CC BY
1
УДК 636.09: 579.64
DOI 10.18286/1816-4501-2023-2-122-128
РАЗРАБОТКА БИОКОМПОЗИЦИИ КАК КОМПОНЕНТА БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИКРОЭКОЛОГИИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ПРОДУКТИВНЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Дежаткина Светлана Васильева, доктор биологических наук, профессор кафедры «Морфология, физиология и патология животных»
ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, дом 1: тел.: 89603621517
e-mail: feokna@yandex.ru
Ключевые слова: Bacillus coagulons, Weizmannia coagulons, биокомпозия, экспрессия, гены, лактат-пер-меаза (lutP), коагулин (CoaD.)
В статье представлены результаты исследований по разработке бактериальной биокомпозиции для коррекции микроэкологии желудочно-кишечного тракта продуктивных животных и птицы векторного действия. В работе был использованы референс-штаммы Bacillus coagulans (Weizmannia coagulans) из коллекции ФГБУ «ГосНИИгенетика» и полевые штаммы, выделенные из проб почвы.
В системе NCBI были определены структурные нуклеотидные последовательности генов лактат-пермеазы (lutP) - выработка L(+) молочной кислоты (левовращающийся изомер) - и коагулина (CoaD) - бак-териостатическое и/или бактерицидное действие в отношении бактерий родов Enterococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Listeria, Pediococcus и т.п. Был проведен анализ структуры данных генов (BLASTnucleotide и PRIMER BLAST), разработаны системы детекции гена лактат-пермеазы (праймеры: forward GCGTGCCGAACAAAA-CATTG, reverse ATCAACGGCGCACACACC) и гена коагулина (праймеры: forward AATTATCCGGGGCTTACGGG, reverse ATGCTTTATGCACAACCGGC), оптимизированы условия ПЦР- RT, проведен анализ уровня РНК относительно ДНК. Анализ экспрессии генов сопровождался нормализацией реакции. Полученные данные позволяют сформировать пробиотическую биокомпозицию из бактерий Bacillus coagulans с прогнозируемым эффектом, так как экспериментально установлено, что кандидатные бактерии характеризуются высокими показателями экспрессии гена лактат-пермеазы (lutP) - это штаммы Bacillus coagulans В.со.24, Bacillus coagulans В.со.80 и Bacillus coagulans В.со.48. и гена коагулина (CoaD) - это штаммы Bacillus coagulans В.со.20, Bacillus coagulans В.со.80 и Bacillus coagulans В.со.64 и Bacillus coagulans В.со.96. Векторное действие разрабатываемого биопрепарата подтверждается высокой степенью экспрессии кандидатными бактериальными штаммами генов, кодирующих производство активных метаболитов лактат-пермеазы (lutP) и коагулина (CoaD), что позволяет сформировать биопрепарат из штаммов В.со.24, В.со.48, В.со.80, В.со.96.
Введение
Ветеринарная наука находится в состоянии постоянного поиска оптимальной стратегии и тактики борьбы за поддержание здоровья продуктивных животных, за обеспечение продовольственной безопасности и получение экологически чистой и качественной продукции животноводства [1]. Поэтому в настоящее время актуальным остается применение научно обоснованной системы повышения ветеринарного благополучия продуктивных животных с помощью физиологических методов коррекции микроэкологии животных, как пробиотики [2]. По литературным данным естественная защитная система желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных кроме иммунной системы, эпителия кишечника и слизистого барьера представлена также микрофлорой кишечника, обуславливающей барьерный эффект. «Заселение» пищеварительного тракта микроорганизмами, экспресси-
рующими гены бактериоцинов приводит к формированию биоценоза, обеспечивающего колонизационную резистентность макроорганизма к возбудителям кишечных инфекций. В настоящее время колонизационная резистентность является фактором неспецифической защиты [3]. Ключевой особенностью Bacillus coagulans (Weizmannia coagulans таксономическая номенклатура вида Bacillus coagulans до 7-го издания Bergey's) является способность вырабатывать l-лактат посредством гомоферментативного метаболизма. Автономное присутствие предполагаемого гена, кодирующего лактат-пермеазу (lutP), и гена, кодирующего его регулятор (lutR) у продуцентов L-лактата, доказано некоторыми исследователями [4-6], отмечена их ключевая функция в производстве лактата. Bacillus coagulans способна ферментативно гидроли-зовать целлюлозу с образованием целлобиозы и глюкозы [7-9]. Однако, согласно некоторым
авторам не все штаммы способны фе-нопически проявлять данное свойство [10]. Bacillus coagulans является активным продуцентом бактериоцинов [1113]. Наиболее широко представленным из них является коагулин. Данный бак-териоцин (Coa A,B,C,D) имеет аминокислотную последовательность, аналогичную описанной для педиоцинов, продуцируемых различными штаммами Pediococcus acidilactici, отличающуюся только одной аминокислотой на их С-конце [11]. Согласно некоторым исследователям [14] он обладает актив- Рис,
ностью в отношении бактерий родов (lutP) для Enterococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Listeria и Pediococcus.
При разработке бактериальной биокомпозиции для коррекции микроэкологии ЖКТ продуктивных животных и птицы одной из задач был анализ экспрессии генов бактериоцинов (лактат-пермеазы и коагулина) у кандидатных штаммов Bacillus coagulans.
Материалы и методы исследований
Для подбора и оптимизации праймеров, специфичных в отношении изучаемых бактерий, были использованы ресурсы NCBI: BLAST nucleotide и PRIMER BLAST. Выделение нуклеиновых кислот бактерий проводили при помощи набора РеалБест УниМаг («Вектор Бест», РФ). Для очистки РНК от фрагментов ДНК использовали ДНКазу («Синтол», РФ), для получения очищенной ДНК от РНК применяли РНКазу («Синтол», РФ). Все исследования проводили согласно инструкции производителей. В данных исследованиях нормализация РНК, определяющих уровень экспрессии, была проведена на ДНК исследуемых генов. В работе были использованы референс-штаммы из коллекции Национального биоресурсного центра Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» Минобрнауки России: Bacillus coagulans B-6668, В-2270, В-10268, B-10468, В-3042, B-4521 В-10473, В.со. - 264, и полевые штаммы, выделенные авторами из проб почвы при выполнении научных исследований при поддержке Программы развития Саратовского государственного университета генетики, биотехнологии и инженерии имени Н.И. Вавилова (Приоритет-2030)»: В.со.44, В.со.88, В.со.12, В.со.13, В.со.14, В.со.16, В.со.20, В.со.24, В.со.80, В.со.64, В.со.48, В.со.96, В.со.84. Бактерии культивировали на МПБ и LB-бульоне («Диаэм», РФ) в течение 24 часов при 350С, количественную
1 - Анализ специфичности гена лактат-пермеазы Bacillus coagulans
Рис. 2 - Специфичные системы олигону-клеотидов для гена лактат-пермеазы (lutP)
оценку концентрации бактерий в одном миллилитре среды проводили при использовании спектрофотометра Eppendorf BioSpectrometer kinetic («Eppendorf», Германия). Оценка количества бактерий проводилась согласно протоколу прибора. Для изучения экспрессии целевых участков гена был использован «Набор реагентов для проведения ПЦР совмещенной с реакцией обратной транскрипции (ПЦР-ОТ) («Синтол», РФ).
Результаты исследований
В системе NCBI был проведен анализ специфичности гена лактат-пермеазы (lutP). По данным BLAST доказана уникальность его ну-клеотидной последовательности (рис. 1) для Bacillus coagulans. С использованием ресурсов Primer-BLAST были определены оптимальные праймеры и зонды для проведения ПЦР (рис. 2-3). Исходя из задач исследований по определению экспрессии гена лактат-пермеазы (lutP) для предварительной реакции обратной транскрипции, нами было принято решение использования гексамерных и декамерных рандом-ных праймеров в соотношении 3:1. Экстракция нуклеиновых кислот была проведена с использованием коммерческих наборов реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для определения РНК после экстракции нуклеиновых кислот 1 часть аликвоты проб была обработана ДНК-азой, для исключения в реакции ДНК; 2 часть аликвот была предварительно об-
Primer pâïr 1
HequoncD (Ь'-»3'| 1 empîate strand Lcrujtti Start Stop Im GC\ Self о
Forward prfcme-r GCÛTGOCGAACAAAACATTQ Plus 2Ü 2Я69Й61 59.50 SU.00 3.00
fieveree primer ATCAACGGCGCACACAfiC MihUa IB 2870193 2870176 6135 61.114.00
Itltemal oltgo GGCQAGCGCCAATGCCAATG Plu» 20 2869942 286956159.9165.00 Product l«ngih 352
ОТ llllwilwl t4f|]»1i
»CP1 rt727f> 1 Welemantite G«BUlm «train 1 № r;hrofmworne, complète дыют« product: leng-th ■ Э52
Forward ргзячг 1 eC6T6CCGAACAAAACATT<5 se Template 2веаз7в .................... заеэавэ
Rogers« ргiir*'г 1
So» 3' (
э.оо
0.DO
Рис. 3 - Система детекции гена лактат-пермеазы (lutP) для ПЦР- RT
§
450 400
g 300
¡В 250 ^
о
О 200 ^
О
с ©
150 100
~1—г
6 11
Т-1-1-1-136 41
-г-
46
16 21 26 31 Номер цикла
Рис. 4 - График амплификации РНК фрагмента гена лактат-пермеазы (lutP) после ОТ
/
л/
m
Рис. 6 - Анализ специфичности гена коагу-лина (CoaD) для Bacillus coagulans
Рис. 7 - Специфичные системы олигонуклеотидов для гена коа-гулина (CoaD)
Рис. 8 - Система детекции гена коагулина (CoaD) для ПЦР-RT
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46
Рис. 5 - Графи к амплифи кации ДНК фрагмента гена лактат-пермеазы (lutP)
работана РНК-азой для реакции нормализации. В результате проведенных исследований были получены результаты (рис. 4-5). В таблице 3 представлен анализ результатов экспрессии гена лактат-пермеазы (lutP).
В результате анализа полученных данных амплификации выявлена экспрессия гена лактат-пермеазы у штаммов Bacillus coagulans B-6668, В-2270, B-10468, B-4521, В-10473, В.со.264, В.со.44, В.со.13, В.со.16, В.со.24, В.со.80, В.со.48 с коэффициентом 1,01±0,13.
В системе NCBI был проведен анализ специфичности гена коагулина (CoaD). По данным BLAST доказана уникальность его нуклео-тидной последовательности (рис. 6) для Bacillus coagulans.
С использованием ресурсов Primer-BLAST были определены оптимальные праймеры и зонды для проведения ПЦР (рис. 7-8).
При решении задачи по определению экспрессии гена коагулина (CoaD) для предварительной реакции обратной транскрипции были использованы рандом-
Таблица 1
Расчеты коэффициента экспрессии гена лактат-пермеазы (при нормализации на ДНК
этого же гена)
№ Наименование штамма Ct РНК (после ОТ) Ct ДНК коэфф. экспрессии
1 Bacillus coagulans B-6668 30,1 33,1 0,91
2 Bacillus coagulans В-2270 31,8 34,7 0,92
3 Bacillus coagulans В-10268 30,2 0,00
4 Bacillus coagulans B-10468 27,9 32,7 0,85
5 Bacillus coagulans В-3042 31,9 0,00
6 Bacillus coagulans B-4521 28,2 31,2 0,90
7 Bacillus coagulans В-10473 33,1 33,6 0,99
8 Bacillus coagulans В.со.264 30,4 33,2 0,92
9 Bacillus coagulans В.со.44 32,0 34,6 0,92
10 Bacillus coagulans В.со.88 32,9 0,00
11 Bacillus coagulans В.со.12 33,0 0,00
12 Bacillus coagulans В.со.13 33,2 35,7 0,93
13 Bacillus coagulans В.со.14 31,5 0,00
14 Bacillus coagulans В.со.16 40,3 35,1 1,15
15 Bacillus coagulans В.со.20 34,4 0,00
16 Bacillus coagulans В.со.24 40,5 33,1 1,22
17 Bacillus coagulans В.со.80 35,8 32,7 1,09
18 Bacillus coagulans В.со.64 32,9 0,00
19 Bacillus coagulans В.со.48 40,7 31,1 1,31
20 Bacillus coagulans В.со.96 35,0 0,00
21 Bacillus coagulans В.со.84 34,2 0,00
ные праймеры. Экстракция нуклеиновых кислот была проведена с использованием коммерческих наборов реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для определения РНК после экстракции нуклеиновых кислот 1 часть аликвоты проб была обработана ДНК-азой, для исключения в реакции ДНК; 2 часть аликвот была предварительно обработана РНК-азой для реакции нормализации. Результаты экспериментов представлены на рисунках 9-10. В таблице 2 представлен анализ результатов экспрессии гена коагулина (CoaD).
При проведении амплификации установлена экспрессия гена коагулина (CoaD) у штаммов Bacillus coagulans B-6668, В-2270, В-10268, В-10468, В.со.44, В.со.20, В.со.80, В.со.64, В.со.48, В.со.96, В.со.84 с коэффициентом 0,98±0,10. В результате проведенных экспериментов по определению экспрессии генов активных метаболитов, кодирующих выработку молочной кислоты и синтез бактериоцина - коагулина, были определены штаммы Bacillus coagulans, являющиеся потенци-
Таблица 2
Расчеты коэффициента экспрессии гена коагулина (при нормализации на ДНК этого же
гена)
№ Наименование штамма Ct РНК (после ОТ) Ct ДНК коэфф. экспрессии
1 Bacillus coagulans B-6668 25,9 32,6 0,79
2 Bacillus coagulans В-2270 31,2 33,0 0,95
3 Bacillus coagulans В-10268 31,8 33,2 0,96
4 Bacillus coagulans B-10468 26,9 32,3 0,83
5 Bacillus coagulans В-3042 33,6 0,00
6 Bacillus coagulans B-4521 33,1 0,00
7 Bacillus coagulans В-10473 29,9 0,00
8 Bacillus coagulans В.со.264 32,9 0,00
9 Bacillus coagulans В.со.44 27,9 32,1 0,87
10 Bacillus coagulans В.со.88 29,9 0,00
11 Bacillus coagulans В.со.12 32,5 0,00
12 Bacillus coagulans В.со.13 32,5 0,00
13 Bacillus coagulans В.со.14 31,9 0,00
14 Bacillus coagulans В.со.16 32,2 0,00
15 Bacillus coagulans В.со.20 33,9 33,3 1,02
16 Bacillus coagulans В.со.24 25,6 0,00
17 Bacillus coagulans В.со.80 25,4 22,2 1,14
18 Bacillus coagulans В.со.64 26,4 25,0 1,06
19 Bacillus coagulans В.со.48 30,7 32,7 0,94
20 Bacillus coagulans В.со.96 32,8 26,4 1,24
21 Bacillus coagulans В.со.84 26,1 27,6 0,95
альными кандидатами для разработки пробиоти-ческого биопрепарата. Определены штаммы с выявленной экспрессией 2-х генов (табл. 3).
Установлены штаммы бактерий с высоким показателем экспрессии гена лактат-перме-азы (продукция молочной кислоты) - это штаммы Bacillus coagulans В.со.24, Bacillus coagulans В.со.80 и Bacillus coagulans В.со.48. Выявлены штаммы бактерий с высоким показателем экспрессии гена коагулина (бактериоцин) - это штаммы Bacillus coagulans В.со.20, Bacillus coagulans В.со.80 и Bacillus coagulans В.со.64 и Bacillus coagulans В.со.96.
Обсуждение
В основе определения прогнозируемого
J
-1—I—I—I—I—I—I——I—I—I——I——I——I——I—
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 Номер цикла
Рис. 9 - График амплификации РНК фрагмента гена коагулина (CoaD) после ОТ
Таблица 3
Бактерии Bacillus coagulons, с активной экспрессией генов лактат-пермеазы и коагулина
№ Наименование штамма коэфф. экспрессии лактат-пер-меазы коэфф. экспрессии коа-гулина
1 Bacillus coagulans B-6668 0,91 0,79
2 Bacillus coagulans В-2270 0,92 0,95
3 Bacillus coagulans В-10268 0,96
4 Bacillus coagulans B-10468 0,85 0,83
5 Bacillus coagulans В-3042
6 Bacillus coagulans B-4521 0,90
7 Bacillus coagulans В-10473 0,99
8 Bacillus coagulans В.со.264 0,92
9 Bacillus coagulans В.со.44 0,92 0,87
10 Bacillus coagulans В.со.88
11 Bacillus coagulans В.со.12
12 Bacillus coagulans В.со.13 0,93
13 Bacillus coagulans В.со.14
14 Bacillus coagulans В.со.16 1,15
15 Bacillus coagulans В.со.20 1,02
16 Bacillus coagulans В.со.24 1,22
17 Bacillus coagulans В.со.80 1,09 1,14
18 Bacillus coagulans В.со.64 1,06
19 Bacillus coagulans В.со.48 1,31 0,94
20 Bacillus coagulans В.со.96 1,24
21 Bacillus coagulans В.со.84 0,95
проявления пробиотических свойств бактерий рода Bacillus лежит применение молекулярно-генетического метода определения экспрессии генов изучаемых свойств при изменении условий их культивирования. Применение метода ПЦР по сравнению с классическими методами культивирования при определении метаболической бактериальной активности имеет преимущество по времени получения результатов, усиления сигнала экспрессируемых генов, огра-
Ч—I—Г-1—I—I—Г"1—I—I—Г"1—I—I—г
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46
Номер цикла
Рис. 10 - График амплификации ДНК фрагмента гена цкоагулина (CoaD)
ниченного периодом действия стимулятора (ростовых и т.п. факторов), временем наибольшей экспрессии генов активных метаболитов и составляет не более 4 часов. Основное значение в данном исследовании имеют мРНК исследуемых фрагментов бактериального генома бактерий, входящих в состав пробиотической композиции. Для установления уровня экспрессии в качестве нормирования было использовано определение ДНК указанных генов. На основании проведенных экспериментов были получены данные по оптимизации протоколов проведения молекулярно-генетических исследований генов активных метаболитов, кодирующих выработку молочной кислоты и синтез коагулина.
Полученные данные позволяют нам сформировать пробиотическую биокомпозицию из бактерий Bacillus coagulans с прогнозируемым эффектом, так как экспериментально установлено, что кандидатные бактерии продуцируют бактериоцины - вещества, повреждающие мембраны, нарушающие синтез белков и ДНК в патогенных бактериях. Кроме того, выделяют L(+) молочную кислоту (левовращающий изомер), которая в недиссоциированной (т.е. нейтральной) форме свободно проникает через мембраны и снижает внутриклеточное значение рН в патогенныз бактериальных штаммах. Это, в свою очередь, ведет к нарушению метаболических процессов, таких как окислительное фосфо-рилирование, и к гибели патогенов.
Заключение
Разработана биокомпозиция для биопрепарата векторного действия для коррекции микроэкологии желудочно-кишечного тракта продуктивных животных и птицы, эффективность которого теоретически подтверждается высокой степенью экспрессии кандидатными бактериальными штаммами В.со.24, В.со.48, В.со.80,
В.со.96 генов, кодирующих производство активных метаболитов лактат-пермеазы (lutP) и коа-гулина (CoaD).
Библиографический список
1. Оценка продовольственной безопасности России / И. Н. Сафиуллин, Б. Г. Зиганшин, Э. Ф. Ами-рова [и др.] // Вестник Казанского государственного аграрного университета. - 2021 - Т. 16 - № 2(62).
- С. 124-132. - DOI 10.12737/2073-0462-2021-124132. - EDN FKWBPM.
2. Молянова, Г. В. Воздействие препарата на основе Bacillus subtilus на росто-весовые параметры телят голштино-фризской породы / Г. В. Молянова, М. П. Ноготков // Известия Самарской государственной сельскохозяйственной академии.
- 2021 - № 1 - С. 46-51. - EDN WNCXXO.
3. Баймишева, С. А. Иммунологический статус коров в зависимости от дозы иммуномодули-рующего средства / С. А. Баймишева // Известия Самарской государственной сельскохозяйственной академии. - 2020 - № 1 - С. 45-50.
4. Elucidating the role and regulation of a lactate permease as lactate transporter in Bacillus coagulans DSM1 / Y. Wang et al. // Applied and environmental microbiology. - 2019. - Т. 85. - №. 14. - Р. e00672-19.
5. Transcriptional regulation of the l-lactate permease gene lutP by the LutR repressor of Bacillus subtilis RO-NN-1 / К. Chiu et. al. // Microbiology. -2014. - Т. 160. - №. 10. - Р. 2178-2189.
6. Comparative transcriptome analysis reveals different molecular mechanisms of Bacillus coagulans 2-6 response to sodium lactate and calcium lactate during lactic acid production / J. Qin et al. // PloS. one.
- 2015. - Vol. 10. - №. 4. - P. e0124316.
7. Гусаков, А.В. Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: фундаментальные и приклад-
ные аспекты : дис. - Москва: МГУ им. МВ Ломоносова, 2005. - C.13.
8. Biochemical characterizationof cellulase from Bacillus subtilis strain and its effect on digestibility and structural modifications of lignocellulose rich biomass / W.A. Malik, S. Javed // Frontiers in bioengineering and biotechnology. - 2021. - Vol. 9. - P. 122-129.
9. Thermophilic Bacillus coagulans requires less cellulases for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to products than mesophilic microbial biocatalysts / M.S. Ou et al. // Applied biochemistry and biotechnology. - 2009. - Vol. 155. - №. 1. - Р. 76-82.
10. Complete genome sequence of a thermotolerant sporogenic lactic acid bacterium, Bacillus coagulans strain 36D1 / M.S. Rhee et al. // Standards in Genomic Sciences. - 2011. - Vol. 5. - №. 3. - Р. 331-340.
11. Biochemical and genetic characterization of coagulin, a new antilisterial bacteriocin in the pediocin family of bacteriocins, produced by Bacillus coagulans I4 / C. Le Marrec et al. // Applied and environmental microbiology. - 2000. - Vol. 66. - №. 12. - Р. 52135220.
12. Characterization and antibacterial modes of action of bacteriocins from Bacillus coagulans CGMCC 9951 against Listeria monocytogenes / J. Zhang et al. // LWT. - 2022. - Vol. 160. - Р. 113272.
13. Characterization of lactosporin, a novel antimicrobial protein produced by Bacillus coagulans ATCC 7050 / S. Riazi et al. // Journal of applied microbiology. - 2009. - Vol. 106. - №. 4. - Р. 13701377.
14. Marrec, L. Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produced by Bacillus coagulans I4 / L. Marrec //Journal of applied microbiology. -1998. - Vol. 85. - №. 1. - Р. 42-50.
DEVELOPMENT OF A BIOCOMPOSITION AS A COMPONENT OF A BIOLOGICAL PRODUCT FOR CORRECTION OF THE MICROECOLOGY OF THE GASTROINTESTINAL TRACT OF PRODUCTIVE ANIMALS AND POULTRY
Feoktistova N.A., Dezhatkina S.V.
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Ulyanovsk State Agrarian University 432017, Ulyanovsk, Novyi Venets boulevard, building 1: tel.: 89603621517 e-mail: feokna@yandex.ru
Key words: Bacillus coagulans, Weizmannia coagulans, biocomposition, expression, genes, lactate permease (lutP), coagulin (CoaD.)
The article presents results of the research on development of a bacterial biocomposition for correction of the microecology of the gastrointestinal tract of productive animals and poultry of vector action. Reference strains of Bacillus coagulans (Weizmannia coagulans) from the collection of FSBI State Research Institute of Genetics and field strains isolated from soil samples were used in the work.
Structural nucleotide sequences of the lactate permease (lutP) genes were determined in the NCBI system - the production of L (+) lactic acid (left-handed isomer) - and coagulin (CoaD) - bacteriostatic and / or bactericidal action against bacteria of Enterococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Listeria, Pediococcus, etc genera. The analysis of the structure of these genes (BLAST nucleotide and PRIMER BLAST) was carried out, systems for detection of lactate permease gene (primers: forward GCGTGCCGAACAAAACATTG, reverse ATCAACGGCGCACACACC) and coagulin gene (primers: forward AATTATCCGGGGCTTTACGGG, reverse ATGCTTTATGCACAACCGGC) were developed, PCR-RTconditions were improved, analysis of RNA level in relation to DNA was performed. Analysis of gene expression was accompanied by reaction normalization. The data obtained allow to form a probiotic biocomposition from Bacillus coagulans bacteria with a predictable effect, since it was experimentally established that candidate bacteria are characterized by high levels of lactate permease (lutP) gene expression - these are strains of Bacillus coagulans B.co.24, Bacillus coagulans B.co. 80 and Bacillus coagulans B.co. 48. and coagulin gene (CoaD) are strains of Bacillus coagulans B.co.20, Bacillus coagulans B.co.80 and Bacillus coagulans B.co.64 and Bacillus coagulans B.co.96. The vector effect of the developed
biological product is confirmed by high degree of expression by candidate bacterial strains of the genes encoding the production of active metabolites of lactate permease (lutP) and coagulin (CoaD), which enable to form a biological product from strains B.co.24, B.co.48, B.co .80, B.co.96.
Bibliography:
1. Safiullin I. N. Assessment of food security of Russia /1. N. Safiullin, B. G. Ziganshin, E. F. Amirova [and others]// Vestnik of Kazan State Agrarian University.
- 2021 - Vol. 16 - № 2(62). - P. 124-132. - DOI 10.12737/2073-0462-2021-124-132. - EDN FKWBPM.
2. Molyanova, G.V. Effect of a preparation based on Bacillus subtilus on growth and weight parameters of Holstein-Friesian calves / G. V. Molyanova, M. P. Nogotkov // Izvestiya of Samara State Agricultural Academy. - 2021 - № 1 - P. 46-51. - EDN WNCXXO.
3. Baimisheva, S. A. Immunological status of cows depending on the dose of an immunomodulating agent / S. A. Baimisheva // Izvestiya of Samara State Agricultural Academy. - 2020 - № 1 - P. 45-50.
4. Elucidating the role and regulation of a lactate permease as lactate transporter in Bacillus coagulans DSM1 / Y. Wang et al.//Applied and environmental microbiology. - 2019. - 85. - № 14. - P. e00672-19.
5. Transcriptional regulation of the l-lactate permease gene lutP by the LutR repressor of Bacillus subtilis RO-NN-1 /K. Chiu et. al. //Microbiology. - 2014.
- T. 160. - № 10. - P. 2178-2189.
6. Comparative transcriptome analysis reveals different molecular mechanisms of Bacillus coagulans 2-6 response to sodiu m lactate and calcium lactate during lactic acid production/J. Qin et al. //PloS. one. - 2015. - Vol. 10. - № 4. - P. e0124316.
7. Gusakov, A.V. Biocatalysts based on fungal cellulases: fundamental and applied aspects: dis. - Moscow: Moscow State University named after M.V. Lomonosov, 2005. - P.13.
8. Biochemical characterization of cellulase from Bacillus subtilis strain and its effect on digestibility and structural modifications of lignocellulose rich biomass / W.A. Malik, S. Javed//Frontiers in bioengineering and biotechnology. - 2021. - Vol. 9. - P. 122-129.
9. Thermophilic Bacillus coagulans requires less cellulases for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to products than mesophilic microbial biocatalysts / M.S. Ou et al. // Applied biochemistry and biotechnology. - 2009. - Vol. 155. - № 1. - P. 76-82.
10. Complete genome sequence of a thermotolerant sporogenic lactic acid bacterium, Bacillus coagulans strain 36D1 / M.S. Rhee et al. //Standards in Genomic Sciences. - 2011. - Vol. 5. - № 3. - P. 331-340.
11. Biochemical and genetic characterization of coagulin, a new antilisterial bacteriocin in the pediocin family of bacteriocins, produced by Bacillus coagulans I4 / C. Le Marrec et al. //Applied and environmental microbiology. - 2000. - Vol. 66. - № 12. - P. 5213-5220.
12. Characterization and antibacterial modes of action of bacteriocins from Bacillus coagulans CGMCC 9951 against Listeria monocytogenes/J. Zhang et al. //L.W.T. - 2022. - Vol. 160. - P. 113272.
13. Characterization of lactosporin, a novel antimicrobial protein produced by Bacillus coagulans ATCC 7050 / S. Riazi et al. // Journal of applied microbiology. - 2009. - Vol. 106. - № 4. - P. 1370-1377.
14. Marrec, L. Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produced by Bacillus coagulans I4 / L. Marrec // Journal of applied microbiology. -1998. -Vol. 85. - № 1. - P. 42-50.
