CC BY
7© Коллектив авторов, 2021 https://doi.org/10.29296/24999490-2021-05-08
РАЗРАБОТКА ЭР-КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ФИБРОБЛАСТОВ РОГОВИЦЫ
А.П. Лыков1, М.А. Суровцева1, К.Ю. Краснер2, И.И. Ким1, Н.А Бондаренко1, А.Н. Трунов2, В.В. Черных2, О.В. Повещенко1
НИИКЭЛ — филиал ИЦиГ СО РАН, Российская Федерация, 630096, Новосибирск, ул. Колхидская, 10; 2Новосибирский филиал ФГАУ НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова», Российская Федерация, 630060, Новосибирск ул. Тимакова 2 E-mail: k.krasner@mntk.nsk.ru
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Лыков Александр Петрович — ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, кандидат медицинских наук НИИ клинической и экспериментальной лимфологии, филиал «ФГБУ ФИЦ «ИЦиГ СО РАН». Тел.: +7 (913) 733-40-71. E-mail: aplykov2@mail.ru. ORCID: 0000-0003-4897-8676.
Суровцева Мария Александровна — старший научный сотрудник, кандидат медицинских наук НИИ клинической и экспериментальной лимфологии, филиал «ФГБУ ФИЦ «ИЦиГ СО РАН». Тел.: +7 (905) 933-83-89. E-mail: mfelde@ngs.ru. ORCID: 0000-0002-4752-988x.
Краснер Кристина Юрьевна — врач-офтальмолог Новосибирского филиала ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр «МНТК«Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» МЗРФ». Тел.: +7(905) 930-76-59. E-mail: k.krasner@ mntk.nsk.ru. ORCID: 0000-0002-1921-8072.
Ким Ирина Иннокентьевна — научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, кандидат медицинских наук НИИ клинической и экспериментальной лимфологии, филиал «ФГБУ ФИЦ «ИЦиГ СО РАН». Тел.: +7 (923) 702-45-12. E-mail: kii5@ yandex.ru. ORCID: 0000-0002-7380-2763.
Бондаренко Наталия Анатольевна — младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, кандидат медицинских наук НИИ клинической и экспериментальной лимфологии, филиал «ФГБУ ФИЦ «ИЦиГ СО РАН». Тел.: +7 (913) 953-9681. E-mail: bond802888@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-8443-656X.
Трунов Александр Николаевич — доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе Новосибирского филиала ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр «МНТК«Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» МЗ РФ». Тел.: +7(913) 910-03-16. E-mail: trunov1963@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-7592-8984.
Черных Валерий Вячеславович — доктор медицинских наук, профессор, директор Новосибирского филиала ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» МЗ РФ». Тел.: +7 (383) 209-00-44. E-mail: sci@mntk.nsk.ru. ORCID: 0000-0002-7623-3359.
Повещенко Ольга Владимировна — доктор медицинских наук, профессор, зав. лаборатории клеточных технологий НИИ клинической и экспериментальной лимфологии, филиал «ФГБУ ФИЦ «ИЦиГ СО РАН». Тел.: +7 (383) 336-07-08. E-mail: poveschenkoov@yandex.ru. ORCID: 0000-0001-9956-0056.
Введение. Успехи, достигнутые в области биологии и медицины, в частности в области клеточных технологий, позволяют апробировать в качестве альтернативы хирургическому методу лечения патологии роговицы стволовые клетки глаза. Вариантом повышения устойчивости столовых клеток к неблагоприятным факторам микроокружения в патологическом очаге может стать создание аналога 3D-модели ниши стволовых клеток.
Цель исследования: изучить в эксперименте способность комбинации полиэтиленгликоля с внеклеточным матриксом и ли-затом тромбоцитов удерживать внутри фибробласты роговицы.
Материал и методы. Проведена оценка биосовместимости конструкций и фибробластов роговицы, выделенных из ленти-кул роговицы, и вязкости конструкций in vitro.
Результаты. В течение 3—4 нед удается нарастить до 2—3'106 клеток из лентикул роговицы, которые морфологически имели дендритную форму, а фенотипически несли на своей поверхности маркеры мезенхимных стволовых клеток/фибробла-стов. Входе исследования изучена биосовместимость конструкций из полиэтиленгликоля-4000 (ПЭГ-4000), метилцеллюлозы (МЦ), лизата тромбоцитов (ЛТ), дериватов крови телят и фибробластов роговицы. Показано, что фибробласты роговицы пролиферировали в присутствии большинства из материалов, использованных для создания конструкций, за исключением препаратов солкосерила в форме геля. Конструкции на основе ПЭГ-4000, МЦ и ЛТ удерживали фибробласты роговицы внутри себя и не препятствовали росту клеток.
Заключение. Полученные результаты указывают на возможность выделения фибробластов роговицы из малого объема материала роговицы, а также возможности использовать конструкции на основе ПЭГ-4000, МЦ и ЛТ в качестве носителя клеток.
Ключевые слова: полиэтиленгликоль, метипцелпюлоза, лизат тромбоцитов, дериваты крови телят, лентикулы роговицы, фибробласты роговиц.
DEVELOPMENT OF 3D STRUCTURES FOR CORNEAL FIBROBLASTS
A.P. Lykov1, M.A. Surovtseva1, K.Y. Krasner2, I.I. Kim1, N.A. Bondarenko1, A.N. Trunov2, V.V. Chernykh2, O.V. Poveshchenko1
1Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology — Branch of Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of SB RAS, Timakov str., 2, Novosibirsk, 630060, Russian Federation;
2Novosibirsk Branch of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Kolkhidskaya str. 10, Novosibirsk, 630071, Russian Federation E-mail: k.krasner@mntk.nsk.ru.
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Lykov Aleksander Petrovich — Leading Researcher, Candidate of Medical Sciences, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of SB RAS. Tel.: +7(913) 733-40-71. E-mail: aplykov2@ mail.ru. ORCID: 0000-0003-4897-8676.
Surovtseva Marya Alexandrovna — Senior Researcher, Candidate of Medical Sciences, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of SB RAS. Те1: +7 (905) 933-83-89. E-mail: mfelde@ ngs.ru. ORCID: 0000-0002-4752-988x.
Krasner Kristina Yuryevna — Ophthalmologist, Novosibirsk Branch of the Novosibirsk Branch of the The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution. Ш.: +7(905) 930-76-59. E-mail: k.krasner@mntk.nsk.ru. ORCID: 0000-0002-1921-8072.
Kim Irina Innokentievna — Researcher, Candidate of Medical Sciences, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of SB RAS. Те1: +7 (923) 702-45-12. E-mail: kii5@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-7380-2763.
Bondarenko Nataly Anatolievna — Junior Researcher, Candidate of Medical Sciences, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of SB RAS. Те1: +7 (913) 953-96-81. E-mail: bond802888@yandex.ru. ORCID: 0000-0002-8443-656X.
Trunov Aleksandr Nikolaevich — MD, PhD, Dr. Med. Sci., Professor, Deputy Director for Science, Novosibirsk Branch of the The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution. Те. +7 (913) 910-03-16. E-mail: trunov1963@yandex.ru. ORCID: 0000-00027592-8984.
Chernykh Valeriy Vyacheslavovich — MD, PhD, Dr. Med. Sci., Professor, Director, Novosibirsk Branch of the The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution. Те. +7 (383) 209-00-44. E-mail: sci@mntk.nsk.ru. ORCID: 0000-0002-7623-3359.
Poveshenko Olga Vladimirovna — doctor of medical sciences, professor, Head of cell technology laboratory, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of SB RAS. Тел.: +7 (383) 336-07-08. Е-mail:poveschenkoov@yandex.ru. ORCID: 0000-0001-9956-0056.
Introduction. Advances in biology and medicine in particular in the field of cell technologies allow us to test eye stem cells as an alternative to surgical treatment of corneal pathology. An option to increase the resistance of stem cells to adverse microenvironment factors in the pathological focus can be the creation of an analog of a 3D model of the stem cell niche.
The aim of the study: to study in the experiment the ability of a combination of polyethylene glycol with extracellular matrix and platelet lysate to hold corneal fibroblasts inside.
Material and Methods. The biocompatibility of corneal structures and fibroblasts isolated from corneal lenticules and the viscosity of structures in vitro were evaluated.
Results. Within 3—4 weeks, it is possible to grow up to 2—3'106 cells from corneal lenticules, which morphologically had a dendritic shape, and phenotypically carried markers of mesenchymal stem cells/fibroblasts on their surface. The study examined the biocompatibility of structures made of polyethylene glycol-4000 (PEG-4000), methylcellulose (MC), platelet lysate (PL), calf blood derivatives and corneal fibroblasts. It was shown that corneal fibroblasts proliferated in the presence of most of the materials used to create structures, with the exception of solcoseryl preparations in the form of gel. Structures based on PEG-4000, MC and PL kept corneal fibroblasts inside themselves and did not interfere with cell growth.
Conclusion. The results obtained indicate the possibility of isolating corneal fibroblasts from a small volume of corneal material, as well as the possibility of using structures based on PEG-4000, MC and PL as a cell carrier.
Key words: polyethylene glycol, methylcellulose, lysate of platelets, calf blood derivatives, corneal lenticule, corneal fibroblasts.
ВВЕДЕНИЕ
Роговица — прозрачная передняя многослойная (передний эпителий, Боуменова мембрана, строма, слой Дуа, десцеметова оболочка и эндотелий роговицы) выпуклая светопреломляющая часть глаза, подверженная воздействию факторов внешней среды (механическим, физическим и химическим агентам). Основным свойством роговицы является
прозрачность — необходимое условие для поддержания высокой остроты зрения. Заболевания глаз (воспалительного, травматического или аутоиммунного характера) снижают прозрачность роговицы и, следовательно, остроту зрения, что диктует необходимость длительного и дорогостоящего медикаментозного или хирургического лечения. Зачастую неэффективность медикаментозного лечения
повреждении роговицы является основанием для хирургического вмешательства, например, кератопластики [1]. Успехи, достигнутые в области биологии и медицины, в частности в области клеточных технологий, позволяют апробировать (в качестве альтернативы хирургического способа) для лечения патологии роговицы, стволовые клетки глаза [2—4]. Существенное значение в эффективности клеточной терапии придается устойчивости стволовых клеток к неблагоприятным факторам микроокружения в области патологического процесса [5, 6]. Вариантом повышения устойчивости столовых клеток к неблагоприятным факторам микроокружения в патологическом очаге может стать создание аналога 3Б-модели ниши стволовых клеток (внеклеточный матрикс, ростовые факторы, клетки-няньки и ство-ловые/прогениторные клетки) [7, 8].
Цель исследования: изучить 3D-конструкции фибробластов роговицы на основе полэтиленглико-ля, метилцеллюлозы, плазмы, обогащенной лизатом тромбоцитов, и депротеинизированного гемодерива-та крови телят in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на базе лаборатории клеточных технологий НИИКЭЛ-филиал ИЦиГ СО РАН (Новосибирск), зав. лабораторией д.м.н. О.В. Повешенко в 2019—2020 гг. Биологический материал получен от больных с миопией в ходе выполнения процедуры коррекции миопии на базе Новосибирского филиала ФГАУ НМИЦ МНТК микрохирургия глаза им. акад. С.Н. Федорова, давших информированное письменное согласие.
Refractive Lenticule Extraction Small-incision lenticule extraction (ReLEx SMILE, рефракционная экстракция лентикул — операции по удалению лен-тикул малого разреза) проводились по технологии, описанной в работе Sekundo [9]. Предполагаемая толщина верхней тканевой аркады (колпачка) составляла 120 мм при предполагаемом диаметре 7,5 мм, тогда как средний диаметр рефракционной лентикулы составлял 6,37+0,44 (6,0—7,0) мм. Односторонний разрез 90°, длина окружности — 3,0—4,5 мм выполнен в верхнем положении с помощью лазерной системы VisuMaxTM FS (Carl Zeiss Meditec, Германия). После процедуры разрезания преломляющая лентикула была рассечена, отделена через боковой разрез и извлечена.
Первичную культуру фибробластов роговицы (рФб) выделяли из лентикул обработкой коллаге-назы I типа (0,5 мг/мл; Gibco, США) в течение 18 ч при 37°С в центрифужных пробирках. Далее внесением эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; Hyclone, США) останавливали дезагрегацию лентикул, осаждали клетки центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин, дважды отмывали осадок клеток от остатков коллагеназы забуференным физиологическим раствором (ЗФР) центрифугированием при 1500 об./мин в течение
5 мин. Полученный осадок клеток переносили в 24-луночные планшеты (TPP, Швейцария) и культивировали в питательной среде DMEM (Панэко, Россия) с добавлением 80 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Россия), 2 мм L-глютамина (Sigma-Aldrich, США) и 10% ЭТС при 37°С/5% CO2 до получения монослоя. Среду меняли каждые 3—4 дня. Снятие клеток с пластика осуществляли внесением в лунки планшета 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствором ЭДТА (Панэко, Россия), с последующей остановкой ферментации внесением ЭТС. Затем клетки отмывали от остатков раствора трип-сина/ЭДТА в ЗФР и осаждали центрифугированием при 1500 об./мин в течение 5 мин. К осадку клеток вносили среду DMEM/F12 с добавлением 80 мкг/мл гентамицина сульфата, 2 мм L-глютамина и 10% ЭТС и растили в культуральных флаконах Т25 планшеты (TPP, Швейцария) при 37°С 5% CO2 до получения монослоя. Среду меняли каждые 3—4 дня. В экспериментах использовались клетки 4-го пассажа.
Верификацию принадлежности полученных клеток к истинным рФб проводили на проточном цитофлуориметре FACS CANTO II (BD, США) с использованием моноклональных антител CD34 (маркер кератоцитов; BD, США), CD73, CD90 и CD105 (маркер мезенхимных стволовых клеток/фибро-бластов; BD, США), кератокан, люмикан и альдегид дегидрогеназа 1 член семейства А1 (ALDH1A1) (маркеры кератоцитов / эпителиоцитов; Abcam, США).
В работе использовали полиэтиленгликоль-4000 (ПЭГ-4000; Merck, США), метилцеллюлозу (МЦ; Merck, США), солкосерил гель глазной (20%; Solcoseryl, Meda Pharma, Германия), солкосерил гель кожный (10%; Solcoseryl, Meda Pharma, Швейцария), Актовегин (40 мг/мл; Takeda Pharmaceuticals, Австрия), плазма, обогащенная лизатом тромбоцитов в качестве основ для создания 3D-конструкций in vitro.
Плазму получали путем осаждения венозной крови доноров в специальных пробирках (Plasmolifting™, Россия), содержащих тиксотроп-ный гель и гепарин натрия, в течение 6—8 мин при 3800 об./мин на центрифуге EBA200 (Hettich, Германия), далее после переноса плазмы в новые пробирки ее повторно центрифугировали при 3500 об./мин в течение 15 мин на центрифуге LMC 3000 (Biosan, Латвия), собирали надосадочную плазму (обедненная тромбоцитами плазма, ОТП), осадок тромбоцитов ресуспендировали в 1 мл ОТП, а лизат тромбоцитов (ЛТ) получали после 2 циклов — заморозки в жидком азоте и размораживание в теплой воде. Далее продукт цикла заморозки/разморозки фильтровали через миллипоровые насадки и смешивали с остальной частью ОТП, тем самым получали конечный продукт на выходе — ЛТ.
Для приготовления 2D- и 3D-конструкций использовали клетки рФб с плотностью посадки 105/см2 в питательной среде DMEM/F12 с добавлением
Рис. 1. Монослой фибробласты роговицы. 2D-модель, конфлюент-ность клеток 90%, 7-е сутки, нативный препарат (х 10) Fig. 1. Monolayer of corneal fibroblasts. 2D model, cell confluence 90%, day 7, native histological sample (х10)
Рис. 2. а — седиментация фибробластов роговицы сквозь SD-модель на основе питательной среды и полиэтиленгликоля на 7-е сутки (верх, колония клеток); б — 11-е сутки (низ, сформировавшийся монослой клеток, конфлюентность 90%), нативный препарат (х10) Fig. 2. а — sedimentation of corneal fibroblasts through a 3D-model based on a nutrient medium and polyethylene glycol on day 7 (in the upper region cell colony); b — day 11 (in the lower region formed monolayer of cells, confluence 90%), native preparation (х 10)
80 мкг/мл гентамицина сульфата, 2 мм L-глютамина и 10% ЭТС без ^D-конструкция) и с добавлением 30% от объема ПЕГ-4000, ПЭГ-4000/МЦ, ПЭГ-4000/ МЦ/ЛТ (3Б-конструкция) в 6-луночных планшетах (ТТР, Швейцария). Проведена прижизненная визуализация рФб с использованием инвертированного микроскопа Axio Observer (Carl Zeiss, Германия) с оценкой морфологических особенностей роста клеток в 2D- и 3Б-конструкциях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе 3—4 нед из 2 лентикул роговицы, полученных методом ReLEx SMILE, удается получить до 2—3*106 клеток с дендритной морфологией (рис. 1). По данным проточной цитофлоуметрии, выделенные из лентикул роговицы клетки экспрессировали маркеры мезенхимных стволовых клеток/ фибробластов (CD73 - 99%, CD90 - 95% и CD105 - 22%), не несли на своей поверхности кластеры дифференцировки кера-тоцитов/эпителиоцитов (керато-кан — 0%, люмикна — 0% и AKLH1A1 — 2,2%), а также были негативными по наличию на мембране клеток маркера, присущего кератоцитам (CD34 0%).
Как видно из рис. 2, 3, создание конструкций на основе ПЭГ-4000 и ПЭГ-4000+МЦ не обладает достаточной вязкостью для удержания рФб внутри конструкции и клетки в силу закона притяжения проходят сквозь используемый материал и дают очаги роста, колонии в случае
одного ПЭГ-4000 и разнокалиберные кластеры в случае ПЭГ-4000+МЦ на 7-е сутки и в последующем формированием монослоя рФб на дне лунки в 90 и 70% соответственно для ПЭГ-4000 и ПЭГ-4000+МЦ.
Добавление к ПЭГ-4000 ЛТ поспособствовало удержанию и разрастанию рФб (рис. 4). В случае комбинации ПЭГ-4000+МЦ+ЛТ (рис. 5) формируется более вязкая конструкция, но менее прозрачная, что явилось следствием коагуляции фибрина. Однако это не явилось существенным препятствием для удержания рФб внутри конструкции и их разрастания.
В офтальмологии часто для улучшения репара-тивных процессов роговицы используют препара-
1% a ШШШШШ
* h u i и ; Г ' ' / ■ ' о
Рис. 3. а — седиментация фибробластов роговицы сквозь SD-модель на основе питательной среды, метилцеллюлозы и полиэтиленгликоля на 7-е сутки (верх, скопления клеток); б — 11-е сутки (низ, сформировавшийся монослой клеток, конфлюентность 70%), нативный препарат (х 10) Fig. 3. а — sedimentation of corneal fibroblasts through a 3D-model based on a nutrient medium, methylcellulose and polyethylene glycol on day 7 (in the upper region clusters of cells); b — day 11 (in the lower region formed monolayer of cells, confluence of 70%), native preparation (х 10)
ты на основе депротеинизированного гемодеривата крови телят (солкосерил гель глазной, солкосерил гель кожный и актовегин для инъекций). Нами были созданы SD-конструкции на основе данных препаратов и показано, что гель солкосерил глазной (рис. 6), так и гель солкосерил кожный (рис. 7) не формируют SD-конструкцию с достаточной вязкостью, что позволило клеткам опуститься на дно лунок, но наличие в питательной среди данных препаратов катастрофично для выживания рФб, особенно для препарата солкосерил гель кожный. Что касается, SD-конструкции на основе ак-товегина, то он также не обладает достаточной вязкостью для удержания клеток внутри конструкции, они также проходят сквозь него и дают начало формированию очагов роста (колоний) к 11-м суткам (рис. 8).
Фибробласты роговицы/кера-тоциты — клетки зрелой стромы роговицы с дендритной морфологией, ответственные за гоме-остаз внеклеточного матрикса, являются важным компонентом роговицы и необходимы для восстановления повреждений роговицы. При заживлении роговицы кератоциты трансформируются в фибробластоподобные клетки [10]. Выделенные из лентикул роговицы клетки в ходе культивирования в питательной среде с ЭТС трансформировались в фибро-бластоподобные клетки, на что указывает наличие на мембране клеток характерных маркеров мезенхимных стволовых клеток/ фибробластов - CD7S, CD90 и CD 105, при этом эти клетки не экспрессировали на своей мембране характерный для керато-цитов маркер — CDS4. Показано, что первичные кератоциты трансформируются в фибробла-стоподобные клетки при наличии в питательной среде сыворотки крови и сохранности фенотипа кератоцитов в питательной среде без сыворотки крови [11]. Низкая эффективность стандартной схемы лечения повреждений роговицы, рецидив патологического процесса, нарушение прозрачности роговицы, диктуют поиск новых способов лечения. Перспективным направлением в лечении патологий роговицы может быть создание искус -
ственных конструкций на основе биополимеров. Так, в качестве кератопротеза для замены роговицы может быть использована конструкция на основе поли-(2-гидроксиэтилметакрилата), поли-(метилметакрилата) и натрия хлорида [12]. В нашем исследовании в качестве основного элемента конструкций был взят полиэтиленгликоль. Нами не выявлено токсического влияния ПЭГ-4000 на культуру фибробластов роговицы, что согласуется с данными авторов, показавших безопасность матрикса на основе ПЭГ и фибриногена для мезангиобластов [1S]. Исследуются возможности использования пленок
а (a) ■ б (b)
Рис. 4. а — рост фибробластов роговицы внутри SD-модели на основе питательной среды, полиэтиленгликоля и плазмы, обогащенной лиза-том тромбоцитов на 7-е сутки (верх, скопления клеток в виде тяжей); б — 11-е сутки (низ, утолщение и удлинение тяжей клеток), нативный препарат (х 10)
Fig. 4. а — growth of corneal fibroblasts inside a 3D model based on a nutrient medium, polyethylene glycol and plasma enriched with platelet lysate on Day 7 (in the upper region clusters of cells in the form of strands); b — 11 days (in the lower region thickening and elongation of the strands of cells), native drug (х 10)
fa (a) б (b)
Рис. 5. а — рост фибробластов роговицы внутри SD-модели на основе питательной среды, метилцеллюлозы, полиэтиленгликоля и плазмы, обогащенной лизатом тромбоцитов на 7-е сутки (верх, скопления клеток в виде тяжей); б — 11-е сутки (низ, утолщение и удлинение тяжей клеток), нативный препарат (х 10)
Fig. 5. а — growth of corneal fibroblasts inside a 3D model based on a nutrient medium, methylcellulose, polyethylene glycol, and plasma enriched with platelet lysate on day 7 (in the upper region clusters of cells in the form of strands); b — on the 11th day (in the lower region, thickening and elongation of the cell strands), the native drug (х 10)
< •' * щ-
I t
% - . . % v
.. * о
"Ч • * »
$ •: v, , ч
о -^-О «в К
« • • ч' ■.■ "
А . * » * V-нц it * ■ 1 ' * ¿tffiiV
» «г 1 > . - *№
■ ' •« * ■ '
li,, ' • * Г,в
Рис. 6. а — влияние препарата солкосерил гель глазной на рост фибробластов роговиц (3Б-модель) на 7-е сутки (верх, агрегаты клеток и единичные распластанные клетки на дне лунки планшета); б — 11-е сутки (низ, уменьшение количества агрегатов клеток), нативный препарат (х 10) Fig. 6. а — effect ofsolcoseril gel ocular on the growth of corneal fibroblasts (3D-model) on day 7 (in the upper region cell aggregates and single flattened cells at the bottom of the well).); b — 11 days (in the lower region, a decrease in the number of cell aggregates), a native drug (х 10)
Рис. 7. а — влияние препарата солкосерил гель кожный на рост фибробластов роговиц (3D-модель) на 7-е сутки (верх, агрегаты клеток на дне лунки планшета); б — 11-е сутки (низ, резкое уменьшение количества агрегатов клеток), нативный препарат (х10)
Fig. 7. а — the effect of solcoseril skin gel on the growth of corneal fibroblasts (3D model) on day 7 (in the upper region, cell aggregates at the bottom of the tablet well); b — day 11 (in the lower region, a sharp decrease in the number of cell aggregates), native drug (х 10)
полнительного терапевтического агента при лечении идиопати-ческой возрастной макулярной дегенерации [17], а также как дополнения для лечения фибробла-стами кожи ожогов кожи в эксперименте [18].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Добавление в питательную среду для фибробластов роговицы полиэтиленгликоля и сочетания полиэтиленгликоля с метилцел-люлозой не создает необходимой вязкости для удержания клеток внутри конструкции, что не позволяет создать полноценную конструкцию для применения ее в лечении повреждений роговицы. Комбинация полиэтиленгликоля с лизатом тромбоцитов, а также комбинация полиэтиленгликоля
Рис. 8. Колонии фибробластов роговицы к 11 суткам роста в 3D-модели на основе питательной среды и актовегина для инъекций, нативный препарат (х 10) Fig. 8. Corneal fibroblast colonies by 11 days of growth in a 3D model based on a culture medium and actovegin for injection, native drug (х 10)
на основе фибриноида шелка, коллагена и биополимеров в качестве носителей клеток, вовлеченных в процесс регенерации роговицы (кератоцитов, эпителиальных клеток лимба, эпителиальных клеток роговицы, стромальных фибробластов, эндоте-лиальных клеток роговицы, эпителиальных клеток коньюнктивы, пигментных эпителиальных клеток сетчатки) [14—16]. Особенностью наших конструкция является сочетание ПЭГ с компонентами внеклеточного матрикса (метилцеллюлоза) и лизатом тромбоцитов как источника цитокинов и ростовых факторов для поддержания и обеспечения архитектоники фибробластов роговицы в толще конструкции и пролиферации клеток. Ранее нами была показана эффективность использования ЛТ как до-
с метилцеллюлозой и лизатом тромбоцитов позволяет получить конструкции с вязкостью, способной удерживать фибробласты роговицы внутри и не препятствовать их разрастанию, что может быть использовано для получения 3Б-конструкций для лечения повреждений роговицы. Конструкции на основе дериватов крови телят не обладают достаточной вязкостью для удержания фибробластов роговицы внутри.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Mathews P.M., Lindsley K., Aldave A.J., Akpek E.K. Etiology of global corneal blindness and current practices of corneal transplantation: a focused review. Cornea. 2018; 37 (9): 1198-203. https://doi. org/10.1097/ic0.0000000000001666
2. Bremond-Gignac D., Copin H., Benkhalifa M. Corneal epithelial stem cells for corneal injury. Expert Opin Biol Ther. 2018; 18 (9): 997-1003. https://doi.org/10.1080/1471259 8.2018.1508443
3. Wadhawa H., Ismail S., McGhee J.J., Werf B.V., Sherwin T. Sphere-forming corneal cells repopulate dystrophic keratoconic stroma: implications for potential therapy. World J. Stem Cells. 2020; 12 (1): 35-54. https://doi. org/10.4252/wjsc.v12.i1.35
4. Zhou Y., Chen Y., Wang S., Qin F., Wang L. MSCs helped reduce scarrinh in the cornea after fungal infection when combined with anti-fungal treatment. BMC Ophthalmol. 2019; 19 (1): 226. https://doi.org/10.1186/ s12886-019-1235-6
5. Franchi F., Ramaswamy V., Olthoff M., Peterson K.M., Paulmurugan R., Rodriguez-Porcel M. Myocardial microenvironment modulates the biology of transplanted mesenchymal stem cells. Mol. Imaging Biol. 2020; 22 (4): 948-57. https://doi. org/10.1007/s11307-019-01470-y
6. Khodayari S., Khodayari H., Amiri A.Z., Eslami M., Farhud D., Hescheler J., Nayernia K. Inflammatory microenvironment of acute myocardial infarction prevents regeneration of heart with stem cells therapy Cell Phisiol Biochem. 2019; 53 (5): 887-909. https://doi.org/10.33594/000000180
7. Boutin M.E., Hampton C., Quinn R., Ferrer M., Song M.J. 3D engineering of ocular tissues for disease modeling and drug testing. Adv Exp. Med. Biol. 2019; 1186: 171-93. https:// doi.org/10.1007/978-3-030-28471-8_7
8. Becerra J., Santos-Ruiz L., Andrades J.A., Mari-Beffa M. The stem cell niche should be a key issue for cell therapy in regenerative medicine. Stem Cell Rev and Rep. 2011; 7: 248-55. https://doi.org/10.1007/ s12015-010-9195-5
9. Sekundo W., Kunert K., Russmann C., Gille A., Bissmann W., Stobrawa G., Sticker M., Bischoff M., Blum M. First efficacy and safety study of femtosecond lenticule extraction for the correction of myopia: six-month results. J. Cataract Refract Surg. 2008; 34 (9): 1513-20. https://doi. org/10.1016/j.jcrs.2008.05.033
10. Kowtharapu B., Murin R., Junemann A., Stachs O. Role of corneal stromal cells on epithelial cell function during wound healing. Int J. Mol. Sci. 2018; 19 (2): E464. https:// doi.org/10.3390/ijms19020464
11. Jester J.V., Barry-Lane P.A., Cavanagh H.D., Petroll W.M. Induction of alpha-smooth muscle actin expression and myofibroblast transformation in cultured corneal kerato-cytes. Cornea. 1996; 15: 505-16.
12. Zellander A., Wardlow M., Djalilian A., Zhao C., Abiade J., Cho M. Engineering copolymeric artificial cornea with salt porogen. J. Biomed Mater Res A. 2014; 102 (6): 1799-808. https://doi.org/10.1002/ jbm.a.34852
13. Fuoco C., Salvatori M.L., Biondo A., Shapira-Schweitzer K., Santoleri S., Antonini S., Bernardini S., Tedesco F.S., Cannata S., Seliktar D., Cossu G., Gargioli C. Injectable polyethylene glycol-fibrinogen hydrogel adjuvant improves survival and differentiation of transplanted mesoangioblasts
in acute and chronic skeletal-muscle degeneration. Skeletal Muscle. 2012; 2 (1): 24. https://doi.org/10.1186/2044-5040-2-24
14. Higa K., Takeshima N., Moro F., Kawakita T., Kawashima M., Demura M., Shimazaki J.,
Asakura T., Tsubota K., Shimmura S. Porous silk fibroin film as a transparent carrier for cultivated corbeal epithelial sheets. J Biomater Sci Polym Ed. 2011; 22 (17): 2261-76. https://doi.org/10.1163/092050610X538218
15. Mi S., Chen B., Wright B., Connon C.J. Ex vivo construction of an artificial ocular surface by combination of corbeal limbal epithelial cells and a compressed collagen scaffold containing keratocytes. Tissue Eng Part A. 2010; 16 (6): 2091-100. https://doi. org/10.1089/ten.TEA.2009.0748
16. Huhtala A., Pohionen T., Salminen L., Salminen A., Kaarniranta K., Uusitalo H. In vitro biocompatibility of degrable biopolymers in cell line cultures from various ocular tissues: extraction studies. J. Mater Sci Mater Med. 2008; 19 (2): 645-9. https://doi. org/10.1002/jbm.a.31319
17. Лыков А.П., Суровцева М.А., Повещенко О.В.. Станишевская О.М., Черных Д.В., Арбеньева Н.С., Братко В.И. Лечение идиопатической возрастной макулярной дегенерации аутологичной плазмой, обогащенной лизатом тромбоцитов: проспективное исследование. Вестник РАМН. 2018; 73 (1): 40-8. https://doi. org/10.15690/vramn932
[Lykov A.P., Poveshchenko O.V., Surovtseva M.A., et al. Autologous Plasma Enriched with Platelet Lysate for the Treatment of Idiopathic Age-Related Macular Degeneration: A Prospective Study. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2018; 73 (1): 40-8 (In Russian). https://doi. org/10.15690/vramn932]
18. Lykov A.P., Poveshchenko O.V., Bondar-enko N.A., Surovtseva M.A. Therapeutic potential of fibroblast combined with platelet-rich plasma on burn skin wound healing. J. Biol Today's World. 2019; 8 (1): 1-5. https://doi.org/10.15412/JJBTW.010
Для цитирования: Лыков А.П., Суровцева М.А., Краснер К.Ю., Ким И.И., Бондаренко Н.А., Трунов А.Н., Черных В.В., Повещенко О.В. Разработка Зй-конструкций для фибробластов роговицы. Молекулярная медицина. 2021; 19 (5): 51-57. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-05-08
Поступила 22 января 2021 г.
For citation: Lykov A.P., Surovtseva M.A., Krasner K.Y., Kim I.I., Bondarenko N.A., Trunov A.N., Chernykh V.V., Poveshchenko O.V. Development of 3D structures for corneal fibroblasts. Molekulyarnaya meditsina. 2021; 19 (5): 51-57 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2021-05-08
