CC BY
3УДК 57:579:579.8:579.8.06
А. В. Горбач1, Е. П. Михаленко1, О. Ч. Мазур1, Л. И. Кастюкевич2, О. Н. Романова2, К. Ю. Мараховский3, О. Н. Назаренко2, А. В. Кильчевский1
РАЗНООБРАЗИЕ ПАТОГЕННЫХ ТАКСОНОВ МИКРОБИОМА У ДЕТЕЙ С ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
КИШЕЧНИКА
Тосударственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: a.gorbach@igc.by ^Учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет» Республика Беларусь, 220083, г. Минск, ул. Дзержинского, 83 3Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр детской хирургии» Республика Беларусь, 220013, г. Минск, пр-т Независимости, 64А
В статье представлены результаты исследования таксономического состава потенциально патогенных и условно-патогенных микроорганизмов кишечной микробиоты у 43 пациентов детского возраста (от 0 до 18 лет) с воспалительными заболеваниями кишечника. С помощью метатаксономического анализа методом секвенирования фрагментов генов 16S рРНК был установлен таксономический состав микроорганизмов. Для количественной оценки а- и в-разнообразия потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов между тремя группами пациентов были рассчитаны индексы Шеннона и Пиэлоу, а также проведена ординация образцов. По результатам статистического анализа достоверные различия между группами отсутствуют. Полученные количественные характеристики могут помочь в разработке новых подходов в диагностике и лечении воспалительных заболеваний кишечника.
Ключевые слова: воспалительные заболевания кишечника, микробиом, таксономический состав, секвенирование генов 16S рРНК, дисбиоз.
Введение
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуются тяжелым воспалением тонкой и / или толстой кишки, приводящим к рецидивирующей диарее и боли в животе. Болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) являются двумя основными клинико-патологи-ческими подтипами ВЗК. Несмотря на то, что они являются хроническими и рецидивирующими воспалительными заболеваниями кишечника, их можно дифференцировать по локализации воспаления в желудочно-кишечном тракте и по характеру гистологических изменений в кишечной стенке. Анатомически БК может затронуть весь желудочно-кишечный тракт, хотя чаще отмечается повреждение подвздошной и толстой кишки. ЯК ограничивается прямой кишкой, толстой кишкой и слепой
кишкой. Микроскопически при БК повреждение является трансмуральным и часто прерывистым, в то время как ЯК непрерывно влияет только на слизистую оболочку кишечника [1].
Воспалительные заболевания кишечника рассматриваются как мультисистемные заболевания, возникающие под влиянием взаимодействия как генетических, так и факторов окружающей среды, таких как стресс, режим сна, использование антибиотиков, гигиенические условия, диета и курение. К генетическим предрасполагающим факторам относят нарушения генов, вовлеченных в регуляцию воспалительного ответа [2]. Несмотря на глобальный рост заболеваемости, точная этиология ВЗК остается неустановленной. Гипотеза мультифакториального патогенеза ВЗК на сегодня является наиболее обоснованной [3, 4].
Именно синергетическое действие разных факторов нарушает баланс между воспалительным ответом и иммунной толерантностью к комменсальной микробиоте в слизистой оболочке толстой кишки. Это приводит к нарушению гомеостаза и развитию ВЗК [5]. Клинические и экспериментальные данные указывают на ключевую роль дисбиоза в патогенезе ВЗК неясной этиологии [10].
Микробиом кишечника представляет собой уникальное сообщество микроорганизмов с высоким таксономическим разнообразием, локализующихся преимущественно в толстом кишечнике. Бактерии составляют более 90% этой микробной популяции (или как вариант микробиомного сообщества), однако в нем также присутствуют археи, грибы и простейшие [6]. По последним данным, в составе микробиома толстой кишки человека идентифицировано более 1 000 бактериальных видов [5].
Микробиота стимулирует дифференциров-ку и секрецию муцина клетками Панета. Муцин образует защитный гидрофильный слой на поверхности слизистой, предотвращающий прикрепление патогенов и обеспечивающий смачиваемость эпителия [8]. Бактерии кишечника стимулируют продукцию антимикробных пептидов (дефензинов, REG3A) со стороны эпителиальных клеток [9].
Классификация микроорганизмов человеческой микробиоты на «полезные» и «патогенные» представляет собой упрощенный подход. Граница между комменсалами и условно-патогенными микроорганизмами зачастую носит условный характер. Многие микробы способны выполнять как полезные, так и потенциально патогенные функции в зависимости от внешней среды и состояния иммунитета хозяина. Взаимоотношения между микроорганизмами человеческой микробиоты и иммунной системой хозяина носят динамический характер и зависят от множества факторов. Многие представители комменсальной микробиоты, например, Staphylococcus spp. и определенные виды рода Clostridium, при нормальном функционировании иммунитета остаются комменсалами и не оказывают патогенного действия [10].
Однако при иммунодефиците или дисбиозе эти же микроорганизмы способны обрести патогенные свойства вследствие нарушения де-
терминант взаимодействия с клетками хозяина [11]. Более того, отдельные штаммы одних и тех же видов могут различаться по уровню вирулентности [12]. Несбалансированность в составе потенциально патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в микробо-ценозе может оказывать влияние на эффективность проводимой антимикробной терапии у пациентов. Изменения в относительной представленности токсигенных и резистентных таксонов способны снижать чувствительность микробной популяции к антибактериальным препаратам и затруднять достижение терапевтического эффекта [13].
Поэтому целью исследования было сравнить потенциально патогенный и условно-патогенный бактериальный состав кишечного микробиома у детей с ВЗК с различной клинической картиной.
Материалы и методы
Для настоящего исследования была собрана выборка из 43 пациентов детского возраста от 0 до 18 лет (медиана 8,1 года) с ВЗК. У пациентов были диагностированы заболевания желудочно-кишечного тракта различной степени тяжести, в результате чего они были госпитализированы в учреждение здравоохранение «городская детская инфекционная клиническая больница», государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр детской хирургии», учреждение здравоохранения «4-я городская детская клиническая больница».
Все 43 пациента были разделены на три группы. Первая группа включала в себя 21 пациента, у которых был верифицирован диагноз ВЗК на основании клинических и гистологических данных. Вторая группа — 10 детей с клиническими и гистологическими проявлениями недифференцированного колита. Третья группа — 12 пациентов, с клиническими гастроэнтерологическими симптомами и отсутствием признаков патологических изменений при гистологическом исследовании образца биопсийного материала.
На момент формирования экспериментальной группы пациенты, в нее вошедшие, не получали антибактериальных препаратов. Отбор образцов ткани толстой кишки путем биопсии проводился до начала лечения.
Для постановки диагноза и разделения пациентов на три группы были применены стандартизированные методы исследования, включая сбор анамнеза, клинические обследования, лабораторные анализы (ОАК, ОАМ, БАК) и инструментальные методы исследования.
Сбор биологического материала (биопсий-ных образцов слизистой оболочки восходящего отдела толстой кишки) проводился с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с информированным согласием законного представителя пациента.
Для получения биопсийного материала толстой кишки использовался эндоскопический метод. Биологический материал после забора помещался в стерильный 0,9%-й NaCl, что позволяет сохранить целостность биообразца. Согласно разработанному унифицированному протоколу, собранный биологический материал замораживается через строго определенный интервал времени (30 мин). Далее биоматериал транспортируется в лабораторию для последующего выделения ДНК, соблюдая холодовую цепь.
Выделение ДНК из биопсийного материала толстой кишки для последующего ме-татаксономического анализа микробиома было проведено с использованием набора ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (Promega Corporation, США).
Для анализа микробиома кишечника были использованы специфические праймеры, предназначенные для амплификации V3-V4 региона гена 16S рРНК. Данный ген 16S рРНК включает в себя консервативные и вариабельные участки. Одним из фрагментов гена, используемых для определения таксономической принадлежности бактерий, является фрагмент нуклеотидной последовательности, включающий V3-V4 вариабельный регион [14, 15].
После амплификации регионов V3-V4 проводилась пробоподготовка согласно протоколу Illumina для 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (США) — метагеномного секвенирования c модификациями разработанными в лаборатории Государственного научного учреждения «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси», что гарантировало стандартизированное выполнение этапов очистки, индексирования об-
разцов и подготовки их к загрузке в прибор MiSeq (Illumina). На этапе амплификации целевых регионов использовалась стандартная ПЦР-смесь для рутинного анализа, содержащая Taq-полимеразу. На этапе присоединения индексов ПЦР-микса с 5'-3' полимеразной и 3'-5' экзонуклеазной (корректирующая) активностью и отсутствующей 5'-3' экзонуклеазной активностью был использован аналог — 2x HiFi HotStart ReadyMix (NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix, New England Biolabs).
Полученные прочтения нуклеотидных последовательностей в формате fastq проходили обработку согласно биоинформатическому конвейеру для анализа микробиомных данных, разработанному сектором биоинформатики Института генетики и цитологии НАН Беларуси.
Оценку качества библиотек ампликонов проводили с помощью программы FastQC V0.11.9, праймеры и ложные последовательности были удалены с помощью программы Cutadapt v3.1 (2020 г.). Метагеномные данные обработаны с использованием пакета DADA2 для языка программирования R. Фрагменты гена 16S рРНК выравнены и таксономически аннотированы с использованием базы данных Silva SSU NR99 (версия 138) с доверительным порогом 80% [15] и кластеризованы в операционные таксономические единицы (OTU) на расстоянии 0,03 с помощью mothur v.1.45.0 [16]. При неопределенной систематике микроорганизма осуществляли дополнительный поиск данных с помощью BLAST-анализа на основе базы RefSeq nr [22].
Результаты и обсуждение
Молекулярно-генетические методы исследования микробиоты человека, такие как анализ гена 16S рРНК, позволяют детально проанализировать состав сообществ микроорганизмов, населяющих различные экологические ниши организма человека.
Ген 16S рРНК включает в себя консервативные и вариабельные участки. Одним из фрагментов гена, используемых для определения таксономической принадлежности бактерий, является фрагмент нуклеотидной последовательности, включающий V3-V4 вариабельный регион, что позволяет идентифицировать и классифицировать их на основе последо-
вательностей этого региона. Точность и разрешение этого метода анализа микробиома в значительной степени зависят от выбранного региона [21].
Для проведения анализа был сформирован перечень потенциально патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, подлежащих оценке в каждой из изученных групп. В таблице 1 представлен перечень таксонов, который сформирован согласно NCBI [23]. Затем была проведена фильтрация полученных
данных по сформированному перечню микроорганизмов. Далее проводилось сравнение микробиоценозов между группами путем количественного и качественного сопоставления данных с целью выявления различий и установления возможных взаимосвязей.
В таблице 2 указаны результаты квантифи-кации потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов, представленные в виде процентных значений их доли от общего числа прочтений.
Таблица 1
Перечень патогенных таксонов
1 Acinetobacter baumannii 30 Enterobacter chuandaensis 58 Kosakonia oryzendophytica
2 Aerococcus viridans 31 Enterobacter cloaca 59 Kosakonia oryziphila
3 Aeromonas hydrophila 32 Enterobacter cloacae 60 Legionella pneumophila
4 Aeromonas salmonicida 33 Enterobacter hormaechei 61 Listeria innocua
5 Aeromonas sobria 34 Enterobacter kobei 62 Listeria monocytogenes
6 Aeromonas veronii 35 Enterobacter ludwigii 63 Mannheimia haemolytica
7 Bacillus cereus 36 Enterobacter mori 64 Morganella morganii
8 Bacteroides burgdorferi 37 Enterobacter oligotrophicus 65 Pasteurella multocida
9 Bacteroides fragilis 38 Enterobacter roggenkampii 66 Photobacterium damselae
10 Bacteroides vulgatus 39 Enterobacter sichuanensis 67 Phytobacter massiliensis
11 Burkholderia cepacia complex 40 Enterobacter soli 68 Pluralibacter gergoviae
12 Campylobacter concisus 41 Enterococcus faecalis 69 Proteus mirabilis
13 Campylobacter jejuni 42 Enterococcus faecium 70 Providencia alcalifaciens
14 Candida auris 43 Escherichia albertii 71 Pseudomonas aeruginosa
15 Citrobacter freundii 44 Escherichia coli 72 Ruminococcus gnavus
16 Citrobacter rodentium 45 Mycobacterium avium paratuberculosis 73 Salmonella enterica
17 Clostridioides difficile 46 Mycobacterium tuberculosis 74 Serratia marcescens
18 Clostridium botulinum 47 Neisseria gonorrhoeae 75 Shewanella algae
19 Clostridium perfringens 48 Neisseria lactamica 76 Staphylococcus aureus
20 Corynebacterium striatum 49 Neisseria meningitidis 77 Staphylococcus pseudintermedius
21 Cronobacter 50 Neisseria polysaccharea 78 Stenotrophomonas maltophilia
22 Edwardsiella ictaluri 51 Flavobacterium sychrophilum 79 Streptococcus agalactiae
23 Edwardsiella piscicida 52 Fusobacterium nucleatum 80 Streptococcus equi
24 Edwardsiella tarda 53 Fusobacterium varium 81 Streptococcus fecalis
25 Elizabethkingia anophelis 54 Helicobacter 82 Streptococcus iniae
26 Enterobacter asburiae 55 Klebsiella oxytoca 83 Streptococcus pneumoniae
27 Enterobacter bugandensis 56 Klebsiella pneumoniae 84 Streptococcus pyogenes
28 Enterobacter cancerogenus 57 Kluyvera intermedia 85 Streptococcus suis
29 Enterobacter chengduensis
Среднее количество прочтений на образец после фильтрации составил 130 349. Хотя различия в среднем количестве прочтений между группами не достигали статистической значимости (р = 0,07), наибольший про-
цент прочтений потенциально патогенных и условно-патогенных микроорганизмов был выявлен во второй группе (3,5 ± 1,1%), наименьший — в третьей группе (1,3 ± 0,1%). В первой группе этот показатель был проме-
Таблица 2
Квантификации потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов в группе
Шифр образца Количество прочтений потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов Общее количество прочтений после филтрации Процентное содержание
1 группа
32 LK 5 141 175 954 3
60/2 КК 1 357 77 272 2
22 КК 1 528 65 516 2
15 КК-2 3 490 73 537 5
15 КК-3 8 993 164 550 5
15 КК-1 2 038 60 317 3
68 КК 5 394 397 821 1
63 КК 1 204 77 272 2
8 КК 732 88 846 1
62 КК 5 448 157 314 7
23 КК 2 093 88 846 2
67 КК 4 215 144 309 3
44 КК 9 825 147 765 7
43 КК 2 748 122 247 2
55 КК-2 11 965 141 981 8
11 КК-2 2 082 174 147 1
52 КК-2 6 447 165 676 4
28 КК-1 589 244 256 0,8
26 КК 1 862 163 882 1
65 КК 2 425 124 445 2
69 КК 5 394 307 821 1,7
2 группа
51 КК 5 551 151 553 4
4 КК 1 218 70 680 2
61 КК 10 471 161 372 6
14 КК 470 62 757 1
33 КК 1 399 22 677* 6
29 КК 13 663 114 752 12
31 КК-1 1 471 205 224 1
66 КК 1 041 160 850 1
70 КК 978 67 235 1
34 КК 323 168 851 0,8
Окончание таблицы 2
Шифр образца Количество прочтений потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов Общее количество прочтений после филтрации Процентное содержание
3 группа
42 LK 1 955 137 766 1
7 КК 527 77 071 1
18 КК-2 1 741 109 702 2
25 КК 2 148 146 091 1
64 КК 1 584 164 212 1
59 КК-2 1 315 84 815 2
24 КК 2 955 156 080 2
6 КК 1 584 164 212 1
19 КК 599 84 475 1
56 КК-2 1 144 167 013 1
45 КК 3 475 155 880 2
54 КК 442 68 876 1
Примечание. * — получены предварительные данные, требующие дальнейшей верификации и уточнения
жуточным и составил 3 ± 0,4%.
Для определения альфа-разнообразия потенциально патогенных и потенциально условно-патогенных микроорганизмов в исследуемых образцах использовали индекс Шеннона и индекс Пиэлоу, которые являются одними из наиболее распространенных индексов разнообразия в микробиологических исследованиях. Индекс Шеннона позволяет оценить биоразнообразие внутри конкретного образца и выразить его в численной форме. Его расчет основан на количестве и относительной распространенности разных таксонов в образце. Индекс Шеннона учитывает как богатство видов (количество различных таксонов), так и их равномерность (относительную распространенность каждого таксона). Большое значение индекса Шеннона указывает на высокое разнообразие микроорганизмов в образце, в то время как низкое значение может свидетельствовать о доминировании некоторых определенных таксонов.
Индекс Пиэлоу — это статистический показатель, используемый для оценки равномерности распределения таксонов в сообществе. Он показывает, насколько однородно относительное обилие таксонов распределено внутри сообщества. Индекс позволяет количественно оценить степень равномерности распределе-
ния таксонов в микробиоте. Значение индекса варьируется от 0 до 1. Значение «0» указывает на полное доминирование одного таксона, распределение крайне неравномерное. Значение «1» означает идеально равномерное распределение, когда обилие каждого таксона вносит равный вклад в общую численность сообщества. Чем ближе значение индекса к 1, тем более равномерным и устойчивым является сообщество с точки зрения равного представительства разных таксонов.
В исследовании индексы Шеннона и Пиэлоу были рассчитаны только для перечня видов потенциально патогенных и условно-патогенных, который был определен для анализа в рамках данного исследования с целью оценки разнообразия именно потенциально патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (табл. 3). При этом индексы не рассчитывались для общего списка всех обнаруженных видов бактерий, поскольку не ставилась цель охарактеризовать биоразнообразие микробиоценоза в целом.
Как видно из приведенных данных (рис. 1), наибольшее значение медианы индекса Шеннона наблюдалось в группе 1, наименьшее — в группе 2.
Значения индекса Шеннона варьировали в следующих пределах:
Таблица 3
Индексы Шеннона и Пиэлоу для трех групп
Индекс Шеннона Индекс Пиэлоу
1 группа 2 группа 3 группа 1 группа 2 группа 3 группа
1,951 1,679 1,28 0,5534 0,4937 0,4347
1,41 0,4783 1,201 0,4632 0,1655 0,4239
1,531 0,8338 1,328 0,5028 0,2428 0,4791
1,48 1,076 1,716 0,4271 0,3481 0,5827
1,493 1,993 1,191 0,4233 0,6046 0,4203
1,47 1,091 1,446 0,4321 0,3177 0,491
1,213 1,853 1,987 0,35 0,5395 0,6747
1,745 1,57 1,191 0,5295 0,5242 0,4203
1,755 1,806 1,132 0,5387 0,5479 0,4084
1,375 1,543 0,3869 0,5339
1,691 1,585 0,5321 0,5383
1,067 0,3079
1,521 0,4349
1,867 0,5732
1,051 0,3006
2,04 0,5834
1,593 0,4555
1,826 0,5746
1,491 0,469
1,419 0,4057
Группа 1: медиана 1,526; минимум 1,051; максимум 2,04.
Группа 2: медиана 1,091; минимум 0,4783; максимум 1,993.
Группа 3: медиана 1,328; минимум 1,132; максимум 1,987.
Как видно из представленных данных (рис. 2), медианные значения индекса Пиэлоу были сопоставимы между группами и варьи-
группа 3
ровали в диапазоне от 0,3481 до 0,4747. Минимальные значения также не имели существенных различий между группами.
Значения индекса Пиэлоу варьировали в следующих пределах:
Группа 1: медиана 0,4555; минимум 0,3006; максимум 0,5834.
Группа 2: медиана 0,3481; минимум 0,1655; максимум 0,6046.
□ группа 1
□ группа 2 группа 3
группа 2
группа 1
0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
Рис. 1. Диаграмма распределения показателей индекса Шеннона для трех групп
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
□ группа 1 группа 2 группа 3
0,7
Рис. 2. Диаграмма распределения показателей индекса Пиэлоу для трех групп
Группа 3: медиана 0,4747; минимум 0,4084; максимум 0,6747.
Для сравнения медиан индексов Шеннона и Пиэлоу между тремя группами пациентов был использован тест Крускала-Уолли-са. По результатам анализа индекса Шеннона значения статистики Н и скорректированной Не меньше критического, р-значение больше уровня значимости 0,05. Следовательно, между группами нет статистически значимых различий. Для индекса Пиэлоу также нет значимых различий между группами по медианам (р = 0,6398).
Таким образом, применение теста Круска-ла-Уоллиса не выявило значимых отличий в медианах индексов между исследуемыми группами. На основании полученных результатов можно сделать вывод об отсутствии достоверных различий в а-разнообразии потенциально патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, оцениваемых с помощью индексов Шеннона и Пиэлоу.
Оценка Р-разнообразия представлена на рисунках 3-5. На диаграмме Р-разнообразие отражает степень расхождения в составе микробных сообществ между биологическими образцами. Путем оценки этого параметра был проведен сравнительный анализ микробиоты участников исследования.
На диаграммах четко прослеживается, что образцы первой группы демонстрируют наименьшее Р-разнообразие. Все точки плотно сгруппированы в одну область диаграммы. Это означает, что состав потенциально патогенных и условно патогенных таксонов был высоко унифицирован у пациентов этой группы. Это свидетельствует об их максимально схо-
жем качественном составе.
Во второй и третьей группах точки на диаграммах заметно рассредоточены и образуют более дисперсные скопления. Такое расположение указывает на выраженные качественные и количественные расхождения в составе потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов между отдельными пациентами этих групп, что указывает на более высокий уровень вариабельности внутри данной выборки.
Подробное распределение потенциально патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в образцах, при глубине прочтений не менее 60, представлено в таблицах 4-6. Данные в таблице позволяют сравнить уровни представленности различных патогенных и условно-патогенных таксонов между образцами. Это дает возможность выявить характерные особенности микробиома в исследуемых группах.
020-1 •зак-1
0.15-
0.Ю-
0-05- Ч1К •б
о.оо- •63 ьк 65 ЬК* <55 1_К»69 [_К
-0.05- •ж •¿зьк •зхк
-0.10- •гше
0.15-
-I—
-0,3 .0.: -0.1 0.0 3,1 0,2 0.3 0.4 0.5 N1.1051
Рис. 3. Диаграмма ординации по Р-разнообразию образцов первой группы
0.2С 015 0.100 05-1 ООО 005-■0.10 -0 15-
■0-20'
Ч1* 1.К
•61 IX
•70 Ш
*:я.к
•541
•ЯШ
-0.« 0 45 -0,30 -0.15 ООО 0.15 0,30 0,45 ЫМСв 1
Рис. 4. Диаграмма ординации по (3-разнообразию образцов второй группы
0.20'
0.130.100.050.00-■о.оз-■0.10--о.и-
-0.20
ЯК ЧМ ЬК •54Ц
•251Х
•56ЛК-2 •тьк
-0.4 4 3 -0.2 -0.1 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 5 НМИ5]
Рис. 5. Диаграмма ординации по (3-разнообразию образцов третей группы
Во всех образцах кишечного микробио-та трех исследуемых групп был выявлен Enterococcus faecalis. В силу его универсального распространения в пробах, независимо от наличия диагноза ВЗК, можно предположить участие этого микроорганизма в механизмах развития воспалительных процессов в кишечнике.
Для проверки данной гипотезы потребуются дальнейшие исследования влияния E. faecalis на состояние кишечной микробиоты и степень воспаления. В дальнейшем мы намерены провести сравнительный анализ вирулентности выделенных штаммов E. faecalis в группах пациентов с различной активностью ВЗК, а также оценить их взаимодействие с компонентами микробиценоза толстой кишки.
Известно, что E. faecalis способен проду-
цировать цитокины и медиаторы воспаления, активирующие иммунный ответ. Так, предполагается, что секреция этим патогеном интер-лейкина-8 и фактора некроза опухоли а (ФНО а) может способствовать поддержанию хронического воспаления слизистой оболочки кишечника. Повышенная численность E. faecalis в микробиоме, независимо от наличия гистологически подтвержденного ВЗК, может свидетельствовать об активации общего воспалительного каскада в кишечнике.
Развитие воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) тесно связано с микробиотой, формирующейся в его среде. При наличии ВЗК разнообразие потенциально патогенных микроорганизмов обычно снижено. Это объясняется активным иммунным ответом организма на воспалительный процесс [17].
Иммунная система эффективно нейтрализует патогены за счет таких механизмов, как фагоцитоз и других. Повышенное разнообразие микробиоты, напротив, может стимулировать иммунитет и делать его более эффективным в противодействии патогенам, в результате чего их разнообразие ограничивается.
Заключение
В результате метатаксономического анализа методом секвенирования фрагментов генов 16S рРНК был проанализирован таксономический состав потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов кишечной микробиоты у пациентов трех групп. Анализ образцов кишечного микробиома, полученных от представителей трех исследуемых когорт, продемонстрировал убикви-тарное присутствие бактериального штамма ЕЫегососсж faecalis. Принимая во внимание его повсеместное распространение в исследуемом материале, вне зависимости от верифицированного диагноза воспалительного заболевания кишечника, представляется обоснованным предположить вовлеченность ЕЫегососсж faecalis в патофизиологические механизмы, лежащие в основе развития и про-грессирования воспалительных процессов в желудочно-кишечном тракте. Для проверки этой гипотезы потребуются дальнейшее проведение исследования влияния Е. faecalis на состояние кишечной микробиоты и степень воспаления.
Таблица 4
Относительное содержание потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов в группе 1
W bJ W bJ JS w bJ <N <N hJ о hJ 1-й й hJ w hJ w bJ w hJ w bJ w hJ о w bJ w hJ T w bJ о <N J <N bJ <N J 1-й bJ w hJ so w bJ w hJ
о о so <N T-H T-H T-H so so so <N so T T Ш T—< <4 Ш <N <N so so
Acinetobacter baumannii 0,01 0,01 0,00 0,00 0,01 0,01 0,00 0,01 0,00 0,01 0,01 0,00 0,01 0,01 0,03 0,01 0,01 0,00 0,01 0,00 0,00
Aeromonas veronii 0,01 0,00 0,00 0,03 0,04 0,02 0,01 0,01 0,00 0,09 0,00 0,02 0,05 0,00 0,07 0,00 0,02 0,00 0,00 0,00 0,01
Bacillus cereus 0,07 0,08 0,06 0,04 0,04 0,04 0,01 0,02 0,03 0,16 0,07 0,02 0,05 0,07 0,04 0,05 0,06 0,00 0,02 0,02 0,01
Citrobacter freundii 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Clostridioides difficile 0,05 0,05 0,04 0,11 0,13 0,09 0,01 0,05 0,02 0,08 0,06 0,04 0,13 0,04 0,12 0,02 0,05 0,00 0,03 0,02 0,01
Clostridium botulinum 0,13 0,04 0,02 0,22 0,22 0,13 0,01 0,04 0,05 0,02 0,08 0,04 0,04 0,24 0,02 0,04 0,17 0,00 0,17 0,03 0,01
Clostridium perfringens 0,02 0,03 0,03 0,14 0,15 0,08 0,01 0,46 0,01 13,11 0,01 0,04 0,02 0,01 0,01 0,12 0,02 0,01 0,01 0,05 0,01
Edwardsiella tarda 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,00 0,01 0,01 0,00 0,01 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
Enterobacter asburiae 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,01 0,00 0,02 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
Enterobacter hormaechei 0,02 0,00 0,00 0,04 0,04 0,02 0,00 0,00 0,00 0,04 0,00 0,01 0,07 0,00 0,08 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00 0,00
Enterococcus faecalis 1,51 1,19 0,90 3,09 3,52 2,23 0,94 0,67 0,49 13,73 1,39 2,28 4,24 0,96 6,26 0,58 2,39 0,11 0,71 1,24 0,94
Enterococcus faecium 0,01 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,01 0,01 0,07 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Fusobacterium nucleatum 0,02 0,11 0,04 0,18 0,26 0,11 0,19 0,02 0,04 0,00 0,02 0,02 0,26 0,50 0,01 0,00 0,02 0,00 0,04 0,29 0,19
Fusobacterium varium 0,00 0,00 0,98 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Klebsiella pneumoniae 0,14 0,02 0,01 0,19 0,23 0,14 0,02 0,02 0,02 0,47 0,03 0,09 0,35 0,04 0,42 0,03 0,23 0,03 0,02 0,04 0,02
Morganella morganii 0,02 0,01 0,00 0,03 0,03 0,02 0,01 0,03 0,01 5,14 0,00 0,02 0,20 0,00 0,07 0,01 0,03 0,00 0,00 0,02 0,01
Salmonella enterica 0,26 0,04 0,04 0,48 0,55 0,32 0,05 0,05 0,02 1,08 0,03 0,19 0,76 0,05 1,07 0,06 0,49 0,04 0,02 0,10 0,05
Staphylococcus aureus 0,05 0,10 0,08 0,04 0,06 0,05 0,07 0,12 0,06 0,33 0,21 0,07 0,06 0,10 0,02 0,04 0,04 0,01 0,03 0,07 0,07
Streptococcus agalactiae 0,04 0,01 0,02 0,02 0,02 0,01 0,00 0,01 0,01 0,02 0,05 0,00 0,02 0,02 0,01 0,03 0,03 0,00 0,01 0,00 0,00
Streptococcus equi 0,17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,01 0,04 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00
Streptococcus iniae 0,03 0,01 0,01 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01 0,00 0,00 0,01 0,00 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
Streptococcus pneumoniae 0,07 0,01 0,01 0,01 0,01 0,00 0,00 0,01 0,01 0,02 0,11 0,01 0,08 0,08 0,01 0,03 0,05 0,00 0,01 0,01 0,00
Streptococcus pyogenes 0,24 0,01 0,05 0,04 0,05 0,04 0,00 0,01 0,01 0,03 0,16 0,01 0,05 0,09 0,02 0,12 0,11 0,00 0,02 0,01 0,00
Таблица 5
Относительное содержание потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов
в группе 2
51LK 4LK 61 LK 14LK 33LK 29LK 31LK-1 66 LK 70 LK 34LK
Aeromonas veronii 0,01 0,00 0,04 0,01 0,01 0,10 0,01 0,00 0,01 0,00
Bacillus cereus 0,03 0,00 0,03 0,01 0,20 0,09 0,00 0,03 0,01 0,00
Clostridioides difficile 0,02 0,01 0,06 0,02 0,04 0,14 0,01 0,03 0,06 0,00
Clostridium botulinum 0,02 0,01 0,02 0,00 0,05 0,07 0,00 0,12 0,01 0,00
Clostridium perfringens 0,01 0,04 0,04 0,00 0,05 0,00 0,01 0,02 0,06 0,01
Enterobacter hormaechei 0,09 0,00 0,01 0,00 0,09 0,09 0,01 0,00 0,00 0,00
Enterococcus faecalis 1,13 1,57 5,34 0,58 1,75 8,82 0,32 0,36 0,75 0,07
Klebsiella pneumoniae 0,59 0,03 0,22 0,03 0,67 0,63 0,10 0,01 0,05 0,02
Morganella morganii 0,09 0,00 0,05 0,00 0,08 0,11 0,01 0,00 0,01 0,00
Salmonella enterica 1,43 0,05 0,50 0,03 1,10 1,42 0,15 0,01 0,09 0,03
Staphylococcus aureus 0,05 0,00 0,04 0,01 1,58 0,03 0,01 0,03 0,22 0,02
Streptococcus pyogenes 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,01 0,01 0,01 0,00
Таблица 6
Относительное содержание потенциально патогенных и условно-патогенных таксонов
в группе 3
42LK 7LK 18LK-2 25LK 64 LK 59/2 LK 24LK 6LK 19LK 56LK-2 45LK 54LK
Bacillus cereus 0,04 0,01 0,04 0,06 0,04 0,02 0,08 0,04 0,03 0,03 0,04 0,02
Clostridioides difficile 0,07 0,03 0,05 0,05 0,02 0,02 0,06 0,02 0,01 0,04 0,06 0,02
Clostridium botulinum 0,09 0,00 0,11 0,22 0,02 0,02 0,36 0,02 0,02 0,09 0,11 0,03
Clostridium perfringens 0,03 0,00 0,04 0,03 0,03 0,08 0,17 0,03 0,01 0,01 0,03 0,01
Enterococcus faecalis 0,99 0,49 1,05 0,79 0,71 0,99 0,78 0,71 0,53 0,40 1,37 0,32
Fusobacterium nucleatum 0,00 0,01 0,01 0,07 0,01 0,04 0,04 0,01 0,00 0,00 0,12 0,07
Klebsiella pneumoniae 0,02 0,03 0,06 0,02 0,02 0,04 0,03 0,02 0,02 0,01 0,07 0,02
Salmonella enterica 0,02 0,02 0,09 0,02 0,03 0,10 0,04 0,03 0,03 0,01 0,11 0,03
Staphylococcus aureus 0,05 0,01 0,03 0,05 0,03 0,11 0,11 0,03 0,01 0,04 0,05 0,06
Streptococcus pneumoniae 0,00 0,00 0,00 0,02 0,00 0,01 0,04 0,00 0,00 0,00 0,04 0,00
Streptococcus pyogenes 0,05 0,05 0,03 0,05 0,01 0,01 0,07 0,01 0,01 0,02 0,09 0,01
Для сравнения а-разнообразия потенциально патогенных и условно-патогенных микроорганизмов были рассчитаны индексы Шенона и Пиэлоу. Применение теста Круска-ла-Уоллиса не выявило достоверных различий в медианных значениях индексов между группами пациентов.
Оценка Р-разнообразия позволила провести сравнительный анализ структуры микробных сообществ. Было обнаружено, что в первой группе пациентов наименьшее Р-разнообразие с максимально унифицированным составом потенциально патогенных/условно-патогенных таксонов, в то время как во второй и третьей группах было выявлено более высокое Р-разнообразие, свидетельствующее о большей вариабельности внутри групп.
Проведенное исследование позволило получить новые данные о сравнительном анализе таксономического состава и структуры сообществ потенциально патогенных и условно патогенных микроорганизмов кишечника у пациентов с различными формами воспалительных заболеваний кишечник. Полученные в настоящем исследовании данные о снижении а-разнообразия потенциально патогенных микроорганизмов при ВЗК согласуются с результатами других авторов [17, 18]. Это может быть связано с активацией иммунитета в ответ на воспаление. В то же время ряд исследований указывает на важную роль общего разнообразия кишечной микробиоты в поддержании гомеостаза и эффективности противоинфекци-онной защиты [19, 20]. Данный аспект требует дальнейшего тщательного изучения для понимания всех механизмов дисбиоза при воспалительных заболеваниях кишечника.
Анализ таксономического разнообразия кишечной микробиоты может обеспечить получение значимой информации о ее потенциальной роли в патогенезе хронических воспалительных заболеваний кишечника. Это, в свою очередь, может прояснить механизмы развития и течения данной патологии.
Перспективным представляется детальное изучение влияния отдельных таксонов микробиоты на клинические проявления и течение ВЗК.
Список использованных источников
1. Recent advances in the understanding of
inflammatory bowel disease / J. Liu [et al.] // Zhonghua Neike Zazhi. - 2019. - Vol. 58, № 3.
- P. 178-183.
2. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease / L. Jostins [et al.] // Nature. - 2012. -Vol. 491, № 7 422. - P. 119-124.
3. Kaser, A. Inflammatory bowel disease / A. Kaser, S. Zeissig, R. S. Blumberg // Annu Rev Immunol. - 2010. - Vol. 28. - P. 573-621.
4. Family history of inflammatory bowel disease alters the phenotype of affected members / J. Levine [et al.] // Inflamm Bowel Dis. - 2014.
- Vol. 20, № 9. - P. 1 572.
5. Shi, J. Diet in the integrative management of inflammatory bowel diseases / J. Shi, L. Albenberg, G. D. Wu // Gut Microbes. - 2017. - Vol. 8, № 1.
- P. 126-140.
6. Dolan, K. Diet, gut microbes, and the pathogenesis of inflammatory bowel diseases / K. Dolan, E. Chang // Mol Nutr Food Res. - 2017.
- P. 61-80.
7. Babraham Bioinformatics [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www. bioinformatics.babraham.ac.uk/ projects/fastqc.
- Дата доступа: 18.03.2024.
8. Mucin dynamics and enteric pathogens / M. A. McGuckin [et al.] // Nat Rev Microbiol. -2011. - Vol. 9. - P. 265-278.
9. Zhang, M.-Y. Role of Regenerating Islet-Derived Protein 3A in Gastrointestinal Cancer / M.-Y. Zhang, J. Wang, J. Guo // Frontiers in Oncology. - 2019. - Vol. 9. - P. 1 449.
10. Diversity of the human intestinal microbial flora / P. B. Eckburg [et al.] // Science. - 2005. -Vol. 308. - P. 1 635-1 638.
11. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project / J. Lloyd-Price [et al.] // Nature. - 2016. - Vol. 536, № 7 606. - P. 263-267.
12. Sassone-Corsi, M. No vacancy: how beneficial microbes cooperate with immunity to provide colonization resistance to pathogens / M. Sassone-Corsi, M. Raffatellu // J. Immunol. -2015. - Vol. 194, № 6. - P. 2 807-2 813.
13. Effect of proton pump inhibitors and antibiotics on the gut microbiome of hospitalised older persons / C. O'Donoghue [et al.] // J. Infect.
- 2016. - Vol. 72, № 4. - P. 498-500.
14. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-
generation sequencing-based diversity studies / A. Klindworth [et al.] // Nucleic Acids Res. -2013. - Vol. 41, № 1. - el.
15. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools / C. Quast [et al.] // Nucleic Acids Res. -2013. - Vol. 41. - P. 590-596.
16. Introducing mothur: Open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities / P. D. Schloss [et al.] // Appl. Environ. Microbiol.
- 2009. - Vol. 75. - P. 7 537-7 541.
17. Gut microbiota in health and disease / I. Sekirov [et al.] // Physiol Rev. - 2010. - Vol. 90.
- P. 859-904.
18. Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach / C. Manichanh [et al.] // Gut. - 2006.
- Vol. 55, № 2. - P. 205-211.
19. Round, J. L. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and
disease / J. L. Round, S. K. Mazmanian // Nature Reviews Immunology. - 2009. - Vol. 9, № 5. -P. 313-323.
20. Belkaid, Y. Role of the microbiota in immunity and inflammation / Y. Belkaid, T. W. Hand // Cell. - 2014. - Vol. 157, № 1. -P. 121-141.
21. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies / A. Klindworth [et al.] // PLoS One. - 2013. -Vol. 8, № 1. - e54608.
22. RefSeq: NCBI Reference Sequence Database [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/. - Дата доступа: 18.03.2024.
23. Pathogen Detection [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.nc-bi.nlm.nih.gov/pathogens/.- Дата доступа: 18.03.2024.
A. V. Gorbach1, E. P. Mikhalenka1, O. Ch. Mazur1, L. I. Kastukevich2, O. N. Romanova2, K. Y. Marakhovsky3, O. N. Nazarenko2, A. V. Kilchevsky1
DIVERSITY OF PATHOGENIC MICROBIOME TAXA IN CHILDREN WITH INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
:State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: a.gorbach@igc.by ^Educational Institution "Belarusian State Medical University" 83 Dzerzhinsky Ave., 220083 Minsk, the Republic of Belarus 3State Institution
"Republican Scientific and Practical Centre for Children's Surgery" 64A Nezavisimosti Ave., 220013 Minsk, the Republic of Belarus
The article presents the study results on the taxonomic composition of potentially pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms of the intestinal microbiota in 43 patients with inflammatory bowel diseases. Using metataxonomic analysis, by sequencing 16S rRNA gene fragments, the taxonomic composition of microorganisms was established. Shannon and Pielou indices were calculated for the quantitative assessment of a- and p-diversity of potentially pathogenic and conditionally pathogenic taxa among the three groups of patients, and the ordination of samples was performed. According to the statistical analysis results, significant differences between the groups were not observed. The obtained quantitative characteristics may contribute to the development of new approaches in the diagnosis and treatment of inflammatory bowel diseases.
Keywords: inflammatory bowel diseases, microbiome, taxonomic composition, 16S rRNA gene sequencing, dysbiosis.
Дата поступления в редакцию: 31 августа 2023 г.
