CC BY
14
УДК 616.932:576.809.7
А.В.Комиссаров, С.А.Еремин, А.Ю.Ульянов, Ю.А.Алешина, А.К.Никифоров, Ю.Г.Васин,
О.Д.Клокова, Н.И.Белякова
РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕХНОЛОГИИ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ ШТАММА ViBRiO CHOLERAE 569В ИНАБА МЕТОДОМ ТАНГЕНЦИАЛЬНОЙ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Разработана экспериментальная технология концентрирования протективных антигенов штамма Vibrio cho-lerae 569В Инаба (холерогена-анатоксина и О-антигена) методом тангенциальной ультрафильтрации. Проведена оптимизация технологического процесса концентрирования. Данная технология позволяет получать компоненты холерной вакцины, соответствующие нормируемым требованиям.
Ключевые слова: холерная вакцина, холероген-анатоксин, О-антиген, концентрирование, тангенциальная ультрафильтрация.
A.V.Komissarov, S.A.Eremin, A.Yu.Ul'yanov, Yu.A.Aleshina, A.K.Nikiforov, Yu.G.Vasin, O.D.Klokova, N.I.Belyakova
Development of the Experimental Technology for Protective Antigens
of Vibrio cholerae 569B Inaba Concentration by Means of Tangential Ultrafiltration
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Worked out is the experimental technology for protective antigens of Vibrio cholerae 569 B Inaba (cholera-anatoxin and O-antigen) concentrating by means of tangential ultrafiltration. Optimization of concentrating technological process is carried out. This technique makes it possible to obtain cholera vaccine components meeting all regulatory requirements.
Key words: cholera vaccine, cholera-anatoxin, O-antigen, concentrating procedure, tangential ultrafiltration.
Одним из недостатков существующей технологии производства вакцины холерной бивалентной химической, таблетированной является затратный и трудоемкий этап выделения нативных антигенов штамма Vibrio cholerae 569В Инаба. Данный недостаток обусловлен тем, что выделение О-антигена (О-АГ) и холерогена-анатоксина (ХА) проводят методом солевого осаждения сульфатом аммония непосредственно из детоксицированного безмикроб-ного центрифугата формалинизированной культуральной жидкости холерного вибриона, что приводит к его значительному расходу. Устранить указанный технологический недостаток возможно предварительным концентрированием безмикробного формалинизированного центрифугата. Нами ранее была показана возможность применения метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования одного из компонентов таблетированной холерной вакцины - О-АГ штамма V. cholerae М41 Огава из безмикробного центрифугата [2]. Поэтому исследования, направленные на внедрение в производственный процесс технологий концентрирования антигенных компонентов холерной химической вакцины, получаемых из штамма V. cholerae 569В Инаба тангенциальной ультрафильтрацией, имеют под собой определенную практическую основу и являются актуальными.
Целью данной работы являлась разработка экспериментальной технологии концентрирования О-АГ и ХА штамма V. cholerae 569В Инаба из без-
микробного центрифугата методом тангенциальной ультрафильтрации.
Материалы и методы
При выполнении работы использовали производственный штамм V. ско!ете 569В Инаба, продуцент ХА и О-АГ (Государственная коллекция патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб»), который выращивали при 37 °С в реакторе-ферментере Р170 объемом 250 дм3 на среде из ферментативного гидролизата казеина в условиях глубинного культивирования. Через 10 ч выращивание прекращали добавлением формалина до конечной концентрации 0,6 %. Для концентрирования О-АГ и ХА применяли установки для микро- и ультрафильтрации на базе фильтродержателя АСФ-009, снаряженной мембранными модулями с номинальной отсечкой по молекулярной массе (НОММ) 10, 20 и 50 кДа, с площадью фильтрации равной 0,1 м2 и Vivaflow-200 (производства фирмы Sartorшs, Германия) с мембранными модулями 30 и 100 кДа, с площадью фильтрации равной 0,02 м2. Критерием окончания процесса выбрано уменьшение объема безмикробного центрифу-гата в 10 раз. Активность О-АГ холерного вибриона определяли в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) по Оухтерлони и реакции непрямой агллютинации (РНГА) с О1-сывороткой. Активность ХА холерного вибриона устанавливали в РИД с антихолерогенной сывороткой (АХС) и по единицам связывания ана-
Таблица 1
Указатели, ^лученные при кoнцентрирoвaнии с испoльзoвaнием мембраииых мoдулей с различными НОММ
Значение показателя, полученного нри использовании мембранного модуля с HOMM, кДа
Показатель 10 20 30 50 100
Ц Ф К Ц Ф К Ц Ф К Ц Ф К Ц Ф К
Активность О-АГ в РИД с О1-сывороткой, обратный титр 4 0 64 4 0 64 4 0 64 4 0 64 4 0 64
Активность ХА в РИД с АХС, обратный титр 2 0 32 2 0 32 2 0 32 2 0 32 2 1 4
Средняя удельная скорость фильтрации, дм3/м2/час 13 21 34 39 62
Примечание. Ц - безмикробный центрифугат, Ф - фильтрат, К - концентрат.
токсина (ЕС), определенным при подкожном введении препарата кроликам массой (2,7±0,25) кг.
Результаты и обсуждение
Первый этап работы был связан с оценкой возможности использования мембран с различными НОММ для концентрирования ХА и О-АГ. В предварительных экспериментах процесс ультрафильтрации проводили при давлении на входе и выходе фильтрационной установки равными (1,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно и температуре проведения процесса - (8±2) °С. Объемы безмикробно-го центрифугата составляли по 10,0 дм3. Среднюю удельную скорость фильтрации определяли по объему фильтрата, удаленному за промежуток времени от начала до окончания процесса концентрирования. Результаты данного этапа исследований, представленные в табл. 1, показывают, что использование мембранного модуля с НОММ 100 кДа для концентрирования нецелесообразно, так как значительная часть ХА проходит в фильтрат. При использовании других мембранных модулей для концентрирования безмикробных центрифугатов содержание О-АГ и ХА в концентрате увеличивается в 16 раз, при этом О-АГ и ХА в фильтрате не обнаруживается. Наибольшая средняя удельная скорость фильтрации определена при использовании мембранного модуля с НОММ 50 кДа, что дало нам основание выбрать его для проведения дальнейших исследований.
Для определения возможной сорбции ХА и
O-АГ внутри пор мембранных модулей проводили их отмывку путем рециркуляции через установку дистиллированной воды объемом 0,5 дм3 в течение 60 мин. Промывочную воду исследовали на наличие ХА и O-АГ путем постановки РИД. В промывочной воде ХА и O-АГ не обнаружены, что дает основание предполагать, что они не сорбируются на мембранных модулях.
Выделение протективных антигенов из безми-кробных центрифугатов, подвергнутых концентрированию, проводили с использованием ряда последовательно выполняющихся операций:
осаждение балластных фракций сернокислым аммонием при 37 % насыщении, после формирования осадка при комнатной температуре в течение ночи материал центрифугировали на центрифуге Beckman при 10000 g_в течение 20 мин;
осаждение ХА и O-АГ из полученного центрифугата сернокислым аммонием при 80 % насыщении, после формирования осадка при комнатной температуре в течение ночи материал центрифугировали на центрифуге Beckman при 10000 g в течение 20 мин;
диализ полученного осадка против дистиллированной воды;
стерилизация отдиализованного осадка путем фильтрации через мембраны с размером пор 0,2 мкм и лиофилизация.
Выделение протективных антигенов из безми-кробного центрифугата, не подвергавшегося концентрированию, проводили как описано выше, за исключением проведения процесса центрифугирования,
Таблица 2
Сравнительные сказатели сухих препаратов О-Ar и XA, улученных no регламентуй теxнoлoгии и с испoльзoвaнием мембранных мoд;улей с различными НОММ
Показатель Значение показателя, полученного но Нормируемое значение показателя
регламентной технологии экспериментальной технологии нри использовании мембран с HOMM, кДа
10 20 30 50
Oбъем безмикробного центрифугата, дм3 550 10 10 10 10 -
Активность препарата:
по ЕС 6000 6000 5500 6000 6000 >2000
в РНГА с O1-сывороткой, обратный титр 256 252 300 264 264 >100
Вес препарата, г 122 2,5 2,6 2,5 2,4 “
Примечание. «-» - требования отсутствуют.
Таблица 3
Сравнительные показатели сухих препаратов О-АГ и ХА, полученных при различных температурах фильтрации
и по регламентной технологии
Значение показателя, нолученного но
Показатель регламентной экспериментальной технологии нри различных температурах фильтрации, °C Нормируемое значение показателя
20±2 37±2
Активность препарата
по ЕС 6000
в РНГА с О1-сывороткой, обратный титр 256
осуществляемого на производственной центрифуге СГО-100 при 15000 g. Определенные показатели качества сухих препаратов представлены в табл. 2.
Анализируя данные, представленные в табл. 2, можно сделать выводы, что значения показателей сухих препаратов О-АГ и ХА, приготовленных по экспериментальной технологии, соответствуют нормируемым и значимо не отличаются друг от друга, а выход (по соотношению веса сухого полуфабриката на объем безмикробного центрифугата) незначительно превышает значения показателей препаратов О-АГ и ХА, полученных по регламентной технологии. Следует отметить, что в реализованном эксперименте количество сульфата аммония, затраченного на осаждение по регламентному способу, составило 334,4 кг, а по предлагаемому - 0,608 кг, т.е. в 10 раз меньше, исходя из объемов препаратов, подвергаемых осаждению.
Ранее нами [2] было показано, что процесс ультрафильтрации возможно интенсифицировать путем проведения процедуры «сканирования» давления. Для повышения эффективности процесса концентрирования ХА и О-АГ были проведены исследования по выбору рационального соотношения давления на входе и выходе фильтрационной установки. Проведенные исследования показали, что оптимальными параметрами для концентрирования ХА и О-АГ являются давление на входе равное (2,5±0,1) и на выходе (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно, что совпало с обоснованными параметрами при концентрировании О-АГ штамма V ско1егав М-41 Огава [1]. Установленные параметры позволили увеличить среднюю удельную скорость фильтрации с 39 до 58 дм3/м2/час при сохранении показателей качества определенных ранее.
В ряде работ [1, 3, 4] показано, что с повышением температуры скорость процесса фильтрации возрастает. В связи с этим для дальнейшей оптимизации процесса фильтрации, важное значение приобретали исследования по изучению температурных режимов концентрирования и их влияния на качество полупродуктов.
Дополнительно к ранее исследованному процессу фильтрации при температуре (8±2) °С, апробировано два температурных режима проведения концентрирования ХА и О-АГ - (20±2) и (37±2) °С. Средняя удельная скорость фильтрации составила: при температуре (20±2) °С - 56 дм3/м2/ч и (37±2) °С -
6000 6500 >2000
264 256 >100
72 дм3/м2/ч. Активность лиофилизированных препаратов, как следует из данных табл. 3, полученных в эксперименте, соответствовала нормируемым значениям и существенно не отличалась от активности препаратов, полученных по регламентной технологии.
Таким образом, нами разработана экспериментальная технология концентрирования ХА и О-АГ штамма V. ско1егае 569В Инаба из безмикробного центрифугата методом тангенциальной ультрафильтрации, которая позволяет снизить количество сульфата аммония, используемого для осаждения до 10 раз и получать препараты с показателями качества, отвечающими требованиям нормативной документации. Является перспективным применение разработанной технологии в производственном процессе получения вакцины холерной бивалентной химической таблетированной.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. М.: Химия; 1995. 252 с.
2. Комиссаров А.В., Еремин С.А., Алешина Ю.А. и др. Экспериментальная оценка использования метода ультрафильтрации по принципу «кросс-флоу» для концентрирования О-антигена в производстве холерной бивалентной химической вакцины. Пробл. особо опасных инф. 2011; 2(108):83-5.
3. Комиссаров А.В., Комоско Г.В., Лещенко А.А. и др. Изучение процесса стерилизующей фильтрации жидкого про-тивосибиреязвенного лошадиного глобулина. Биотехнология. 2002; 2:66-74.
4. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. Л.: Химия; 1991. 239 с.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Dytnersky Yu. I. [Membrane processes of liquid-mixture separation]. Moscow: Khimiya; 1995. 252 p.
2. KomissarovA.V, Eremin S.A., Aleshina Yu. A., Vasin Yu.G., Klokova O.D., Belyakova N.I. [Experimental evaluation of application of “cross-flow” ultrafiltration method for O-antigen concentrating in cholera chemical bivalent vaccine production]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2011; 2(108):83-5.
3. Komissarov A.V, Komosko G.V., Leshchenko A.A. et al. [Study of sterilization filtration process of the liquid anti-anthrax equine globulin]. Biotechnology. 2002; 2:66-74.
4. Cherkasov A.N., Pasechnik VA. [Membranes and sorbents in biotechnology]. Leningrad: Khimiya; 1991. 239 p.
Authors:
Komissarov A.V., Eremin S.A., Ul'yanov A.Yu., Aleshina Yu.A., Nikiforov A.K., Vasin Yu.G., Klokova O.D., Belyakova N.I. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: microbe@san.ru
Об авторах:
Комиссаров А.В., Еремин С.А., Алешина Ю.А., Никифоров А.К., Васин Ю.Г., Клокова О.Д., Белякова Н.И., Ульянов А.Ю. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru
Поступила 20.10.10.
