doi.org/10.30895/2221-996X-2018-18-1-16-24
13. Шведова Е.В., Лешина С.А., Давыдов Д.С., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю. Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе при определении содержания анти-D-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом иммуноферментного анализа. Иммунология. 2022; 43 ("2): 208-16. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-2-208-216
14. WHO International Standard Anti-D Immunoglobulin. NIBSC code: 16/332. Instructions for use. URL: https://www.nibsc.org/docu-ments/ifu/16-332.pdf
15. Реестр фармакопейных стандартных образцов Государственной Фармакопеи Российской Федерации. Электронный ресурс. URL: http://www.regmed.ru/produkt-n-service/fso/fso-registry/fso-of-biologi-cal-origin
16. Государственный реестр лекарственных средств Министерства здравоохранения Российской Федерации. Электронный ресурс. URL: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx
17. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Электронный ресурс. URL: https://docs. cntd.ru/document/1200029975
18. Государственная система обеспечения единства измерений. Стандартные образцы материалов (веществ). Основные положения. ГОСТ Р 8.753-2011. Электронный ресурс. URL: https://docs.cntd.ru/ document/1200093434
19. Шведова Е.В., Лешина С. А., Кудашева Э.Ю., Борисевич И.В., Меркулов В.А., Шведов Д.В. Разработка критериев приемлемости оценки результатов количественного определения анти^-антител
^О в препаратах иммуноглобулина человека антирезус ИИ (Б) им-муноферментным методом. Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022; 22 (3): 266-8. Б01: Шр§://сМ.о^/10.30895/2221-996Х-2022-22-3-266-278
20. Искакова О.А. Применение гелевой технологии для имму-ногематологических исследований крови. Наука и здравоохранение. 2013; 1: 48-2.
21. Bioanalytical method validation guidance for industry. U.S. Biopharmaceutics, May 2018. URL: http://www.fda.gov/Drugs/ GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidance/default. htm
22. EDQM Immunoglobulin panel for anti-D antibodies test BRP. Instructions for use. URL: https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/db/4DCGI/ leaflet?leaflet=Y0000540_1.pdf
■ References
1. Savel'eva G.M., Kurcer M.A., Panina O.B., Sichinava L.G., Kli-menko P.A., Konopljannikov A.G., Alekseenkova M.V. Diagnosis, treatment, prevention of fetal hemolytic disease in RH-sensitization. Rossiyskiy Vestnik Perinatologii i Pediatrii (Russian Bulletin of perinatology and pediatrics). 2006; 6: 73-8. (in Russian)
2. Olovnikova N.I., Nikolaeva T.L., Ershler M.A. Immunization of rhesus immunization: the prospect of a monoclonal immunoglobulin to prevent haemolytic disease of the newborn. Immunologiya. 2018; 39. (1): 74-80. DOI: http://doi.org/10.18821/0506-4952-2018-39-1-74-80 (in Russian)
3. Manylova N.A., Loginova I.I. Using the Kleihauer-Betke test in revealing of fetomaternal transfusion and determination of risk factors of anemia in newborns of the first week of life. System analysis and management in biomedical systems. 2008; 7 (1): 142-4. (in Russian)
4. Guideline on the clinical investigation of human anti-D im-munoglobulin for intravenous and/or intramuscular use: EMA/CPMP/ BPWG/575/99, rev. 1. URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/doc-ument_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003334.pdf
5. Shvedova E.V., Kudasheva E.Yu., Klimov V.I. Methods for evaluating the specific activity of preparations of human antirhesus Rh (D): current status of the problem. Immunologiya. 2020; 41 (3): 256-1. DOI: http:// doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-3-256-261 (in Russian)
6. Vildanova N.S., Kormshchikova E.S., Kalinina E.N. Human anti-D immunoglobulin preparations: potency standardisation milestones. BIO-preparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie. 2022; 22 (3): 241-8. DOI: https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-241-248 (in Russian)
7. Shvedova E.V., Kudasheva E.Yu., Leshina S.A., Davydov D.S. Method of quantitative determination of IgG anti-D antibodies in human immunoglobulin preparations Rh (D) antirhesus. Patent for invention № 2777845 dated 11.08.2022, Russ°ian Federation, WIPO: A61K35/12,15; G01N33/53; applicant and patent holder SCEEMP of the MOH of Russia, application № 2021137704 dated 20.12.2021 (in Russian)
8. Tests for anti-D antibodies in human immunoglobulin drugs. GPM. 1.8.2.0004.15 State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIVed. URL: https://femb.ru/record/pharmacopea14 (in Russian)
9. Glantz S. Biomedical statistics. Moscow; Praktika, 1999: 459 p. (in Russian)
10. ICH guidelines for the pharmaceutical industry. Quality. In: Beregovyh V.V. (ed.). Saint Petersburg: Professiya, 2017: 768 p. (in Russian)
11. 2.7.13. Assay of Human Anti-D Immunoglobulin 01/2008:20713. European Pharmacopoeia, 11th ed. Strasboung: Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe.
12. Trusov G.A., Chaplenko A.A., Semenova I.S. Use of flow cytometry to quality evaluation of biomedical cell products. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2018; 18 (1): 16-4. DOI: https:// doi.org/10.30895/2221-996X-2018-18-1-16-24 (in Russian)
13. Shvedova E.V., Leshina S.A., Davydov D.S., Borisevich I.V., Kudasheva E.Yu. Development of criteria for immobilization of human eryth-rocytes of phenotypes R1R1 and R2R2 on the solid phase in determining the content of anti-D-antibodies IgG in immunoglobulin human antirhe-sus Rho(D) preparations by enzyme immunoassay. Immunologiya. 2022; 43 (2):208-16. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-2-208-216 (in Russian)
14. WHO International Standard Anti-D Immunoglobulin. NIBSC code: 16/332. Instructions for use. URL: https://www.nibsc.org/docu-ments/ifu/16-332.pdf
15. Register of Pharmacopoeia reference samples of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation. URL: http://www.regmed.ru/ produkt-n-service/fso/fso-registry/fso-of-biological-origin
16. State Register of Medicines of the Ministry of Health of the Russian Federation. URL: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx (in Russian)
17. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1. General principles and definitions. 5725-1-2002. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200029975 (in Russian)
18. State system for ensuring the uniformity of measurements. Reference materials of materials (substances). Basic principles. 8.753-2011. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200093434 (in Russian)
19. Shvedova E.V., Leshina S.A., Kudasheva E.Yu., Borisevich I.V., Shvedov D.V., Merkulov V.A. Development of acceptance criteria for evaluating the results of quantitative determination of anti-D-antibodies IgG in immunoglobulin human antirhesus Rho(D) preparations by enzyme immu-noassay. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2022; 22 (3): 266-8. DOI: https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-266-278 (in Russian)
20. Iskakova O.A. Gel technologies for the immune hematological blood testing. Science and Healthcare. 2013; 1: 48-2. (in Russian)
21. Bioanalytical method validation guidance for industry. U.S. Biopharmaceutics, May 2018. URL: http://www.fda.gov/Drugs/Guidance-ComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htm
22. EDQM Immunoglobulin panel for anti-D antibodies test BRP. Instructions for use. URL: https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/db/4DCGI/ leaflet?leaflet=Y0000540_1.pdf
Сведения об авторах
Шведова Евгения Владимировна - главный эксперт лаб. иммунологии ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: №у1коуаЕУ@ехрте^гц https://orcid.org/0000-0002-9229-3677
Клепикова Арина Геннадиевна - эксперт лаб. иммунологии ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: klepikova@expmed.ru https://orcid.org/0009-0008-8018-0043
Authors' information
Evgeniya V. Shvedova - Chief Expert of the Immunology Lab. of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: NovikovaEV@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-9229-3677
Arina G. Klepikova - Expert of the Immunology Lab. of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: klepikova@expmed.ru https://orcid.org/0009-0008-8018-0043
Фадейкина Ольга Васильевна - канд. биол. наук, главный технолог ИЦЭК МИБП «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: fadeikina@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-8473-7442
Шведов Дмитрий Владимирович - канд. мед. наук, зам. начальника ИЦЭК МИБП «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: Shvedov@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-6945-4145
Борисевич Игорь Владимирович - д-р мед. наук, проф., зам. руководителя ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: borisevichiv@fmba.gov.ru https://orcid.org/0000-0002-0713-7419
Солдатов Александр Алексеевич - д-р мед. наук, начальник управления противовирусных МИБП «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: Soldatov@expmed.ru https://orcid.org/0000-0001-6624-2692
Olga V. Fadeikina - PhD, Chief Technologist of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: fadeikina@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-8473-7442
Dmitry V. Shvedov - PhD, Deputy Head of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Shvedov@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-6945-4145
Igor V. Borisevich - MD, PhD, Prof., Deputy Head of the FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: borisevichiv@fmba.gov.ru https://orcid.org/0000-0002-0713-7419
Aleksandr A. Soldatov - MD, PhD, Chief of the Dept. for Expertise of Antiviral MIBP, CEC MIBPs, SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Soldatov@expmed.ru https://orcid.org/0000-0001-6624-2692
