CC BY
15
УДК 612.17
DOI 10.19110/1994-5655-2019-1-64-68
Е.А. ЛЕБЕДЕВА
РАЗНОНАПРАВЛЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ УАБАИНА НА АВТОМАТИЗМ КЛЕТОК СИНОАУРИКУЛЯРНОЙ ОБЛАСТИ У МЫШИ, МОРСКОЙ СВИНКИ И КРОЛИКА
Институт физиологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар
lebedeva.physiol.komisc@ya.ru
E.A. LEBEDEVA
MULTIDIRECTIONAL EFFECTS OF OUABAIN ON AUTOMATICITY OF CELLS IN SINOAURICULAR AREA IN MOUSE, GUINEA PIG AND RABBIT
Institute of Physiology, Federal Research Centre Komi Science Centre,
Ural Branch, RAS, Syktyvkar
Аннотация
С помощью ингибиторного анализа и микроэлектродной техники установлено, что уабаин (10 мкМ), блокатор Na /K -АТФазы, у клеток водителя ритма синоаурикулярного (СА) узла мыши, приводит к замедлению частоты генерации потенциалов действия (ПД) на 14% . У клеток СА узла морской свинки и кролика уабаин вызывает положительный хронотропный эффект, а на 10-15-й минутах экспозиции - аритмии и прекращение электрической активности. Полученные различия в механизмах генерации автоматизма у этих животных необходимо учитывать при тестировании перспективных фармакологических препаратов для лечения аритмий различного генеза и разработке математических моделей генерации потенциалов действия.
Ключевые слова:
синоаурикулярный узел, потенциалы действия, уабаин, мышь, морская свинка, кролик
Abstract
The effects of ouabain on the pacemaker cells of sinoauricular (SA) node in mouse, guinea pig and rabbit were studied using standard microelectrode technique and inhibitor analysis. Ouabain (10 ^mol/l) slowed down the action potentials (APs) generation frequency in mouse SA cells (n=9) by 14%. The exposition of ouabain (10 ^mol/l) blocked the electrical activity in SA strips of guinea pig (n=6) and rabbit (n=5) after 11±2 min. At the same time, the sarcolemma depolarization, decrease of action potentials amplitude and maximal upstroke velocity in phase 0 (dV/dtmax) as well as increase in action potentials generation frequency as a result of shortening of diastolic depolarization phase, were registered. We assumed that the observed effects of ouabain were not only the result of different isoform sensitivity of Na /K+-ATPase, but also of higher intracellular concentration of ([Na+jj) in mice compared to guinea pigs and rabbit. Our findings suggest that the obtained differences in mechanisms of automatism generation in these animals should be taken into account when testing promising pharmacological preparations for the treatment of arrhythmias of different genesis and development of mathematical models of action potentials generation.
Keywords: sinoauricular node, action potentials, ouabain, mouse, guinea pig, rabbit
Введение
В поддержании клеточного гомеостаза, а также в возбуждении и сокращении сердечной мышцы участвует №+/К+- АТФаза (№+/К+-насос, NKA, /№К). В настоящее время накоплено достаточное количество экспериментальных данных о работе №+/К+-АТФазы в сердце. Однако большая их часть получена на изолированных клетках [1]. №+/К+- АТФаза
является мишенью для сердечных гликозидов -группы веществ, применяемых при лечении сердечной недостаточности. В терапевтических дозах они обладают кардиотоническим действием за счет положительного инотропного эффекта. В то же время сердечные гликозиды вызывают ряд побочных эффектов, таких как сердечные аритмии, что ограничивает их применение в клинической практике [2].
Считается, что в реализации положительного инотропного эффекта в сердце основную роль играет а2-изоформа Na+/K+- АТФазы, тогда а1-изофор-ма отвечает за насосную функцию. Чувствительность а-изоформ к сердечным гликозидам варьирует в зависимости от вида животного. Известно, что у грызунов сродство а2-изоформы к этим веществам в 1000 раз больше, чем а1-изоформы [3, 4]. У кролика, свиньи, собаки и человека различия в чувствительности к сердечным гликозидам не столь заметны, так как а1-изоформы у этих видов гораздо более чувствительны к уабаину, чем у грызунов [5]. Кроме того, экспрессия изоформ Na+/K+- АТФазы и плотность тока /NaK могут различаться в эпикарди-альной и эндокардиальной области сердца [6].
Очевидно, что для понимания роли Na+/K+-АТФазы в сердечной мышце требуются новые данные о функционировании и регуляции тока /NaK в интактных клетках в разных областях сердца у различных видов животных. Поэтому цель данного исследования заключалась в оценке вклада тока Na+/K+- АТФазы в генерации электрических импульсов в клетках синоаурикулярного узла у трех видов млекопитающих: мыши, морской свинки и кролика.
Методика исследования
Эксперименты проводили на самцах мышей-альбиносов (возраст 8-10 недель, масса тела 3035 г, n=14), морских свинок (возраст 4-5 месяцев, масса тела 500-600 г, n=11) и кроликов (возраст 67 месяцев, масса тела 3.0-3.5 кг, n=5). Экспериментальный протокол был одобрен независимым Комитетом по биоэтике Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и соответствовал международным правилам «Для использования лабораторных животных» (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8-е издание, опубликованное в National Academies Press (US), 2011 г.).
Животных обездвиживали, вскрывали грудную клетку, сердце извлекали и помещали в раствор Тироде следующего состава, мМ/л: 140 NaCl, 10 NaHCO3, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 1 MgSO4, 0,33 Na2HPO4, 10 глюкоза, 5 HEPES (pH 7.4). Сердце закрепляли на подложке в чашке Петри, удаляли желудочки, левое предсердие, вскрывали правое предсердие. Полученный препарат размером 3 * 2 мм включал в себя синоаурикулярный (СА) узел, фрагмент crista terminalis и сегменты верхней и нижней полых вен. У кролика препарат СА узла дополнительно разрезали на две спонтанно сокращающиеся полоски. Потенциалы действия (ПД) регистрировали с помощью стандартной микроэлектродной техники со стороны субэндокарда вдоль артерии СА узла в центре между верхней и нижней полыми венами (31° C) [7]. В качестве селективного
блокатора Na+/K+- АТФазы использовали аналог сердечных гликозидов - уабаин (Sigma, Германия). Обработка результатов проводилась в программе PowerGraph Professional версия 3.3 (DIsoft, Россия), Microsoft Office Excel, а также с помощью оригинальных программ вычисления параметров потенциалов в программной среде Delphy, разработанных с.н.с. Института физиологии Коми НЦ УрО РАН д.б.н. Н.В.Артеевой. Данные приведены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение (М±ст). Значимость различий определяли по U- критерию Манна-Уитни и критерию Вилкоксона. Различия считали достоверными при р<0.05.
Результаты и обсуждение
В контрольном растворе Тироде у клеток, расположенных в области артерии СА узла мыши, морской свинки и кролика, зарегистрированы ПД, имеющие медленную диастолическую деполяризацию (МДД) и скорость нарастания переднего фронта ПД в фазу 0 (dV/dtmax) от 1.6 до 6 В/с (см. таблицу). Полученные данные позволяют заключить, что зарегистрированные ПД генерируются клетками, работающими в режиме истинного водителя ритма. Спонтанная частота генерации ПД (ЧСС) составила у препаратов СА области мыши 286±16 имп/мин, у морской свинки - 103±30, у кролика - 98±20 имп/мин (табл.).
Параметры потенциалов действия клеток водителя ритма СА узла мыши, морской свинки и кролика в контроле и при экспозиции уабаина
Parameters of action potentials of pacemaker cells of SA node in mouse, guinea pig and rabbit in control and at ouabain exposition
Параметры ПД Мышь Морская свинка Кролик
Контроль n=9 Уабаин 1мкМ n=5 Уабаин 10мкМ n=9 Контроль n=5 Уабаин 1 мкМ n=5 Контроль n=3 Уабаин 1 мкМ n=3
Emax, мВ -58±10 -55±20 -57±6 -66±10 -60±7 -64±5 -65±6
АПД, мВ 45±7 38±7 40±7 64±8 68±10 71 ±4 73±4
ДПД90, мс 90±7 105±19* 107±12* 247±68 225±67 240±49 227±51
ЧСС, имп/мин 286±16 256±22* 245±25* 103±30 127±27* 98±20 101±16
МДД, мс 90±11 103±29 113±25* 309±90 215±53* 315±45 304±37
dV/dtmax, В/с 3.2±0.7 2.3±0.3* 2.1±0.7* 4.1±2.5 4.8±2.5 3.6±0.4 4.3±0.4*
V4, мВ/с 77±33 66±32 56±12* 41±9 47±8 29±8 30±9
Примечание: Emax - максимальный диастолический потенциал; АПД - амплитуда ПД; ДПД90 - длительность ПД на уровне 90% реполяризации; ЧСС -частота генерации ПД; МДД - длительность медленной диастолической деполяризации; dV/dtmax -скорость фазы быстрой деполяризации; V4 - скорость медленной диастолической деполяризации (фаза 4). * - p<0.05 достоверность различий по сравнению с контролем.
Note: Emax - maximum diastolic potential; АПД -action potential amplitude; ДПД90 - duration of AP at 90% repolarization; ЧСС - frequency of AP generation; МДД - duration of slow diastolic depolarization; dV/dtmax - velocity of rapid depolarization phase; V4 - velocity of slow diastolic depolarization (phase 4). * - p<0.05 reliability of differences compared to control.
Нами подробно проанализированы эффекты уабаина на генерацию электрической активности клеток с самой медленной скоростью фазы быстрой деполяризации У препаратов СА узла мыши уабаин (1 мкМ) приводил к замедлению частоты генерации ПД на 10% (табл.; рис.1, А; рис 2.) за счет увеличения длительности ПД на уровне 90% реполяризации (ДПД90) на 17%. Это сопровождалось замедлением скорости фазы быстрой деполяризации на 28%.
на 33% и замедление скорости фазы быстрой деполяризации на 41%. Длительность фазы МДД укорачивалась на 26%, что приводило к увеличению частоты генерации ПД на 13%. На 6-й минуте экспозиции регистрировали урежение генерации ПД в среднем на 28% по сравнению с 3 мин экспозиции уабаина и на 19% по сравнению с контролем, появление аритмий и на 10 мин - подавление спонтанной электрической активности (рис. 3, В). Стоит отметить, что прекращение электрической активности
Рис. 1. Изменение конфигурации ПД и скорости нарастания переднего фронта ПД (dV/dtmax) у клеток, работающих в режиме истинного водителя ритма СА узла мыши (А), морской свинки (Б) и кролика (В) при аппликации уабаина (1 мкМ).
Fig.1. Change in the configuration and maximal upstroke velocity (dV/dtmax) of the action potential in cells working as true pacemaker in SA node in mice (A), guinea pig (B) and rabbit (C) at application of ouabain (1 umol/l).
У клеток водителя ритма СА области морской свинки ингибирование тока Na+/K+- насоса вызывало укорочение длительности фазы МДД в среднем на 30%, что в результате приводило к увеличению частоты генерации ПД на 23% (табл.; рис. 1, Б; рис. 2). При экспозиции уабаина (1 мкМ) у клеток, работающих в режиме истинного (n=3) водителя ритма кролика, зарегистрировано увеличение скорости фазы быстрой деполяризации в среднем на 20% (рис. 1, В).
Повышение концентрации уабаина от 1 до 10 мкМ вызывало разнонаправленные эффекты у препаратов СА узла мыши, морской свинки и кролика. У клеток водителя ритма мыши уабаин (10 мкМ) приводил к замедлению частоты генерации ПД на 14% за счет увеличения ДПД90 и длительности фазы МДД на 20-25%. На треть снижались скорости фазы быстрой деполяризации (dV/dtmax) и пейсме-керного потенциала (V4) (табл., рис. 3, А).
У препаратов СА узла морской свинки и кролика уабаин в концентрации 10 мкМ приводил к прекращению электрической активности. При этом у пейсмекерных клеток морской свинки (n=6) регистрировали деполяризацию сарколеммы, монотонное снижение амплитуды ПД и скорости фазы быстрой деполяризации, а также повышение частоты генерации ПД в среднем на 35% за счет укорочения фазы МДД. На 10-15-й минутах экспозиции генерирование ПД прекращалось (рис. 3, Б).
У клеток Са узла кролика уабаин (10 мкМ, n=5) вызывал двухфазный эффект. На первой минуте экспозиции регистрировали повышение величины максимального диастолического потенциала (Emax) на 4-5 мВ. На 2-4-й минутах происходила деполяризация сарколеммы, снижение амплитуды ПД
140
Il 1 мкМ Щ 10 мкМ (5 мин) | 10 мкМ (15 мин)
Рис.2. Изменение частоты генерации ПД при экспозиции уабаина (1-10 мкМ) у клеток СА узла мыши, морской свинки и кролика. Экспозиция уабаина у мыши во всем диапазоне концентраций вызывает отрицательный хронотропный эффект, но не приводит к прекращению электрической активности, тогда как у морской свинки и кролика происходит повышение ЧСС и прекращение генерации ПД. * - p<0.05 достоверность различий по сравнению с контролем. Контроль принят за 100%. Fig.2. Change in the frequency of AP generation at application of ouabain (1-10 дmol/l) in SA node cells in mice (A), guinea pig (B) and rabbit (C). Exposure of ouabain in mice in the whole range of concentrations causes a negative chronotropic effect, but does not result in the cessation of electrical activity, whereas in guinea pig and rabbit ouabain (10 дmol/l) increases the heart rate and results in the cessation of AP generation. * - p<0.05 reliability of differences compared to control. Control is taken as 100%.
dV/dt так. В/с
О контроль • Уабаин (10 мкМ)
Б контроль J-Уабаин (10 мкМ)
О
5 I- Уабаин (10 мкМ)
контроль
О I 11 I : I : I • I •
1 Щ
Рис. 3. Влияние уабаина (10 мкМ) на конфигурацию потенциалов действия клеток водителя ритма СА узла мыши (А), морской свинки (Б) и кролика (В). Экспозиция уабаина не вызывает прекращения электрической активности в клетках СА узла мыши, тогда как у морской свинки и кролика наступает прекращение генерации ПД, которое сопровождается повышением частоты генерации ПД и аритмиями. Fig.3. The effect of ouabain (10 дто1/1) on the configuration of the action potentials of pacemaker cells in SA node of mouse (A), guinea pig (B) and rabbit (C). The exposition of ouabain ((10 дmol/l) does not cause cessation of electrical activity in SA node cells in mice, whereas in guinea pig and rabbit there is the cessation of AP generation accompanied by increase in the frequency of AP generation and arrhythmias.
у препаратов СА узла мыши регистрировали при 100 мкМ уабаина (п=3) на 15-й минуте экспозиции. Это сопровождалось снижением частоты генерации ПД на 24% и появлением аритмий.
Общепризнано, что умеренное ингибирова-ние (~30%) №+/К+- АТФазы сердечными гликозида-ми приводит к увеличению сократимости сердца за счет понижения активности №+/Са2+- обменного механизма ^СХ). Поскольку активность NCX регулируется внутриклеточной концентрацией ионов натрия ([№+}), то даже небольшое увеличение [№+} приводит к тому, что №+/Са2+ - обменный механизм удаляет меньше Са2+ из клетки, это повышает содержание Са2+ в цитозоле и саркоплазматическом ретикулуме. Более сильное ингибирование (> 50%) №+/К+- АТФазы перегружает клетку кальцием, критически изменяет мембранный потенциал, снижая сократимость и вызывая сердечные аритмии [6, 8].
Подробный анализ полученных нами результатов показал, что в присутствии уабаина у клеток, работающих в режиме истинного водителя ритма, СА узла морской свинки и кролика наблюдается положительный хронотропный эффект. Ряд авторов [9] связывает это с увеличением [№+}, которое приводит к изменению кальциевой нагрузки в сар-коплазматическом ретикулюме и увеличивает амплитуду локальных выбросов Са2+. Появление аритмии и прекращение генерации ПД, зарегистрированные нами у этих животных, являются побочными эффектами сердечных гликозидов, вызванными перегрузкой Са2+-депо саркоплазматического рети-кулюма и спонтанного освобождения ионов Са2+ через рианодиновые рецепторы ПД [9-11].
Однако у клеток, работающих в режиме истинного водителя ритма, СА узла мыши во всем диапазоне исследуемых концентраций (1-100 мкМ), уаба-
ин не вызывал положительный хронотропный эффект. При ингибировании Na+/K+- АТФазы частота генерации ПД замедлялась на 10-24%. Вероятно, это связано с особенностями поддержания кальциевого гомеостаза у грызунов. Известно, что активность Na+/Ca2+- обменного механизма (NCX) у кролика в два-три раза выше, чем у крысы и мыши [10, 12]. Это позволяет заключить, что опосредованное снижение работы NCX путем частичного ингибирования Na+/K+- АТФазы не приводит к существенному накоплению Са2+ в клетках у грызунов. В то же время [Na+]i в цитозоле у этих животных выше (14-16 мМ для крысы и мыши против 4-8 мМ у кролика и морской свинки) [6] и даже незначительное увеличение [Na+]i в результате ингибирова-ния Na+/K+- АТФазы, как мы предполагаем, может вызвать частичную инактивацию Na+- каналов. Поскольку №+-ток участвует в формировании фазы медленной диастолической деполяризации и фазы быстрой деполяризации у клеток водителя ритма мыши [13], то его инактивация приводит к замедлению генерации ПД.
Заключение
Установлено, что клетки СА узла мыши более чувствительны к повышению внутриклеточной концентрации ионов натрия при ингибировании Na+/K+-АТФазы, чем клетки СА узла морской свинки и кролика. Полученные различия в механизмах генерации автоматизма у этих животных необходимо учитывать при тестировании перспективных фармакологических препаратов для лечения аритмий различного генеза и разработке математических моделей генерации потенциалов действия.
Работа поддержана грантом РФФИ мол_а № 18-34-00654.
Литература
1. Oka C., Cha C.Y., Noma A. Characterization of the cardiac Na+/K+ pump by development of a comprehensive and mechanistic model // J. Theor. Biol. 2010. Vol. 265 (1). P. 68-77.
2. Li Q, Pogwizd S.M., Prabhu S.D., Zhou L. Inhibiting Na+/K+ ATPase can impair mito-chondrial energetics and induce abnormal Ca2+ cycling and automaticity in guinea pig cardiomyocytes // PLoS One. 2014. Vol. 9 (4). e93928. doi: 10.1371/journal.pone.0093928.
3. The alpha(1)- and alpha(2)-isoforms of Na-K-ATPase play different roles in skeletal muscle contractility / S.He, D.A.Shelly, A.E.Mo-seley, P.F.James, J.H.James, R.J.Paul, J.B. Lingrel//Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2001. Vol. 281 (3). P. R917-925.
4. The alpha2 isoform of Na,K-ATPase mediates ouabain-induced cardiac inotropy in mice / I.Dos-tanic, J.N.Lorenz, Jel J.Schultz, I.L.Grupp, J.C.Neumann, M.A.Wani, J.B.Lingrel // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278 (52). P. 5302653034.
5. Blanco G., Mercer R.W. Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 275 (5 Pt 2). P. F633-650.
6. Despa S, Bers D.M. Na* transport in the normal and failing heart - remember the balance// J. Mol. Cell Cardiol. 2013. Vol. 61. P. 2-10.
7. Gonotkov MA., Golovko VA. The negative chro-notropic effect of Cs+ ions on generation of transmembrane potentials in mouse sinoatrial node cells // Bull. Exp. Biology and Medicine. 2011. Vol. 152. № 2. P. 169-172.
8. Identification of a specific role for the Na,K-ATPase alpha 2 isoform as a regulator of calcium in the heart / P.F.James, I.L.Grupp,
G.Grupp, A.L.Woo, G.R.Askew, M.L.Croyle, R.A.Walsh, J.B. Lingrel // Mol Cell. 1999. Vol. 3 (5). P. 555-563.
9. Electrochemical Na+ and Ca2+ gradients drive coupled-clock regulation of automaticity of isolated rabbit sinoatrial nodal pacemaker cells/ S.G.Sirenko, V.A.Maltsev, Y.Yaniv, R.Bychkov, D.Yaeger, T.Vinogradova, H.A.Spur-geon, E.G. Lakatta // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2016. Vol. 311 (1). P. 251-267.
10. Regulation of Na+/Ca2+ exchange current in the normal and failing heart / M.Reppel, B.K.Fleischmann, H.Reuter, F.Pillekamp,
H.Schunkert, J. Hescheler // Ann. NY Acad. Sci. 2007. Vol. 1099. P.361-372.
11. Krivoi I.I. Regulatory function of the Na,K-ATPase a2-isoform // Biophysics. 2012. Vol. 57. № 5. P. 592-606.
12. Bassani J.W., Bassani RA., Bers D.M. Relaxation in rabbit and rat cardiac cells: species-dependent differences in cellular mechanisms// J. Physiol. 1994. Vol. 476 (2). P. 279-293.
13. Головко ВА., Лебедева ЕА. Участие чувствительного к лидокаину и тетродотоксину тока в генерировании фазы быстрой деполяризации потенциалов действия с низкой dV/dtмакс у клеток синоаурикулярного узла мыши // Фiзiологiчний журн. 2013. Т. 59. №5. С 31-40.
Golovko V.A., Lebedeva E.A. Uchastiye chu-vstvitel'nogo k lidokainu i tetrodotoksinu to-ka v generirovanii fazy bystroy depolyarizatsii potentsialov deystviya s nizkoy dV/dtmaks u kletok sinoaurikulyarnogo uzla myshi [The involvement of lidocaine and tetrodotoxin-sensitive current in the generation of action potentials with low DV/DT max in cells of sinoauricular node in mouse] // Physiology J. 2013. Vol. 59 (5). P. 31-40.
Статья поступила в редакцию 28.05.2018.
