CC BY
13СЕКЦИЯ 1. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЭВОЛЮЦИИ ВИДОВ И ЭКОСИСТЕМ. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОРАЗНООБРАЗИЯ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЧЕЛОВЕКА
УДК 577.21
DOI: 10.24411/9999-025A-2019-10004 РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЕВРАЗИЙСКОГО ПРЕДСТАВИТЕЛЯ СУСЛИКОВ, SPERMOPHILUS FULVUS, LICHT. 1823 Батова Ольга Николаевна1, Титов Сергей Витальевич2, Васильева Нина Александровна1, Са-винецкая Людмила Евгеньевна1, Чабовский Андрей Всеволодович1 1 Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, Москва, Россия,
tchabovsky@sevin.ru 2Пензенский государственный университет, Пенза, Россия
В работе приводится разработка диагностической системы микросателлитных маркеров для желтого суслика Sper-mophilus fulvus, пригодной для анализа генетики брачных отношений, репродуктивного успеха, а также популяционно-генетических исследований.
В процессе разработки диагностической системы было протестировано 24 микросателлитных локуса, включающих три- и тетрануклеотидные повторы. В результате из 24 локусов микросателлитный повтор и полиморфизм обнаружены в 10 случаях, при этом 5 из них оказались высоко полиморфными, что позволяет в дальнейшем использовать их как основу тест-системы для анализа структуры популяции, генетики брачных отношений, репродуктивного успеха и отцовства у желтого суслика Spermophilus fulvus.
Ключевые слова: микросателлиты, полиморфизм, генетическая структура популяции, отцовство, Spermophilus ful-
vus.
DEVELOPMENT OF DIAGNOSTIC MICROSATELLITES FOR POPULATION GENETIC STUDIES IN EAURASIAN GROUND SQUIRREL, SPERMOPHILUS FULVUS, LICHT. 1823 Olga N. Batova1, Sergey V. Titov2, Nina A. Vasilieva1, Ludmila E. Savinetskaya1,
Andrey V. Tchabovsky1 1 A.N.Severtsov Institute of Ecology and Evolution RAS, Moscow, Russia 2 Penza State University, Penza, Russia
To develop a diagnostic system for microsatellite analysis of the mating system, reproductive success and population genetic structure in the yellow suslik, Spermophilus fulvus, we tested 24 loci with tri- and tetranucleotide repeats. Polymorphism was found in 10 loci, 5 of them were highly polymorphic and can be used for the analysis of the population genetic structure, mating system and paternity in S. fulvus.
Keywords: microsatellites, polymorphism, population genetic structure, fatherhood, Spermophilus fulvus.
Изучение генетической изменчивости в природных популяциях нацелено на решение как фундаментальных биологических проблем внутривидовой дифференциации и микроэволюции, устойчивости и динамики популяций, эволюции репродуктивных стратегий и брачных отношений, так и прикладных задач в области сохранения видов и биологического разнообразия (оценка риска вымирания популяций).
Для решения этих задач успешно применяют микросателлитный анализ, который позволяет оценить генетическую изменчивость, как на индивидуальном, так и популяционном уровнях. В частности, анализ микросателлитных локусов успешно используют для установления генетической основы брачных отношений, отцовства, структуры родственных связей, репродуктивного успеха, генетической структуры популяций, потока генов у разных видов наземных беличьих [1-5]. Однако лишь недавно и для единичных видов он был апробирован на евроазиатских сусликах [6,7]. Дефицит таких исследований определяется, среди прочего, отсутствием эффективных диагностических систем молекулярных маркеров. Использование систем, разработанных ранее для североамериканских видов, затруднено в силу их специфичности. Основная цель работы - разработка диагностической системы микросателлитных маркеров для желтого суслика (Spermophilus fulvus, Licht. 1823), пригодной для анализа генетики брачных отношений, репродуктивного успеха, а также популяционно-генетических исследований.
Желтый суслик - самый крупный вид среди сусликов этого рода (масса перед залеганием в спячку может достигать 2 кг) [8,9]. Ареал вида охватывает Нижнее Заволжье, Южный и Центральный
Казахстан, Среднюю Азию, северные районы Ирана и Афганистана и северо-западный Китай [10]. Желтый суслик в основном обитает в пустынях и полупустынях, однако заходит и в степную зону -именно к сухим степям Нижнего Поволжья приурочен его ареал в России. Антропогенные изменения ландшафта и сельскохозяйственная деятельность приводит к фрагментации его ареала, что может сказываться на генетической структуре популяций и их устойчивости.
В процессе разработки диагностической системы было протестировано 24 микросателлитных локуса, включающих три- и тетрануклеотидные повторы, применяемых для других видов наземных беличьих. Часть из них была непосредственно разработана авторами, остальные взяты из литературных источников (Табл.). При этом пары специфических праймеров для каждого локуса были модифицированы для удобства использования, соответственно подобраны и условия амплификации.
ДНК выделяли стандартным методом фенол-хлороформной экстракции из когтевых фаланг пальцев, зафиксированных в этаноле (96%). Апробацию микросателлитных локусов ядерной ДНК выполняли в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР), каждый локус протестировали на 5-7 взрослых, предположительно не родственных особях. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8,9), 20 мМ сульфата аммония, 20 мкМ ЭДТА, 170 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (200 мкМ каждого), 2 мМ хлористого магния, 0,6 мкМ каждого из праймеров, 0,1-0,2 мкг ДНК и 2 ед. акт. Taq-полимеразы. Амплификацию участков микросателлитной ДНК проводили при стандартных условиях: 94°С - 30 с, 58-60-62°С - 30 с (отжиг), 72°С - 30 с (35 циклов). Результат амплификации и полиморфизм ДНК локуса проверяли путем определения различий масс фрагментов с помощью вертикального электрофореза продуктов амплификации в 8% полиакриламидном геле (ПААГ). В дальнейшем в случае успешной амплификации и наличия полиморфизма фрагменты были просеквенированы с использованием генетического анализатора ABI PRISM 3500 (Thermo Fisher Scientific) согласно протоколам производителя.
В результате из 24 локусов микросателлитный повтор и полиморфизм обнаружены в 10 случаях (Табл.), при этом 5 из них (IGS bp, TR4-1, TR4-5, XmohC10, XmohD116) оказались высоко полиморфными, что позволяет в дальнейшем использовать их как основу тест-системы для анализа структуры популяции, генетики брачных отношений, репродуктивного успеха и отцовства у желтого суслика. Из этих локусов лишь один - IGS bp - ранее применяли при исследованиях гибридных поселений желтого и большого сусликов [6], остальные протестированы на желтом суслике впервые.
Табл. Анализ микросателлитных маркеров у желтого суслика
Локус Повтор Размер фрагмента, п.н. N особей N аллелей GenBank Acc. № Источник
IGS bp CAG 113 7 5 MN119269 [3]
IGS 9D ACC ~140 5 НА - [9]
IGS 24D GTT 162 5 3 MN107344 [9]
IGS 110b GCT 141 5 2 MN107347 [9]
STR3 CCT ~300 5 2 - [3]
STR4 CAAA ~170 5 1 - НП
Ssu16 GAT ~220 5 1 - [6]
Ssu17 GAT+GCT 116 5 3 MN119270 [6]
CAG CGT ~200 5 НА - НП
TR5-1 CCCCT ~140 7 1 - НП
TR4-1 GGAA 226 5 5 MN119273 НП
TR4-2 TTTA ~150 5 НА - НП
TR4-3 GTTT ~160 5 НА - НП
TR4-4 AAAT ~185 5 НА - НП
TR4-5 CCTT+CTTT 290 5 7 MN119274 НП
TR4-6 CAAA ~140 5 НА - НП
TR3-1 TGT ~190 5 1 - НП
XmohC10 GAAA 119 7 6 MN119271 [5]
XmohD102 TAGA ~185 7 НА - [5]
XmohD116 GATG+GATA 116 5 7 MN119272 [5]
D1 GATA ~185 7 2 - [8]
D2 CTAT 174 5 3 MN107345 [8]
D12 GATA 238 5 3 MN107346 [8]
D115 GATA ~140 5 1 - [8]
Примечания: НА - нет амплификации, НП - разработано авторами, ранее не публиковалось.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 19-04-00577а)
Библиографический список
1. Bell K. C., Matocq M. D. Development and characterization of polymorphic microsatellite loci in the Mohave ground squirrel (Xerospermophilus mohavensis) //Conservation Genetics Resources. - 2010. - V. 2. - №. 1. - P. 197-199.
2. Goossens B. et al. Extra-pair paternity in the monogamous Alpine marmot revealed by nuclear DNA microsatellite analysis //Behavioral Ecology and Sociobiology. - 1998. - V. 43. - №. 4-5. - P. 281-288.
3. Jones R. T. et al. Characterization of 14 polymorphic microsatellite markers for the black-tailed prairie dog (Cynomys ludovicianus) //Molecular Ecology Notes. - 2005. - V. 5. - №. 1. - P. 71-73.
4. May B. et al. Characterization of microsatellite loci in the Northern Idaho ground squirrel Spermophilus brunneus brunneus //Molecular Ecology. - 1997. - V. 6. - №. 4. - P. 399-400.
5. Schwanz L. E. et al. Paternity and male mating strategies of a ground squirrel (Ictidomysparvidens) with an extended mating season //Journal of Mammalogy. - 2016. - V. 97. - №. 2. - P. 576-588.
6. Титов С. В. и др. Особенности динамики генетической структуры гибридных популяций млекопитающих (на примере р. Spermophilus) //Мат. междунар. конферен. «Молекулярно-генетические основы сохранения биоразнообразия млекопитающих Голарктики». М.: ТНИ КМК. - 2007. - С. 258-269.
7. Gondek A., Verduijn M., Wolff K. Polymorphic microsatellite markers for endangered spotted suslik, Spermophilus suslicus //Molecular Ecology Notes. - 2006. - V. 6. - №. 2. - С. 359-361.
8. Васильева Н.А., Савинецкая Л.Е., Чабовский А.В. Крупный размер тела и короткий период наземной активности не препятствует быстрому росту желтого суслика Spermophilus fulvus //Зоологический журнал. - 2009 - Т. 88. - № 3. - С. 339-343.
9. Шубин И.Г., Кыдырбаев Х.К. Размножение желтого суслика на севере ареала //Труды института зоологии. АН КазССР. - 1978 - Т. 34. - С. 172-180.
10. Кучерук В.В. Современное представление об ареале желтого суслика (Citellus fulvus) //Зоологический журнал.
- 1998. - Т. 47. - № 10. - С. 1205-1207.
Bibliograficheskij spisok
1. Bell K. C., Matocq M. D. Development and characterization of polymorphic microsatellite loci in the Mohave ground squirrel (Xerospermophilus mohavensis) //Conservation Genetics Resources. - 2010. - V. 2. - №. 1. - P. 197-199.
2. Goossens B. et al. Extra-pair paternity in the monogamous Alpine marmot revealed by nuclear DNA microsatellite analysis //Behavioral Ecology and Sociobiology. - 1998. - V. 43. - №. 4-5. - P. 281-288.
3. Jones R. T. et al. Characterization of 14 polymorphic microsatellite markers for the black-tailed prairie dog (Cynomys ludovicianus) //Molecular Ecology Notes. - 2005. - V. 5. - №. 1. - P. 71-73.
4. May B. et al. Characterization of microsatellite loci in the Northern Idaho ground squirrel Spermophilus brunneus brunneus //Molecular Ecology. - 1997. - V. 6. - №. 4. - P. 399-400.
5. Schwanz L. E. et al. Paternity and male mating strategies of a ground squirrel (Ictidomys parvidens) with an extended mating season //Journal of Mammalogy. - 2016. - V. 97. - №. 2. - P. 576-588.
6. Titov S. V. i dr. Osobennosti dinamiki geneticheskoj struktury gibridnyh populyacij mlekopitayushchih (na primere r. Spermophilus) //Mat. mezhdunar. konferen. «Molekulyarno-geneticheskie osnovy sohraneniya bioraznoobraziya mlekopitayushchih Golarktiki». M.: TNI KMK. - 2007. - S. 258-269.
7. Gondek A., Verduijn M., Wolff K. Polymorphic microsatellite markers for endangered spotted suslik, Spermophilus suslicus //Molecular Ecology Notes. - 2006. - V. 6. - №. 2. - S. 359-361.
8. Vasil'eva N.A., Savineckaya L.E., CHabovskij A.V. Krupnyj razmer tela i korotkij period nazemnoj aktivnosti ne prepyatstvuet bystromu rostu zheltogo suslika Spermophilus fulvus //Zoologicheskij zhurnal. - 2009 - T. 88. - № 3. - S. 339-343.
9. SHubin I.G., Kydyrbaev H.K. Razmnozhenie zheltogo suslika na severe areala //Trudy instituta zoologii. AN KazSSR.
- 1978 - T. 34. - S. 172-180.
10. Kucheruk V.V. Sovremennoe predstavlenie ob areale zheltogo suslika (Citellus fulvus) //Zoologicheskij zhurnal. -1998. - T. 47. - № 10. - S. 1205-1207.
УДК 598.2: 591.524.22
Б01: 10.24411/9999-025А-2019-10005
К ВОПРОСУ О ВРЕМЕНИ ФОРМИРОВАНИЯ РЕЦЕНТНОЙ ФАУНЫ ПТИЦ
Владимир Иванович Забелин
Тувинский институт комплексного освоения природных ресурсов СО РАН г. Кызыл, Россия,
zabelinvi@mail. т
Коренная перестройка в фауне позвоночных в четвертичном периоде, произошедшая вследствие резкого изменения природной обстановки, привела к возникновению новых видов, как млекопитающих, так и птиц. На формирование современной авифауны решающее влияние оказали многократные похолодания в плейстоцене.
