CC BY
13Abstracts Nationwide Scientific and Practical Conference of Young Scientists 24 with International Participation «Fundamental research in Pediatrics»
разработка биомедицинского клеточного продукта для пластики твердой мозговой оболочки
Кокорина Арина Александровна1, Саховский Евгений Сергеевич2, Кромский Сергей Владимирович2, Косулин Артем Владимирович2, Алексеев Дмитрий Евгеньевич1
1 Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, улица Академика Лебедева 6).
2 Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет. 194100, г. Санкт-Петербург, ул. Литовская 2.
Ключевые слова: твердая мозговая оболочка; децеллюляризация; ксенографты; дермаль-ные фибробласты; заселение in vitro.
Актуальность. Одними из часто используемых имплантов для замещения твердой мозговой оболочки (ТМО) в ходе оперативных вмешательств, например, при декомпрессивных гемикра-ниэктомиях, являются материалы на основе соединительнотканных оболочек ксеногенного происхождения, ксенографты. Они обеспечивают герметичность субдурального пространства, в послеоперационном периоде замещаются собственными тканями пациента, некоторые из них не требуют наложения швов, что позволяет снизить среднее время операции, а также размещать их в труднодоступных участках. Наиболее частым осложнением при их использовании является ликворея и описаны случаи эозинофильных менингитов. Мы предположили, что заселение графтов аутогенными клетками ex vivo может снять проблему иммуногенности, ускорив репа-ративную регенерацию зоны оперативного вмешательства.
Цель. Оценить эффективность заселения децеллюляризированного графта твердой мозговой оболочки первичной культурой дермальных фибробластов in vitro.
Материалы и методы. В качестве носителя использовали ТМО кролика породы советская шиншилла, освобожденную от клеток и остаточных нуклеиновых кислот децеллюляризацией — последовательной инкубацией образцов в деионизированной воде, растворах додецилсульфата натрия, Triton X-100 и дезоксирибонуклеазы (Sigma, США). Стерилизацию децеллюляризиро-ванной ТМО (ДЦ ТМО) проводили помещением в 70%-ный этиловый спирт с последующей отмывкой фосфатно-солевым буфером. Для оценки качества децеллюляризации фиксированные, обезвоженные, окрашенные гематоксилин-эозином срезы (6-8 мкм) ДЦ ТМО (n=6) оценивали, используя ядерный краситель DAPI (ThermoScientific, США), на предмет отсутствия клеточного материала и нуклеиновых кислот. Из биоптата кожи кролика размером 5*5 мм, полученного под местной анестезией, выделяли фибробласты последовательной обработкой 0,25% трипсином и коллагеназой (Биолот, Россия) по стандартному протоколу. Клетки культивировали в условиях инкубатора (5% CO2, 370C), полной культуральной среды ДМЕМ (10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% глутамина, 1% гентамицина; Биолот, Россия) и смены последней раз в 3-4 сут. ДЦ ТМО нарезали на фрагменты диаметром 0,8 см, помещаемые в суспензию фибробластов 4-го пассажа с концентрацией 10, 35 или 350 тыс. кл./см2 (n=3 для каждой группы), для заселения носителя статичным способом. Степень заселения биоинженерной конструкции (БИК) визуализировали на 10-е сут с помощью конфокальной микроскопии (LSM 710, Zeiss, Германия). Для этого БИК фиксировали 10 мин в 4% парафармальдегиде, дважды отмывали фосфатно-солевым буфером, и, после обработки 0,05% Triton X-100, окрашивали DAPI в течение 45 мин в темноте. Морфометрический анализ проводили в программе Image J. Статистический анализ проводили в программе GraphPadPrism 5.
Результаты. Окрашивание гистологических срезов ДЦ ТМО гематоксилин-эозином и DAPI не выявило остаточного клеточного материала. Носитель, состоящий из межклеточного вещества, морфологически соответствовал нативному, разрывов не отмечали. Средние значения толщины нативной и ДЦ ТМО кролика не отличались (0,08-0,1 мм).
Через 10 сут культивирования БИК были покрыты клетками. Характер заселения клеточной суспензией с плотностью клеток 10 и 35 тыс. кл/см2 оказался схожим: клетки с ядрами округлой формы равномерно покрывали поверхность носителя. Плотность клеток на носителях состав-
forcipe
том 2 спецвыпуск 3 2019
ISSN 2658-4174
Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные исследования в педиатрии» 25
ляла 43 ± 3 и 61 ±10 тыс.кл/см2, соответственно. Число клеток на носителях с исходным заселением в концентрации 350 тыс.кл/см2 через 10 суток оказалось чрезмерным. Наблюдали многослойную культуру, ядра неправильной или вытянутой формы, встречались апоптотические тельца. Плотность достигала 119 ± 16 тыс.кл/см2, что значимо больше, чем при самой низкой плотности заселения.
Обсуждение. Представленный протокол децеллюляризации, судя по результатам микроскопической и культуральной работы, позволяет получить неимуногенный, лишенный цитотоксич-ности с сохраненной микроархитектоникой носитель. Прекондиционирование носителя in vitro c клеточной суспензией дермальных фибробластов с исходной концентрацией 10-350 тыс кл/ см2 позволяет в течение заданного времени получить биоинженерный клеточный продукт, достаточный для пластики дефектов твердой мозговой оболочки
Выводы. Разработан протокол для получения неиммуногенного материала ТМО: детергенты, ферменты, их концентрация, время экспозиции и последовательность использования, обеспечивающее достаточное очищение ТМО от клеточных элементов и остаточных нуклеиновых кислот. Нарушение регламента протокола, например, увеличение продолжительности воздействий, приводит к нарушению микроархитектоники образца и его биологических свойств. Де-целлюляризированный материал может быть заселен клеточным материалом с целью получения биоинженерного клеточного продукта для пластики дефектов ТМО и барабанной перепонки. Сохранность сигнальных молекул внеклеточного матрикса — составного компонента биоинже-нерногоклеточного продукта — залог активной репаративной регенерации и профилактики формирования рубцовой ткани.
forcipe
том 2 спецвыпуск 3 2019
elSSN 2658-4182
