CC BY
14УДК 582.282.123.4:611.24
РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ИНВАЗИВНОГО АСПЕРГИЛЛЁЗА ЛЁГКИХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ASPERGILLUS FUMIGATUS
Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), 1Босак И.А. (с.н.с.), 1Богомолова Т.С. (зав. лаб.)*, 1Выборнова И.В. (н.с.), 1Филиппова Л.В. (с.н.с.), 1Учеваткина А.Е. (с.н.с.), Степанова А.А. (зав. лаб.), 1Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), 1Чилина Г.А. (зав. лаб.), 2Еремина Н.В. (руководитель проекта) 1 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург; 2 ООО «Панацела Лабс», Москва, Россия
©Коллектив авторов, 2016
Инвазивный аспергиллез легких (ИАЛ) - тяжелая микотическая инфекция, развивающаяся у пациентов с иммуносупрессией после длительного применения кортикостероидов или цитостатиче-ских препаратов. В статье представлены результаты разработки модели ИАЛ при интраназальном способе заражения мышей линии BALB/C в состоянии нейтропении после введения цитостатиче-ского препарата (циклофосфан). Оптимизирована схема введения циклофосфана для индукции и поддержания нейтропении, выбран штамм возбудителя и определена эффективная заражающая доза, получено культуральное и гистологическое подтверждение развития инфекции.
Ключевые слова: Aspergillus fumigatus, инвазивный аспергиллез легких, нейтропения, цитостатическая полихимиотерапия, штамм, экспериментальная модель
ELABORATION OF INVASIVE PULMONARY ASPERGILLOSIS EXPERIMENTAL MODEL USING ASPERGILLUS FUMIGATUS CLINICAL ISOLATES
1Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the chair), 1Bosak I.A. (senior scientific collaborator), 1Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 1Vybornova I.V. (scientific collaborator), 1Filippova L.V. (senior scientific collaborator), 1Uchevatkina A.E. (senior scientific collaborator), 1Stepanova A.A. (head of the laboratory), 1Avdeenko Yu.L. (senior scientific collaborator), 1Chilina G.A. (head of the laboratory), 2Eremina N.V. (project manager)
1 Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg; 2 OOO «Panacela labs», Moscow, Russia
©Collective of authors, 2016
Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a severe fungal disease observed in immunocompromised patients after prolonged corticosteroid or cytostatic therapy. We present results of elaboration of IPA model based on
Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна, Тел.: (812) 510-62-69
the intranasal inoculation of cyclophosphane-induced neutropenic BALB/C mice. Original scheme of cyclophosphane injection is described. Optimal fungal strain and inoculation dose were selected. Development of the infection was confirmed by culture and histological studies.
Key words: Aspergillus fumigatus, cytostatic polychemotherapy, experimental model, invasive pulmonary aspergillosis, neutropenia, strain
Грибы рода Aspergillus широко распространены в природе: в почве, на остатках гниющих растений. Условно-патогенные Aspergillus spp., прежде всего, A. fumigatus и A. flavus, являются частыми возбудителями нозокомиальных грибковых инфекций [Блинов Н.П. и др. // Проблемы мед. микологии. - 2002. - Т. 4, №1]. Споры (конидии) из-за их небольшого размера (диаметр 2-3 мкм) легко могут проникать в альвеолы легких. У здоровых людей конидии эффективно элиминируются макрофагами и нейтрофилами, у иммунокомпроме-тированных - ингаляция конидий аспергиллов может привести к развитию инфекции; при этом происходит трансформация конидий (прорастание) в гифы, которые поражают ткань.
Методы лечения микотических заболеваний не всегда достаточно эффективны. Общая и атрибутивная летальность при инвазивных микозах выше, чем при аналогичных бактериальных или вирусных инфекциях. Возрастает частота случаев развития устойчивости возбудителей ИАЛ к противогрибковым препаратам, в том числе новым [1].
Количество противогрибковых препаратов, эффективных в отношении возбудителей аспергиллеза, на рынке ограничено, при этом отечественных препаратов нет. В связи с этим необходимо продолжать научные исследования в области создания новых эффективных антифунгальных препаратов. Разработка и доклинические испытания новых антимикотических препаратов невозможны без использования экспериментальных моделей на лабораторных животных. Отметим, что отечественные руководства по доклиническому изучению новых фармакологических веществ не содержат описаний экспериментальных in vivo моделей инвазивных микозов лёгких [2]. В зарубежных научных источниках приведены различные модели экспериментального ИАЛ с применением разных схем индукции нейтропении и методов заражения животных [3-6], однако, их эффективность недостаточно апробирована. Представляется актуальным создание модели ИАЛ с выбором оптимальной схемы индукции нейтропении и использованием штаммов A. fumigatus, выделенных от пациентов в России.
Цель работы - разработать экспериментальную модель инвазивного аспергиллеза легких, вызванного наиболее частым возбудителем - A. fumigatus.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. Для проведения исследования были выбраны самцы линейных мышей BALB/С весом 18-22 г [4]. Животные были адаптированы/акклиматизированы в лаборатории в течение 7 дней.
Выбор схемы введения циклофосфана. С целью достижения необходимой и стабильной нейтропении было проведено сравнение трёх схем введения цикло-фосфана животным [4-7] с определением количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы крови. Подсчет форменных элементов крови проводили в камере Горяева в мазках крови мышей, предварительно окра-
шенных по Паппенгейму-Крюкову. Лейкоцитарную формулу рассчитывали на 200 лейкоцитов.
Для выбора оптимальной схемы индукции нейтро-пении сформировали три группы животных:
Группа 1 - внутрибрюшинно вводили циклофос-фан в дозе 200 мг/кг в -3, 0 и 1 дни эксперимента (0 день - день заражения).
Группа 2 - внутрибрюшинно вводили циклофос-фан в дозе 150 мг/кг в -3, 0 и 3 дни эксперимента.
Количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу периферической крови животных обеих групп определяли непосредственно перед первым введением цикло-фосфана, затем каждые трое суток в течение 14 дней.
Группа 3 - внутрибрюшинно вводили циклофос-фан в дозе 150 мг/кг в -3, 0, 4-й и 8-й дни эксперимента. Определение количества лейкоцитов и лейкоцитарную формулу периферической крови экспериментальных животных проводили:
- перед первым введением циклофосфана (-3 день эксперимента);
- через 4 часа после второго введения циклофосфа-на (0 день эксперимента);
- далее перед введением циклофосфана на 4-й и 8-й дни эксперимента.
Культуры грибов. В исследовании использовали 5 штаммов А. fumigatus: РКПГ Б 1172, 1248, 1267, 1277, 1384 из «Российской коллекции патогенных грибов» НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова. Все штаммы А. fumigatus были выделены из бронхоальвеолярного лаважа пациентов с инвазивным аспергиллезом легких; видовую идентификацию аспергиллов подтверждали методом ДНК-секвенирования.
Процедура заражения животных. Для заражения животных готовили взвеси конидий из трехсуточных культур А. fumigatus на агаризованной среде Сабуро в чашках Петри, смывая с поверхности стерильным 0,85% раствором хлорида натрия. После количественного подсчета конидий в камере Горяева густоту взвеси доводили до концентраций 1-105, 1-106, 1-107, 1-108 КОЕ/мл. Животным, наркотизированным диэтиловым эфиром и подготовленным к заражению (введение ци-клофосфана по схеме), интраназально вводили 0,05 мл взвеси конидий грибов.
В целях получения сведений об эффективности используемого метода заражения в исследование была введена контрольная группа из 5-ти мышей, которым интраназально вводили 0,05 мл взвеси конидий штамма А. fumigatus РКПГ Б 1267 концентрацией 4,2-106 КОЕ/мл. В качестве критерия оценки эффективности метода заражения использовали результаты культу-рального исследования легких лабораторных животных (количество жизнеспособных клеток микромице-та на грамм ткани легкого) через 2 часа после интрана-зального заражения.
Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней, ежедневно регистрировали количество погибших мышей.
Подтверждение развития инвазивного аспергилле-за легких. У погибших животных в день гибели извлекали оба легких для гистологического и культураль-ного исследований. У выживших животных материал для гистологического и культурального исследований отбирали в день окончания эксперимента (14-й день).
Для гистологического исследования кусочки легкого мыши фиксировали в 10% растворе забуференного формалина. Материал проводили через серию изо-пропилового спирта и гистомикса с помощью гистологического процессора марки Tissue-Tek@ VIP. Затем образец, пропитанный гистомиксом, переносили в заливочную станцию для изготовления парафиновых блоков, с которых на санном микротоме Slide 2003 получали серийные срезы толщиной 3 мкм. После удаления гистомикса ксилолом срезы окрашивали гематоксилин-эозином, по Гомори-Грокотт и PAS-методом. После заключения в среду Bio Mount срезы исследовали с фотофиксацией и морфометрией в световом микроскопе Leica DM LB2 (Германия) при увеличениях 100х, 400х.
Для культурального исследования биоматериал от каждого животного изучали следующим способом. Легкое взвешивали в стерильных условиях и измельчали в гомогенизаторе, в полученную массу добавляли 1 мл стерильного 0,85% раствора хлорида натрия и готовили ряд 10-ти кратных серийных разведений с высевом 0,1 мл на плотную питательную среду Сабуро в чашках Петри.
Чашки Петри инкубировали при температуре 37 оС в течение 3 суток. Подсчитывали количество выросших колоний гриба и рассчитывали количество жизнеспособных клеток гриба на единицу массы исследуемого легкого (КОЕ/г).
Выделенные культуры грибов идентифицировали по морфологическим и физиологическим признакам согласно определителям грибов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Сравнение различных схем введения циклофосфана для индукции и поддержания стабильной нейтро-пении у мышей.
При выборе экспериментальной модели нейтропе-нии на мышах использовали 2 дозы введения цикло-фосфана: группа 1 - 200 мг/кг, группа 2 - 150 мг/кг. До введения препарата, при исследовании лейкоцитарной формулы, в обеих группах были получены сопоставимые результаты, соответствующие реферативным нормам абсолютного количества лейкоцитов и нейтрофи-лов для мышей. В группе 1 количество лейкоцитов составило 10,17±2,35-109/л, нейтрофилов -3,03±0,38-107 л, в группе 2: лейкоцитов - 13,8±1,99-109/л, нейтрофилов - 4,38±0,82-109/л.
Согласно обеим схемам, лейкопения и нейтропения у мышей развились уже после первого введения препарата. В момент заражения экспериментальных групп животных количество лейкоцитов у мышей из группы 1 составило 1,6-109/л, нейтрофилов - 0,37±0,09-109/л, в группе 2: лейкоцитов -2,27±0,54-109/л, нейтрофилов -0,39±0,05-109/л.
В группе 1 на шестой день после первого введения циклофосфана у мышей развился агранулоцитоз: количество лейкоцитов снизилось до 0,57±0,13-109/л, нейтрофилов - до нуля. Данное состояние привело к гибели 6 экспериментальных животных. У оставшихся 3 мышей на 9 день после первого введения препарата произошло полное восстановление показателей крови до нормальных значений.
На основании полученных в ходе эксперимента данных было принято решение отказаться от схемы
введения циклофосфана, примененной в группе 1.
В группе 2 использовали циклофосфан в меньшей дозе (150 мг/кг), кратность введения - 3 раза (-3; 0; +3 день эксперимента). Состояние агранулоцитоза развилось на 9 день после первого введения препарата (количество лейкоцитов - 0,57±0,13-109/л при отсутствии нейтрофилов в мазках крови), восстановление нормальных показателей крови произошло на 12 день. В группе погибло 1 животное.
Сопоставив полученные результаты, определили оптимальную дозу циклофосфана - 150 мг/кг. Для исключения развития агранулоцитоза и формирования более длительного состояния адекватной нейтропении мы применили новую схему введения циклофосфа-на: четырёхкратно в -3, 0, +4 и +8 день эксперимента. При исследовании крови животных данной группы до первого введения циклофосфана количество лейкоцитов (Ы±ш) составило 10,13±1,36- 109/л, нейтрофилов - 2,36±0,15-109/л. В день заражения количество их снизилось до 1,7±0,21 и 0,43±0,07-109/л соответственно. На 4-ый и 8-ой дни эксперимента показатели продолжали находиться ниже нормы (2,03±0,15 и 0,28±0,02-109/л) и (1,1±0,06 и 0,22±0,01-109/л), а к 12-ому дню эксперимента составили 11,2±5,72 и 6,40±3,12-109/л.
Выбор оптимальной заражающей дозы и штамма A. fumigatus.
Была проведена серия экспериментов по оценке выживаемости мышей при интраназальном введении различных штаммов и доз А. fumigatus.
Динамика гибели мышей после заражения суспензиями спор различных штаммов А. fumigatus с концентрацией 106 КОЕ/мл показана на рисунке 1. Максимальную гибель животных через 14 дней после заражения вызвал шт. 1267 (выжило 2 мыши из 10). После заражения шт. 1384 к этому сроку выжило 4 мыши, при заражении остальными штаммами - по 5 животных.
о 1172 — а * —1248
^ -«-ни-»--« Х- 1277 -*-1384
\ N \\ х »■« н |1 а а \с^ " \ \
\ \ х --х- -
д— -Д — £1 — Й
Рис. 2. Динамика гибели мышей после интраназального введения суспензий спор штамма А. ^туа^з № 1267 различных концентраций.
При введении суспензии спор гриба в максимальной концентрации (108 КОЕ/мл) через 4 дня после заражения погибали 6 из 7 мышей (86%). На 14 сутки после заражения этой дозой выживало 1 животное. Интраназальное введение суспензии с минимальной концентрацией клеток гриба (105 КОЕ/мл) приводило к гибели 86% мышей через 10 дней после инфицирования. Гибель 100% животных в течение периода наблюдения отмечали только при использовании спор гриба в концентрации 106 КОЕ/мл на 8 сутки после введения.
На рисунке 3 представлены кривые выживаемости мышей после интраназального заражения штаммами А. fumigatus №№1267, 1277, 1384 при введении суспензий в двух концентрациях (107 и 108 КОЕ/мл). Выживаемость животных закономерно снижалась с увеличением заражающей дозы. Для разработки экспериментальной модели была отобрана оптимальная динамика гибели животных в группе А. fumigatus № 1384 с концентрацией 107 КОЕ/мл (гибель 60% животных с 6 по 14-е сутки эксперимента).
-3-2-10 1 2 3 Л 5 в 7 й в 10 11 12 13 14 15 16 17 1В
Рис. 1. Выживаемость мышей после интраназального введения суспензий спор с концентрацией 106 КОЕ/мл пяти штаммов А. ^туа^з.
Кривые выживаемости животных после интрана-зального заражения различными дозами возбудителя (штамм А. fumigatus № 1267) приведены на рисунке 2.
Рис. 3. Динамика гибели мышей после интраназального заражения мышей тремя штаммами А. ^туаШз, концентрация суспензии спор 107-108 КОЕ/мл.
Культуральное и гистологическое подтверждение инфекции.
В результате культурального исследования лёгких погибших животных были получены данные, подтверждающие наличие микотической инфекции в количественном выражении (табл.).
Наиболее выраженная гистологическая картина аспергиллеза легких получена при использовании штаммов А. fumigatus 1267, 1277, 1384 при интрана-зальном введении суспензии в концентрации 108 КОЕ/ мл. При этом в тканях легких всех исследованных мышей выявлены многочисленные очаги роста грибов (более 10 очагов в срезе).
Крупные участки разрастания септированного мицелия гриба имели место в стенках бронхов с пере-
ходом на альвеолы, межальвеолярные перегородки с разрушением ткани и прорастанием в сосуды. Отмечали наличие хаотичного и радиального роста мицелия (Рис. 4). В отдельных случаях наблюдали конидиаль-ные головки. Воспалительная реакция в ткани легких очаговая, скудная, в основном, представлена макрофагами, лимфоцитами и нейтрофилами.
Рис. 4. Гистологическое исследование лёгкого мыши, погибшей на 6-й день после заражения А. ^туаШз РКПГ F 1384. Ув. 400х. Окраска по Гомори-Грокотт.
Сравнительная характеристика пяти штаммов A. fumigatus по признакам, отражающим инфекционный процесс.
На основании анализа полученных данных штаммы 1172 и 1248 были исключены из дальнейших экспериментов по моделированию аспергиллеза, а именно: перечисленные штаммы обладали более низкой вирулентностью при интраназальном введении и более низкой высеваемостью из легких животных. Кроме того, штамм 1172 проявлял слабую интенсивность спо-роношения, что составляло сложность при приготовлении инокулюма. Дальнейшие эксперименты с интра-назальным заражением проводили с использованием штаммов 1267, 1277 и 1384.
В таблице приведены параметры, характеризующие выраженность экспериментального аспергилле-
за при интраназальном заражении суспензиями трех штаммов A. fumigatus.
Таблица
Показатели инфекционного процесса при интраназальном заражении мышей суспензиями штаммов А. ^т1да^э в концентрациях 107 и 108 КОЕ/мл
Выживаемость мышей (количество выживших животных, 14 дней) Высев A. fumigatus из легких (КОЕ/г; M±m) Результаты гистологических исследований при заражении суспензией 1-108 КОЕ/мл
Штамм концентрация введенной суспензии клеток гриба
1-107 1-108 1-107 (7-14 день) 1-108 (3-6 день) количество мышей с очагами аспергиллеза в легких/ количество исследований количество очагов в срезе
1267 9 6 7580 105000± 65000 2/4 +++*
1277 9 1 17200 56777± 19049 9/9 +++
1384 4 2 102000± 82451 98375± 32775 8/8 +++
*+++ - > 10 очагов в срезе
Наибольшую вирулентность при интраназальном заражении суспензией 1-107 КОЕ/мл проявил штамм A. fumigatus РКПГ F 1384 (наибольшая гибель животных и обсемененность ткани легких). Учитывая, что штамм 1384 также обладает наиболее интенсивным спороно-шением на агаризованной среде Сабуро, он был выбран нами как оптимальный для моделирования инва-зивного аспергиллеза легких.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Разработана модель инвазивного аспергиллеза легких, обусловленного Aspergillus fumigatus.
2. Рекомендованы оптимальная схема введения циклофосфана для создания иммуносупрессии (доза 150 мг/кг четырёхкратно), эффективная концентрация инокулюма (107 КОЕ/мл), штамм A. fumigatus РКПГ F 1384 и способ введения (интраназальное введение) для моделирования экспериментального аспергиллеза у мышей линии BALB/С.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Verweij P., Howard S., Melchers W., Denning D. Azole-resistance in Aspergillus: proposed nomenclature and breakpoints// Drug Resist. Updat. - 2009. - Vol. 12. - P. 141-147.
2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч.1. - М: Гриф и К, 2012. - 944 с.
3. Nagasaki Y., Eriguchi Y., Uchida Y., et al. Combination therapy with micafungin and amphotericin B for invasive pulmonary aspergillosis in an immunocompromised mouse model //J. of Antimicrobial Chemotherapy. - 2009. - Vol. 64. - P. 379-382.
4. Mitsuyama J., Nomura N., Hashimoto K., et al. In vitro and in vivo antifungal activities of T-2307, a novel arylamidine //Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2008. - Vol. 52. - P. 1318-1324.
5. Sheppard D., Rieg G., Chiang L., et al. Novel inhalational murine model of invasive pulmonary aspergillosis // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2004. - Vol. 48. - P. 1908-1911.
6. Stephens-Romero S., Mednick A., Feldmesser M. The pathogenesis of fatal outcome in murine pulmonary aspergillosis depends on the neutrophil depletion strategy//Infection and Immunity. - 2005. - Vol. 73. - P. 114-125.
Поступила в редакцию журнала 09.12.2016
Рецензент: Н.Н. Климко
