CC BY
267
БИОТЕХНОЛОГИЯ
РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНОЙ СИСТЕМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ PAULOWNIA SHAN TONG (P. FORTUNE! X P. TOMENTOSA)
1 2 Б.В. Шурганов , Я.В. Мишуткина ,
2
Я.Б. Нескородов
!Кафедра ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8/2, Москва, Россия, 117198
2Лаборатория системной биологии Центр «Биоинженерия» РАН пр-т 60-летия Октября, 7/1, Москва, Россия, 117312
Проведено исследование регенерационной способности различных типов эксплантов (сегменты листьев, черешков, междоузлий и узлов), а также проведена оценка влияния разных концентраций (от 1 до 10 г/мл) различных регуляторов роста растений (ТДЗ, БАП, ИУК) на частоту регенерации павловнии Раulоwniа Tong. Показано, что узловые экспланты обладают более сильной регенерационной способностью по сравнению с другими типами эксплантов, а ТДЗ наиболее эффективно индуцирует побегообразование, чем БАП. Добавление к цитокининам низких концентраций ауксина способствует лучшему развитию побегов. Оптимальное соотношение ауксин/цитокинин в среде для регенерации — 1/10. При таком соотношении наблюдается наибольшая частота образования адвентивных побегов. Оптимизированные в представленной работе способы регенерации побегов Раulowmа То^ могут быть использованы для эффективного микроразмножения in vito, а так-
же для генетической трансформации.
Ключевые слова: Раulowniа То^, клональное микроразмножение, прямая регенерация растений, узловые экспланты, культура клеток и тканей.
Павловния (Раulowniа 8рр.) — одна из самых быстрорастущих древесных культур, способная достигать 20—25 м в возрасте десяти лет [1; 3; 6]. Древесина павловнии прочная, легкая по весу и широко применяется в различном производстве [2; 5; 8]. Из-за способности этого дерева к быстрому росту оно используется для восстановления лесных массивов и биоремедиации [13—16]. Каждое из этих направлений чрезвычайно интересно, так как из-за высокого темпа потребления древесины за последние 100 лет лесные массивы сильно истощились [18], а это, в свою очередь, приводит к изменению климата, нарастающему опустыниванию, засолению почв и снижению биоразнообразия.
В настоящее время потребление древесины не только не снизилось, но и немного выросло по причине того, что выросли потребности целлюлозно-бумажной промышленности [18]. Эффективное и экологически рациональное лесное хозяйство способно существенно уменьшить скорость и масштабы этого негативного процесса посредством создания плантаций древесных пород. До недавнего времени основным методом создания таких плантаций являлось искусственное восстановление семенами. Главные недостатки данных подходов — генетическая пестрота получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. Другой подход — вегетативное размножение — позволяет сохранить генотип материнского растения и сократить продолжительность ювенильного периода.
Однако не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом. Методы культуры клеток и тканей, такие как клональное микроразмножение, органогенез и соматический эмбриогенез, представляют собой вегетативный способ размножения растений in vitro. Растения, полученные путем клонального микроразмножения, органогенеза или соматического эмбриогенеза, практически не имеют признаков сомаклональной вариации, что обеспечивает генетическую стабильность клонов [6; 11].
Таким образом, эти методы представляют собой эффективную технологию размножения растений, позволяющую сохранять лучший генетический материал, который может быть использован для создания плантаций древесных пород [10]. В контексте повышенного спроса на промышленную древесину производство плантаций является актуальным, а благодаря клональному микроразмножению можно получить популяцию генетически выравненных деревьев, что позволит точно прогнозировать динамику развития плантаций.
Существует несколько видов павловнии, а также ряд межвидовых гибридов. Разработанные протоколы для регенерации побегов павловнии, использующие различные типы экплантов, соотношения и концентрации регуляторов роста растений, показали зависимость данного процесса от генотипа [4; 7; 9]. Бергманн и Мун в своем исследовании показали, что вариабельность клонов, даже в пределах одного генотипа, довольно высока [3]. Это указывает на необходимость корректировки состава среды для каждого используемого генотипа, чтобы максимизировать производство адвентивных побегов.
Объект и методика исследования. Для наших исследований мы выбрали морозостойкий китайский гибрид — Раulоwniа БЪап long. Данный гибрид выдерживает понижение температуры до -25 °С, он также менее требователен к увлажнению и обладает высокой устойчивостью к болезням. До сегодняшнего дня не было опубликовано данных об эффективности регенерации побегов данного гибрида. В работе использовали коллекцию растений Павловнии (Раulowniа) гибрида Шанг Тонг (Shаn То^), культивируемую in vitro, любезно предоставленную проф. д.б.н. А. Тураевым (Биологический факультет, МГУ им. Ломоносова).
Донорные асептические растения павловнии Шанг Тонг культивировали при температуре 23—25 °С, с 16 часовым фотопериодом (16/8 — день/ночь). Для освещения использовали лампы Osram L36/77 FLUORA и F36W/33 Соо1 White. В состав всех питательных сред входили макро- и микросоли MS [12], витамины В-5,
30 г/л сахарозы, 500 мг/л гидролизата казеина, 7 г/л агара и регуляторы роста растений (табл. 1). рН среды доводили до 5,7—5,8 перед автоклавированием. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве при давлении 1,2 атмосферы в течение 15 минут.
Таблица 1
Гормональный состав сред для культивирования эксплантов Павловнии in vitro
Гормоны Варианты сред для культивирования
1 2 3 4 5 6 7 8 9
БАП мг/л — 1 5 10 10 — — — —
ТДЗ мг/л — — — — — 1 5 10 10
НУК мг/л — — — — 1 — — — 1
Примечание: НУК — 1-нафтил-уксусная кислота, БАП — 6-бензиламинопурин, ТДЗ — тидиазурон.
Побеги с тремя-четырьмя парами листьев помещали в чашку Петри и скальпелем отсекали листья и черешки листьев. Оставшийся побег разрезали на узлы и междоузлия. Листья рассекали на фрагменты по 0,5 см2. Полученные экспланты помещали в чашки Петри (Р = 90 мм), содержащие 25 мл питательной среды, по 10 шт. на чашку. Частоту регенерации анализировали по прошествии 6—8 недель (в зависимости от типа экспланта). Пересадку проводили каждые две недели. В качестве контроля использовали экспланты, культивируемые на MS-среде без регуляторов роста растений в течение 6—8 недель.
Результаты экспериментов представлены в табл. 2, 3, 4. Статистическую обработку данных проводили с помощью теста критических диапазонов Дункана (р = = 0,05) [17] с заданным значением достоверности 95%.
Результаты и обсуждение. Как уже отмечалось, регенерация растений т ^1го при культивировании изолированных тканей зависит от взаимодействия таких факторов, как генотип исследуемого объекта, состав питательной среды и тип экс-планта. Основной целью данной работы было оценить регенерационный потенциал различных типов эксплантов Раulоwniа Shаn То^ в присутствии цитокини-нов (БАП и ТДЗ) в различных концентрациях и в сочетании с ауксинами (ИУК) (табл. 1). Нами была поставлена серия опытов, позволяющих выявить и установить некоторые закономерности процесса регенерации побегов из листьев, черешков листьев, узлов и междоузлий у данного гибрида.
Результаты нашего исследования показали, что прямая регенерация побегов при культивировании изолированных тканей павловнии т vi1го зависит прежде всего от типа экспланта.
При сравнении различных типов эксплантов было выявлено их различие в эффективности регенерации побегов. Так, на междоузлиях и черешках листьев наблюдалось единичное формирование побегов на местах срезов (рис. 2). На листовых эксплантах, вдоль жилок, происходило образование небольшого количества каллуса, в некоторых случаях с формированием единичных побегов (рис. 3). Наилучшим же типом экспланта, на котором наблюдалась множественная регенерация, являются узлы (рис. 1, 4, 5).
Наиболее эффективным регулятором роста оказался тидиазурон (табл. 2).
Рис. 1. Узловые экспланты, культивируемые на среде с 10 мг/л ТДЗ, с очагами образования множественной регенерации
Рис. 2. Черешки листьев, культивируемые на среде с добавлением ТДЗ 5 мг/л
Рис. 3. Нарезанные на сегменты листья, культивируемые на среде с добавлением ТДЗ 1 мг/л
Таблица 2
Влияние концентрации ТДЗ и типа экспланта на частоту регенерации павловнии
Взаимодействие факторов: Среднее значение частоты Гомогенные
1 (концентрация гормона, мг/л) х 2 (коэффициента) группы*
(тип экспланта) регенерации**
0хлистья 0 А
10хлистья 0 А
0 х черешки 0 А
0 х междоузлия 0 А
1 х междоузлия 0 А
10 х междоузлия 0 А
10 х черешки 0 А
Окончание
Взаимодействие факторов: 1 (концентрация гормона, мг/л) х 2 (тип экспланта) Среднее значение частоты (коэффициента) регенерации** Гомогенные группы*
5хлистья 0,00825 А
1хлистья 0,0145 А
5 х междоузлия 0,0225 А
1 х черешки 0,025 А
5 х черешки 0,075 А
0 х узлы 1,575 В
1 х узлы 1,6 В
5 х узлы 2,3375 В
10 х узлы 5,9 С
*Значения, обозначаемые одной буквой, существенно не отличаются друг от друга, при уровне достоверности р = 0,05; по тесту критического диапазона Дункана [17].
**Примечание: коэффициент регенерации рассчитывали как отношение числа образовавшихся побегов к общему числу эксплантов.
Так, частота регенерации узловых эксплантов, культивируемых на средах с содержанием этого цитокинина, была намного выше, нежели на средах, содержащих бензиламинопурин (табл. 3), особенно при добавлении относительно высоких концентраций ТДЗ (5 и 10 мг/л).
Таблица 3
Влияние концентрации БАП и типа экспланта на частоту регенерации павловнии
Взаимодействие факторов: Среднее значение частоты Гомогенные группы
1 (концентрация гормона, мг/л) х 2 (коэффициента) регенерации
(тип экспланта)
0 х листья 0 А
10 х черешки 0 А
0 х черешки 0 А
0 х междоузл. 0 А
1хлистья 0 А
5 х черешки 0 А
1 х черешки 0 А
5 х междоузл. 0 А
5 х листья 0 А
10хлистья 0,01 А
10 х междоузл. 0,03 А
1 х междоузл. 0,05 А
1 х узлы 1,35 В
0 х узлы 1,575 В
5 х узлы 1,7925 В
10 х узлы 1,8 В
Культивирование эксалантов на средах, содержащих соотношения цитоки-нинов с индолилуксуной кислотой (1 мг/л), приводило к заметному увеличению частоты регенерации (табл. 4). Наибольшая частота регенерации в вариантах с добавлением ИУК также наблюдалась на узловых эксплантах.
Рис. 4. Узловые экспланты, культивируемые на среде с 10 мг/л БАП
Таблица 4
Влияние концентрации БАП/ТДЗ; типа экспланта и наличия в составе среды ИУК на частоту регенерации павловнии
Взаимодействие факторов: Среднее значение частоты Гомогенные
1 (тип цитокинина) x 2 (тип экспланта) х 3 (коэффициента) регенерации группы
(отсутствие/наличие ИУК)
ТДЗ х листья х без ИУК 0 A
ТДЗ х междоузл. х без ИУК 0 A
БАП х черешки х без ИУК 0 A
ТДЗ х черешки х без ИУК 0 A
БАП х листья х без ИУК 0,01 A
ТДЗ х листья х с ИУК 0,015 A
БАП х листья х с ИУК 0,015 A
ТДЗ х междоузл. х с ИУК 0,02 A
БАП х междоузл. х без ИУК 0,03 A
БАП х черешки х с ИУК 0,125 A
БАП х междоузл. х с ИУК 0,45 A
БАП х узлы х без ИУК 1,8 A
БАП х узлы х с ИУК 2,475 A
ТДЗ х черешки х с ИУК 2,6 A
ТДЗ х узлы х без ИУК 5,9 В
ТДЗ х узлы х с ИУК 7,975 В
Таким образом, полученные нами экспериментальные результаты однозначно свидетельствуют о том, что узловые экспланты обладают более сильной регенера-ционной способностью по сравнению с другими типами эксплантов, использованными в нашей исследовательской работе.
Продемонстрировано, что образование побегов на эксплантах павловнии происходит главным образом под воздействием цитокининов. Была проверена эффективность применения различных цитокининов: БАП, тидиазуронкинетин. Результаты показали, что ТДЗ является наиболее эффективным для индукции множественной регенерации, чем БАП.
Рис. 5. Узловые экспланты, культивируемые на среде с ТДЗ и ИУК
Показано, что добавление к цитокининам низких концентраций ауксина способствует лучшему развитию побегов. Оптимальное соотношение ауксин/цито-кинин — V10. При таком соотношении наблюдается наибольшая частота образования адвентивных побегов.
Хорошая система регенерации может стать первым шагом к созданию эффективной системы генетической трансформации павловнии.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Miсhаеl Mаrсоtrigiаnо аnd Dеnnis Р. Stimаrt In vitro оrgаnоgеnеsis апё shüct ргоИегайоп üf Раи1с№ша tоmеntоsа stеud. (ешргезз ^ее). Pknt 8степсе Ьейеге, 31 (1983) 303—310.
[2] Ipekci Z., Ältinkut А., Kаzаn K., Bаjrоviс K., Gоzukirmizi N. High Frеquеnсy Pknt Я^евд-raticn from Nоdа1 Ехр1а^8 cf Раu1оwniа е1оngаtе. Ptant bid. 3 (2001) 113—115.
[3] Ben Ä. Bergmann and Heung-Kyu Мооп In vitro аdvеntiticus shооt рrcduсticn in Pаu1cwniа. P1аnt Се11 Rерcrts (1997) 16:315—319.
[4] Dimps Яао С., Сhоng-Jin Gоh, and Prakash Р. Kumar High lraq^^y аdvеntiticus shооt rеgеnеrаticn from ехсisеd 1еаvеs cf Pаu1оwniа 8рр. сu1turеd in vitrc Pknt. Се11 Rерcrts (1996) 16:204—209.
[5] Yang J.C., Chang S.H., Но C.K. Miсrcрrcраgаticn оf Pаu1cwniа tаiwаniаnа frcm mаturе tissuеs. Ann. Sd. Fcr. (1989) 46 suрр1., 165—167.
[6] ЯоШ G.R., Reddy G.M. and Das P. Studiеs оп in vitrc С1ота1 Prcраgаticn cf Pаu1cwniа tcmеntcsа stеud. аnd Еvа1uаticn cf Gеnеtiс Fidе1ity through RAPD Mаrkеr. Si1vае Оешйса 50, 208—212 (2001).
[7] Ben Ä. Bеrgmаnn Prcраgаticn mеthcd influеnсеs first yеаr fiе1d survivа1 аМ grcwth cf Ра^ 1cwniа. (1998) Nw Fcrеsts 16: 251—264.
[8] Ipekci Z., Gоzukirmizi N. Direct somatic embryogenesis and synthetic seed production from Paulownia elongate. Plant Cell Rep (2003) 22:16—24.
[9] Bergmann B.A. and Whetten R. In vitro rooting and early greenhouse growth of micropropagated Paulownia elongata shoots. New Forests 15: 127—138, 1998.
[10] Li Х. Y., Huang F.H., Murphy J.B., Gbur Е.Е. Somatic embryogenesis in loblolly pine (Pinus taeda L.). Tree Planters' Notes 47(2):246—250; 1996.
[11] Grossnickle S.C., Cyr D., Polonenko D.R. Somatic Embryogenesis Tissue Culture for the Propagation of Conifer Seedlings: А Technology Comes of Age. Tree Planters' Notes 47(2):48—57; 1996.
[12] Murashige T. A Reviced Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Cultures / T. Murashige, F. Skooge // Physiol. Plant. 1962.
[13] Bergmann B.A., Rubin A.R., Campbell C.R. // Transactions of the Asae. General edition, november/december. 1997. Vol. 40. № 6. P. 1733—1738.
[14] Ступин Д.Ю. Зaгpязнeниe гочв и нoвeйшиe тeхнoлoгии их вoccтaнoвлeния: y4e6roe no-co6ne. Шб.: Изд-bo Лaнь, 2009.
[15] Merkle S.A. Engineering Ferest Trees with Heavy — Metal Resistance Genes for Phytoremedi-ation // NABC rep. / Nat. agr. Biotechnology council — Ithaca (N.Y.). 2005. № 17; Agricultural biotechnology: beyond food and energy to health and the environment. P. 117—121.
[16] Ferguson B.W. Systems Agriculture: Towards a Sustainable Agricultural and Environmental Policy // NABC rep. / Nat. agr. Biotechnology council — ithaca (N.Y.). 2005. № 17; Agricultural biotechnology beyond food and energy to health and the environment. P. 93—101.
[17] Duncan D.B. Multiple range and multiple F tests. Biometrics 11:1—42, 1955.
[18] FAO Forestry Series No. 47 FAO Statistics Series No. 203 FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS Rome, 2014.
DEVELOPMENT OF EFFECTIVE SYSTEMS OF PLANT REGENERATION PAULOWNIA SHAN TONG (P. FORTUNEI X P. TOMENTOSA)
B.V. Shurganov1, YA.V. Mishutkina2, YA.B. Neskorodov2
'Department of botany, plant physiology and agrobiotechnology Peoples' Friendship University of Russia
Miklukho-Maklaya str., 8/2, Moscow, Russia, 117198
2Laboratory of system biology Center of Bioengineering, Russian Academy of Science Prospect 60th Anniversary of October, 7/1, Moscow, Russia, 117312
Paulownia is an extremely fast growing, short rotation woody crop plant. Recently, there has been increased interest in this genus because of its potential use in reforestation. Tissue culture methods provide the potential for rapidly multiplying valuable genotypes for reforestation and will help in the race to increase forest productivity. The main objective of this work was, therefore, to develop a rapid and efficient regeneration system for Paulownia Shan Tong.
Key words: Paulownia Shan Tong, reforestation, tissue culture, micropropagation, organogenesis, plant regeneretion.
REFERENCES
[1] Miсhаеl Mаrсоtrigiаnо аМ Dennis Р. Stimаrt In vitro оrgаnоgеnеsis аМ shооt рrоlifеrаtiоn оf Раulоwniа tоmentоsа steud. (emрress tree). Рк^ Sсienсe Letters, 31 (1983) 303—310.
[2] Ipekd Z., Altinkut А., Kаzаn K., Bаjrоviс K., Gоzukilmizi N. High Frequeroy Рlаnt Regenera-tiоn frоm Nоdаl Ехрlаnts оf Раulоwniа elоngаte. Рк^ biоl. 3 (2001) 113—115.
[3] Ben А. Bergmаnn аМ Heung-Kyu Mооn In vitro аdventitiоus shооt рrоduсtiоn in Ра^отеша. Рlаnt Cell Reports (1997) 16:315—319.
[4] Dimps Rаo C., Chong-Jin Goh, аnd Рrаkаsh Р. Китаг High frequenсy аdventitious shoot regeneration from exrised leаves of Раulowniа spp. сultured in vitro Р1а^. Cell Reports (1996) 16:204—209.
[5] Уа^ J.C., Chаng S.H. Ho С.К. Miсropropаgаtion of Раulowniа tаiwаniаnа from mаture tissues. Ann. Sd. For. (1989) 46 suppl., 165—167.
[6] Rout G.R., Reddy G.M., Dаs Р. Studies on in vitro Cloml Рropаgаtion of Раulowniа tomentosа steud. аМ Еvаluаtion of Genetiс Fidelity through RAРD Mаrker. Silvаe Genetiса 50, 208— 212 (2001).
[7] Ben A. Bergmаnn Рropаgаtion method influents first yeаr field survivаl аnd growth of Ра^ lowni^ (1998) New Forests 16: 251—264.
[8] Z. Ipekd, Gozukirmizi N. Direсt somаtiс embryogenesis аnd synthetk seed produсtion from Раulowniа elongаte. Рlаnt Cell Rep (2003) 22:16—24.
[9] Bergmаnn B.A., Whetten R. In vitro rooting аМ еайу greenhouse growth of miсropropаgаted Раulowniа elongаtа shoots. New Forests 15: 127—138, 1998.
[10] Li Х.У., H^ng F.H., Murphy J.B., Gbur Е.Е. Somаtiс embryogenesis in loblolly pine (Ртш tаedа L.). Tree Рlаnters' Notes 47(2):246—250; 1996.
[11] Grossniсkle S.C., Cyr D., Рolonenko D.R. Somаtiс Embryogenesis Tissue Culture for the Рropа-gаtion of Conifer Seedlings: A Te^nology Comes of Age. Tree Рк^еге' Notes 47(2):48—57; 1996.
[12] Murashige T. A Revked Medium for Rаpid Growth аМ Bioаssаys with Tobассo Cultures / T. Murashige, F. Skooge. Рhysiol. Рlаnt. 1962.
[13] Bergmann B.A., Rubin A.R., Campbell C.R. Transactions of the Asae. General edition, november/december. 1997. Vol. 40. № 6. P. 1733—1738.
[14] Отупин Д.Ю. Зафязнение гочв и нoвeйшиe тeхнoлoгии их вoсстанoвлeния: y4e6Hoe no-сoбиe. Cn6.: Изд^ Лань, 2009.
[15] Merkle S.A. Engineering Ferest Trees with Heavy — Metal Resistance Genes for Phytoremedia-tion // NABC rep. / Nat. agr. Biotechnology council — Ithaca (N.Y.). 2005. № 17; Agricultural biotechnology: beyond food and energy to health and the environment. P. 117—121.
[16] Ferguson B.W. Systems Agriculture: Towards a Sustainable Agricultural and Environmental Policy // NABC rep. / Nat. agr. Biotechnology council — ithaca (N.Y.). 2005. № 17; Agricultural biotechnology beyond food and energy to health and the environment. P. 93—101.
[17] Duncan D B. Multiple range and multiple F tests. Biometrics 11:1—42, 1955.
[18] FAO Forestry Series No. 47 FAO Statistics Series No. 203 FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS Rome, 2014.
