CC BY
12
■ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕЖДИСЦИПЛИНАРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ
Мухамадияров Ринат Авхадиевич -кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины ФГБНУ НИИ КПССЗ (Кемерово, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5558-3229
Ключевые слова:
тетрада Фалло; стентирование; неоинтима; голометаллические стенты; политетрафторэтилен
Различия структуры неоинтимы на голометаллическом стенте и заплате из политетрафторэтилена у детей после двухэтапной хирургической коррекции тетрады Фалло
Мухамадияров Р.А., Евтушенко А.В., Тарасов Р.С., Халивопуло И.К., Ляпин А.А., Кутихин А.Г.
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», 650002, г. Кемерово, Российская Федерация
Актуальность. Формирование неоинтимы - распространенный процесс после реконструктивных операций на структурных элементах сердечно-сосудистой системы с использованием металлических, полимерных или гетерологических (ксеногенных) биоматериалов. В конечном счете формирование неоинтимы может приводить к развитию гемодинамически значимого стеноза и может потребовать повторного хирургического вмешательства. Решение задачи долговременного сохранения оптимальной гемодинамики при имплантации различных биоматериалов за счет профилактики гиперпластических процессов (в том числе за счет своевременной эндотелизации) в первую очередь требует детального изучения клеточного состава неоинтимы. Цель - изучить особенности ультраструктурного строения стенок легочной артерии (ЛА) на разных стадиях двухэтапной коррекции тетрады Фалло (ТФ) у маловесных детей с использованием голометаллических стентов и сосудистых заплат из политетрафторэтилена (ПТФЭ, Gore-Tex). Материал и методы. Исследовано 6 образцов участков ЛА в стентах, извлеченных из выводного отдела правого желудочка (ВОПЖ) и ствола ЛА во время радикальной хирургической коррекции ТФ у маловесных детей (массой тела <3 кг). Период стентирования голометаллическим стентом составлял от 2,5 до 6 мес. Фрагменты стенки ЛА, содержащие в своей структуре части заплаты из искусственно синтезируемого биостабильного полимера ПТФЭ, были извлечены в процессе репротезирования клапана ЛА по поводу его функционально значимой недостаточности через 10-13 лет после выполнения второго этапа операции.
Образцы фиксировали в забуференном формалине с постфиксацией тетраоксидом осмия, обезвоживали в этаноле и ацетоне и пропитывали эпоксидной смолой. После полимеризации смолы образцы шлифовали и полировали до нужной глубины. Для повышения электронного контраста образцы обрабатывали спиртовым раствором уранилацетата в процессе обезвоживания и цитратом свинца по Рейнольдсу после полировки эпоксидных блоков. Образцы визуализировали посредством сканирующей электронной микроскопии в режиме обратно-рассеянных электронов.
Результаты. Неоинтима в стентированных участках ЛА состояла из чередующихся слоев плотной и рыхлой ткани, образованной клетками фибробластического ряда и гладкомышечными клетками, в структуру которой были погружены элементы металлического стента, окруженные плотной соединительной тканью. На границе с просветом сосуда присутствовал сплошной слой эндотелия. Неоинтима на поверхности сосудистой заплаты из ПТФЭ имела нетипичное строение и содержала плотный слой эластических волокон, непосредственно прилегающих к эндотелию, а также плотный слой фиброцитов с прилегающими коллагеновыми волокнами. В краевых участках заплаты встречались участки кальцификации, затрагивающие собственно материал заплаты и окружающие ткани.
Заключение. Неоинтима голометаллических стентов и заплат из искусственного биостабильного полимера ПТФЭ имеет различную структуру, однако в обоих вариантах характеризуется отсутствием признаков острого воспаления.
I
Финансирование. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2021-001 «Разработка новых фармакологических подходов к экспериментальной терапии атеросклероза и комплексных цифровых решений на основе искусственного интеллекта для автоматизированной диагностики патологий системы кровообращения и определения риска летального исхода» при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках национального проекта «Наука и университеты».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Мухамадияров Р.А., Евтушенко А.В., Тарасов Р.С., Халивопуло И.К., Ляпин А.А., Кутихин А.Г. Различия структуры неоинтимы на голометаллическом стенте и заплате из политетрафторэтилена у детей после двухэтапной хирургической коррекции тетрады Фалло // Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал имени академика Б.В. Петровского. 2022. Т. 10, № 3. С. 64-75. DOI: https://doi.org/10.33029/2308-1198-2022-10-3-64-75 Статья поступила в редакцию 28.04.2022. Принята в печать 01.08.2022.
Structure of neointima in bare metal stents and expanded poly(tetrafluoroethylene) patches in children after two-step surgical treatment of tetralogy of Fallot
Mukhamadiyarov R.A., Evtushenko A.V., Tarasov R.S., Khalivopulo I.K., Lyapin A.A., Kutikhin A.G.
Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, 650002, Kemerovo, Russian Federation
Background. Neointimal hyperplasia frequently accompanies reconstructive cardiovascular surgery which commonly utilises metal, polymer or xenogeneic biomaterials. If uncontrolled, neointimal hyperplasia results in vascular occlusion ultimately requiring repeated surgery. Therefore, long-term maintenance of primary patency requires prevention of neointimal hyperplasia by means of rapid endothelialisation. Success of this task significantly depends on our understanding of neointimal composition and ultrastructure.
Aim: to investigate ultrastructure of pulmonary artery (PA) at both steps of total surgical repair in low-birth-weight children with tetralogy of Fallot (ToF), where the first and the second step employ bare metal stents and expanded poly(tetrafluoroethylene) patches (ePTFE, Gore-Tex). Material and methods. Here, we investigated six PA segments in the stents excised from right ventricular outflow tract (RVOT) and pulmonary artery during the total surgical repair in low-birth-weight (<3 kg) children with ToF. Stents functioned from 2.5 to 6 months. PA with ePTFE patches were excised during the repeated replacement of the pulmonary valve because of its failure in 1013 years after the total surgical repair. Tissue samples were fixed in formalin, postfixed in osmium tetroxide, stained with uranyl acetate, dehydrated in ethanol and acetone and impregnated into epoxy resin. Upon epoxy resin embedding, samples were grinded, polished, counterstained with lead citrate, and visualised by backscattered scanning electron microscopy. Results. Neointima in stented PA was fully endothelialised and consisted of dense or loose connective tissue which was formed by fibroblasts and smooth muscle cells and enclosed the stent struts. Neointima at the surface of ePTFE patches contained elastic fibers below the endothelial monolayer and a fibroblast layer surrounded by collagen fibers. ePTFE patches suffered from marginal calcification extending to the adjacent tissues.
Conclusion. Neointima in bare metal stents and expanded poly(tetrafluoroethylene) patches have different histoarchitecture but is free from acute inflammation.
Funding. This study was supported by the Complex Program of Basic Research under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences within the Basic Research Topic of Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases No. 0419-2021-001 "Novel anti-atherosclerotic therapies and machine learning solutions for automated diagnosis and prognostication of cardiovascular disease". The study is financially supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (National Project Science and Universities).
For citation: Mukhamadiyarov R.A., Evtushenko A.V., Tarasov R.S., Khalivopulo I.K., Lyapin A.A., Kutikhin A.G. Structure of neointima in bare metal stents and expanded poly (tetrafluoroethylene) patches in children after two-step surgical treatment of tetralogy of Fallot. Clinical and Experimental Surgery. Petrovsky Journal. 2022; 10 (3): 64-75. DOI: https://doi. org/10.33029/2308-1198-2022-10-3-64-75 (in Russian) Received 28.04.2022. Accepted 01.08.2022.
OORRESPONDENCE
Rinat A. Mukhamadiyarov -MD, Senior Researcher, Laboratory of Molecular, Translational and Digital Medirine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (Kemerovo, Russian Federation)
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0002-5558-
3229
Keywords:
tetralogy of Fallot; stenting; neointima; bare metal stents; poly(tetrafluoroethylene)
В настоящее время в сердечно-сосудистой хирургии широко применяют оперативные вмешательства по реконструкции структурных элементов сердечно-сосудистой системы с применением заплат из различных материалов искусственного и природного происхождения в качестве заменителей собственных тканей пациентов [1-4]. Одним из таких оперативных вмешательств является двухэтапная хирургическая коррекция тетрады Фалло (ТФ) у маловесных (массой тела <3 кг) детей [5, 6].
На первом этапе для подготовки центрального легочного русла и левых отделов сердца к коррекции (уменьшения степени гиповолемии малого круга кровообращения) проводится стентирова-ние выводного отдела правого желудочка (ВОПЖ). На втором этапе, во время радикальной хирургической коррекции, стент извлекают, выполняют иссечение гипертрофированных септопариеталь-ных трабекул, трансаннулярную пластику ВОПЖ и ствола ЛА с применением сосудистых заплат, закрытие дефекта межжелудочковой перегородки.
В ряде случаев пациентам после второго этапа (радикальной коррекции ТФ) требуется повторное хирургическое вмешательство. В раннем и среднесрочном периоде причиной этого является гипертрофия неоинтимы, приводящая к рецидиву право-желудочковой обструкции пути оттока в результате вторичного стеноза в зоне ранее выполнявшейся пластики. В отдаленном периоде (8-13 лет) основной причиной реоперации у детей, которым выполняли трансаннулярную пластику, является прогрес-сирование правожелудочковой недостаточности на фоне недостаточности клапана ЛА.
Как на первом, так и на втором этапе операции в структуру сердца имплантируют чужеродный материал [металлический стент на первом этапе и сосудистую заплату из искусственного биостабильного полимера политетрафторэтилена (ПТФЭ) на втором]. Следует отметить: если срок имплантации металлического стента идет на месяцы (в среднем ~3 мес), в случае с имплантацией сосудистой заплаты речь идет о годах (8-13 лет). В процессе интеграции биоматериалы взаимодействуют с тканями реципиента, приводя к формированию неоинтимы, изолирующей имплантированные элементы от прямого контакта с кровотоком [7-9]. Изначально физиологическая реакция формирования неоинтимы при неконтролируемом иммунном ответе на имплантат приводит к патологическому разрастанию неоинтимы в просвет сосуда и к нежелательным изменениям локальной гемодинамики, в частности к изменению типа кровотока с протективного ламинарного на атерогенный турбулентный.
Повышение биосовместимости имплантируемых материалов в первую очередь требует изуче-
ния структурно-функциональных закономерностей формирования неоинтимы. В этой связи представляет интерес сравнительное исследование структурных особенностей неоинтимы, сформировавшейся на поверхности голометаллического стента в ВОПЖ и ЛА после первого этапа хирургической коррекции ТФ и на поверхности сосудистой заплаты из ПТФЭ, из которой были сформированы ВОПЖ и часть ствола ЛА на втором этапе хирургической коррекции ТФ.
Важным аспектом такого сравнительного исследования является то, что выбранные для исследования имплантаты (стент и заплата) характеризуются сходной анатомической локализацией, однако принципиально отличаются по своему составу (металл у стента и полимер у заплаты) и длительности функционирования (короткая у стента и продолжительная у заплаты).
Материал и методы
В работе было использовано 2 группы образцов. В 1-ю группу вошли 6 образцов стентированных участков ствола ЛА, извлеченных при радикальной коррекции ТФ (второй этап двухэтапной хирургической коррекции) у маловесных детей. Стентирова-ние ВОПЖ (первый этап 2-этапной хирургической коррекции) было выполнено в возрасте от 1 дня до 2,5 мес (в среднем 27,8 дня). Масса тела пациентов на первом этапе в среднем составляла 2,2+0,44 кг при сатурации 68,7+5,4%. Стентиро-вание выполняли с использованием голометал-лических коронарных стентов PRO-Kinetic Energy (Biotronik) диаметром 5 мм и длиной 18-20 мм. Ко второму этапу вмешательства масса тела пациентов составляла 4,7+0,9 кг при сатурации 96,5+3,2%.
Радикальная хирургическая коррекция ТФ с извлечением стента и трансаннулярной пластикой ВОПЖ и ствола ЛА при помощи заплаты из ПТФЭ (Gore-Tex) была проведена в сроки от 2,5 до 6 мес (в среднем через 3,2 мес) после стентирования ЛА. Эксплантация стента выполнялась при помощи его последовательного иссечения скальпелем из ВОПЖ и участка ствола ЛА вместе с окружающими тканями.
Во 2-ю группу вошли 2 образца, извлеченные у пациентов во время реконструктивной операции через 10 и 13 лет после выполнения второго этапа (радикальной хирургической коррекции ТФ) вследствие появления клинически значимых признаков дисфункции правого желудочка и медицинских показаний для протезирования клапана ЛА. Вмешательство проводилось в условиях эндотрахеального наркоза. На параллельном искусственном кровообращении были выполнены иссечение заплаты ПТФЭ из ствола ЛА и импланта-
ция биологического протеза «ЮниЛайн» (НеоКор). Целостность ствола ЛА восстановлена с использованием ксеноперикардиальной заплаты «КемПе-риплас-Нео» (НеоКор). В исследовании использовали фрагменты заплаты из ПТФЭ, находившейся в стволе ЛА.
Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации (2013). Протокол исследования был одобрен локальным Этическим комитетом ФГБНУ НИИ КПССЗ. До включения в работу от официальных представителей пациентов (во всех случаях - от родителей) получено письменное информированное согласие на использование экс-плантированных биоматериалов в научно-исследовательских целях.
Для ультраструктурных исследований использовали ранее разработанный нашей группой оригинальный вариант сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM), который позволяет получать микрофотографии высокого разрешения, визуально сходные с получаемыми при просвечивающей электронной микроскопии [10].
Извлеченные образцы промывали в охлажденном физиологическом растворе хлорида натрия и помещали в забуференный (рН 7,4) 10% водный раствор формалина (B06-003, БиоВитрум) на 24 ч с однократной сменой формалина через первые 12 ч. На следующем этапе образцы постфикси-ровали в 1% тетраоксиде осмия (19110, Electron Microscopy Sciences), приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере, в течение 12 ч, и далее окрашивали 2% водным раствором тетраоксида осмия в течение 48 ч. Далее образцы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (50, 60, 70, 80 и 95%, по две 15-минутных смены в каждой концентрации). После этого образцы докрашивали 2% спиртовым (95% этанол) раствором уранилацетата (22400-2, Electron Microscopy Sciences) в течение 5 ч и обезвоживали в изопропаноле (06-002, БиоВитрум) в течение 5 ч и ацетоне (150495, ЛенРеактив) в течение 1 ч. Затем образцы пропитывали смесью эпоксидной смолы Araldite 502 (13900, Electron Microscopy Sciences) и ацетона в соотношении 1 : 1 в течение 6 ч, чистой эпоксидной смолой в течение 24 ч и далее полимеризовали в свежей эпоксидной смоле в емкостях FixiForm (40300085, Struers) при 60 °C в течение 24 ч. Получившиеся эпоксидные блоки шлифовали до поверхности образца и полировали на установке TegraPol-11 (Struers) с последовательным использованием шлифовальных дисков с диаметром зерна 9, 6 и 3 мкм. После полировки образцы контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (17810, Electron Microscopy Sciences) в течение 15 мин путем нанесения раствора на
отполированную поверхность блока. После отмывки в бидистиллированной воде на эпоксидные блоки наносили углеродное напыление толщиной 10-15 нм с помощью вакуумного напылительного поста (EM ACE200, Leica).
Визуализацию структуры образцов выполняли при помощи сканирующей электронной микроскопии в режиме вторичных (обратно-рассеянных) электронов (BSECOMP) на электронном микроскопе Hitachi S-3400N (Hitachi) при ускоряющем напряжении 10 или 15 кВ.
Результаты
На стадии извлечения стента из ВОПЖ весь материал стента был полностью погружен в ткани ин-фундибулума, в стволе ЛА стент преимущественно располагался свободно, имея небольшие участки контакта со стволом ЛА, при этом в данных зонах отмечалось прорастание в ствол ЛА (рис. 1А, Б). По различиям в электронной плотности можно было выделить 2 слоя: светлый и темный.
Темный (более электронно-плотный) слой представлял собой остатки стенки ствола ЛА, светлый (менее электронно-плотный) - вновь образованную ткань стенки. С внешней стороны стенки сосуда металлические структуры стента лежали на медии исходной стенки ствола ЛА. Металлические элементы стента были окружены плотным слоем соединительной ткани, содержащей фиброциты с небольшим количеством гладкомышечных клеток (ГМК) (рис. 1В). Вблизи области контакта стента с тканями, помимо клеток фибробластического ряда и ГМК, часто наблюдали присутствие макрофагов (рис. 1Г).
Светлую ткань с относительно малой электронной плотностью и соединительнотканную оболочку материала стента можно рассматривать как один из вариантов развития неоинтимы, так как эти структуры образовались на обнаженной в процессе стентирования поверхности сосуда.
Граница неоинтимы с просветом сосуда была представлена эндотелием (рис. 2А-В). Эндотелио-циты обычно имели характерную ультраструктуру, уплощенную форму клеток, тесные контакты с соседними клетками, вытянутые ядра с небольшим количеством эухроматина (рис. 2В, Г).
Субэндотелиальный слой, как правило, был представлен несколькими слоями упорядоченно расположенных ГМК и фиброцитов (см. рис. 2В, Г). Вместе с тем в некоторых участках субэндотелиаль-ного слоя наблюдалось рыхлое расположение фи-бробластов и ГМК (рис. 2Г, Д). В целом внутренняя структура неоинтимы была образована чередующимися слоями плотной и рыхлой ткани, в составе которой встречались отдельные пучки коллагеновых волокон и капилляры (рис. 2Д, Е).
Рис. 1. Интеграция материала голометаллического стента в структуру ствола легочной артерии (ЛА): А, Б - расположение стента на остатках стенки ствола ЛА, обладающих высокой электронной плотностью. Светлый слой неоинтимы в направлении просвета сосуда; В - плотный слой соединительной ткани, окружающий стойку стента; Г - клеточное микроокружение вблизи стойки стента
Fig. 1. Integration of bare metal stent into the pulmonary artery: A, B - stent located within the residual pulmonary artery having high electron density. Light neointimal layer is located towards the vessel lumen; C - dense connective tissue layer around the stent strut; D - cellular microenvironment around the stent strut
Заплата из ПТФЭ в структуре стенки ствола ЛА на срезе представляла собой извилистый слой с умеренной электронной плотностью, находящийся в глубине соединительной ткани. С обеих поверхностей заплата была окружена фиброцитами с коллагено-выми волокнами (рис. 3А-Г). Выраженные клеточные проявления воспалительной реакции в тканях реципиента отсутствовали. Со стороны эндотелия границу между заплатой и тканью представлял плотный контакт между ними (рис. 3Д). С противоположной стороны заплаты на границе мог присутствовать слой клеток, образованный ГМК и фиброцитами (рис. 3Е). Вблизи таких участков отмечали наличие капилляров. Участки заплаты, имеющие выпуклость в направлении просвета сосуда, были покрыты плотным темным слоем соединительной ткани, а вогнутые участки были покрыты рыхлой светлой соединительной тканью (см. рис. 3А-Г).
С обеих поверхностей миграции клеток вглубь заплаты не наблюдалось. Вероятно, структурная
целостность комплекса заплаты с соединительными тканями поддерживается за счет адгезии. Этот контакт исходно является плотным, но при эксплантации материала могло происходить расслоение по месту контакта, которое может находиться по любой поверхности заплаты (см. рис. 3А, Б). С внешней поверхности заплаты встречались отдельные макрофаги, но признаки активного воспаления отсутствовали. Кроме единичных макрофагов, других иммунных клеток не обнаружено. С обеих поверхностей электронная плотность заплаты в областях, прилегающих к биологической ткани, была выше, чем в ее центральной части. В этих участках наблюдали присутствие отдельных мелких, диф-фузно расположенных электронно-плотных частиц (см. рис. 3Г, Е).
Все ткани на поверхности заплаты, обращенной в направлении просвета сосуда, можно отнести к неоинтиме, так как изначально на заплате клетки реципиента отсутствовали. Однако структура такой
S3400 15.0kVx1.00k BSECOMP ' .......50.0um I S3400 15.0kV x2.00k BSECOMP ........20.0um
Рис. 2. Структура неоинтимы ствола легочной артерии (ЛА), находящейся вблизи металлического стента: А - общий вид; Б - сплошной слой эндотелия с субэндотелиальным слоем; В - типичные эндотелиоциты на границе с просветом сосуда и содержащим гладкомышечные клетки (ГМК) и фиброциты субэндотелиальным слоем; Г - полиморфизм клеток эндотелия, лежащих на рыхлом субэндотелиальном слое с ГМК и фиброцитами; Д, Е - коллагеновые волокна в структуре неоинтимы
Fig. 2. Structure of pulmonary artery neointima adjacent to the bare metal stent. A - overview; B - endothelial monolayer and subendothelial layer; C - endothelial cells on the luminal surface and subendothelial layer with vascular smooth muscle cells and fibroblasts; D - polymorphic endothelial cells located on the loose subendothelial layer with vascular smooth muscle cells and fibroblasts; E, F - collagen fibers within the neointima
неоинтимы имела существенные отличия от типичной неоинтимы. Большая часть внутренней поверхности была покрыта эндотелием, но его структура была разнообразна (рис. 4А, Б). Как правило, эндотелиоциты имели уплощенную форму клеток и ядер. Вместе с тем встречались участки с нетипичной формой клеток (рис. 4В, Г). Цитоплазма эндо-телиоцитов обладала умеренной электронной плотностью и содержала крупные вакуоли (рис. 4Г, Д). Слой эндотелия непосредственно прилегал к слою
эластических волокон либо между ними находился неструктурированный материал с низкой электронной плотностью (см. рис. 4Б-Д).
Субэндотелиальный слой полностью отсутствовал, при этом характерной особенностью рассматриваемого варианта неоинтимы было наличие хорошо развитого слоя эластических волокон. Структура слоя эластических волокон была разнообразной (см. рис. 4Г-Е). Чаще всего он представлял собой широкий слой рыхло расположенных волокон
(см. рис. 4А, В). Вместе с тем в этом слое присутствовали участки, в которых концентрация эластических волокон была значительно меньше (см. рис. 4Б, Г, Д). В этих участках эластические
волокна либо разреженно располагались внутри неструктурированного материала, либо полностью отсутствовали (см. рис. 4Г, Д). В этих участках встречались клетки моноцитарного ряда (см. рис. 4Е).
S3400 15 OkV x2.50k BSECOMP
20.0um ■ S3400 15.0kV x1 00k BSECOMP
Рис. 3. Интеграция сосудистой заплаты из ПТФЭ в структуру стенки ствола легочной артерии (ЛА): А - общий вид. Извилистая структура заплаты обусловлена избыточным количеством материала заплаты для компенсации увеличения диаметра сосуда в процессе роста; Б - рыхлая соединительная ткань с низкой электронной плотностью, прилегающая к вогнутому участку заплаты, переходящая в плотную соединительную ткань с высокой электронной плотностью; В, Г - соединительная ткань на выпуклом участке заплаты с умеренной и высокой электронной плотностью; Д - отсутствие клеток на границе между заплатой и тканью с внутренней стороны ЛА, зернистая структура заплаты; Е - слой фиброцитов на границе между заплатой и тканью ЛА с наружной стороны, наличие капилляра вблизи границ. Черная стрелка указывает на заплату
Fig. 3. Integration of the expanded poly(tetrafluoroethylene) vascular patch into the pulmonary artery: A - overview. Convoluted shape of the patch is a result of its excessive length to compensate an increase in vessel diameter during the body growth; B - loose connective tissue with low electron density adjacent to the concave segment of the vascular patch and its transition into the dense connective tissue with high electron density; C, D - connective tissue within the convex segment of the vascular patch with moderate and high electron density; E - absence of cells at the border between the vascular patch and pulmonary artery tissue; F - fibroblasts and capillaries at the border between the vascular patch and pulmonary artery. Black arrow indicates the vascular patch
Рис. 4. Структура эндотелия и слоя эластических волокон в неоинтиме заплаты легочной артерии (ЛА): А - плотный слой эластических волокон с эндотелием на внутренней поверхности ЛА и прилегающей соединительной тканью, граничащей с заплатой; Б - рыхлый слой эластических волокон, граничащий с эндотелием с внутренней стороны ЛА и плотной соединительной тканью с внешней; В - полиморфные эндотелиоциты, прилегающие непосредственно к сплошному слою эластических волокон; Г, Д - полиморфные эндотелиоциты с вакуолизированной цитоплазмой, прилегающие к прерывистому слою эластических волокон. Короткие нитевидные структуры на поверхности эндотелиального слоя; E - макрофаги между разреженными эластическими волокнами неоинтимы
Fig. 4. Endothelial layer and elastic layer in the neointima of the vascular patch within the pulmonary artery. A - dense elastic layer with the endothelium at the luminal surface of the pulmonary artery and adjacent connective tissue near the vascular patch; B - loose elastic fibers at the border adjacent to the endothelium and dense connective tissue layer; C - polymorphic endothelial cells adjacent to the elastic layer; D, E - polymorphic endothelial cells with the cytoplasmic vacuolization adjacent to the discontinuous elastic fibers. Short threadlike structures on endothelial cells; F - macrophages between the discontinuous elastic fibers of the neointima
В направлении сосудистой заплаты слой эластических волокон переходил в слой коллагена, среди которого встречались отдельные фиброциты (рис. 4А, Б). Коллагеновый слой имел различную электронную плотность, которая обычно возрастала в направлении заплаты.
На периферии одной из заплат были обнаружены кальциевые включения, которые имели различный размер и обладали высокой электрон-
ной плотностью. Обширные очаги кальцификации включали заплату и окружающие ткани с обеих поверхностей (рис. 5А, Б). Чаще всего в центральной части кальцификаты были сплошными с высокой электронной плотностью, в то время как на периферии наблюдали наличие мелких кристаллических структур (рис. 5А-Д). В участках с крупными отложениями кальция иногда встречались участки с двумя раздельными слоями эластических воло-
Рис. 5. Кальциевые включения (Са) в структуре неоинтимы участка стенки легочной артерии (ЛА) с заплатой из ПТФЭ: А, Б - крупные очаги кальцификации, пересекающие всю толщу среза заплаты; В, Г - отложения кальция, прилегающие к поверхности заплаты; Д - кальциевые включения различного размера и формы в толще заплаты; Е - 2 раздельных слоя эластических волокон в неоинтиме вблизи крупного кальциевого включения. На рис. А-В черная стрелка указывает на заплату, на рис. Е - на слои эластических волокон
Fig. 5. Calcium deposits within the neointima of expanded poly(tetrafluoroethylene) patch: A, B - large calcium deposits located through the whole patch; C, D - calcium deposits near the patch surface; E - calcium deposits of different size and shape within the patch; F - two separate elastic layers in the neointima near the calcium deposit. A-C: black arrow indicates the patch. F: black arrow indicates the elastic layers.
кон (рис. 5Е). Крупные очаги кальцификации могли захватывать коллагеновый слой неоинтимы, пересекать всю толщу заплаты и переходить в более глубокие слои. Слои неоинтимы вблизи отложений кальция обладали повышенной электронной плотностью (см. рис. 5В, Г).
Обсуждение
Полученные результаты показали: и голометал-лический стент, и заплата из ПТФЭ хорошо интегрируются в структуру стенки ствола ЛА и удовлетворительно поддерживают кровообращение в малом круге, вплоть до эксплантации.
В варианте с установкой голометаллического стента наблюдали образование неоинтимы, имеющей свои структурные особенности. Металлические элементы стента были изолированы от общей массы неоинтимы плотным слоем соединительной ткани. Основная часть неоинтимы имела слоистую структуру, образованную чередующимися и разнонаправленными слоями плотных и рыхлых тканей. Присутствие большого количества рыхлых тканей указывало на продолжающийся процесс формирования неоинтимы, а наличие клеток моноцитарного ряда - на продуктивное воспаление. Признаки острого воспаления, повреждения эндотелия и неоинтимы отсутствовали. На этом
основании можно заключить, что процедура транс-катетерного стентирования выходного отдела правого желудочка и ствола ЛА голометаллическим стентом адекватна и достаточна при проведении первого этапа двухэтапной операции коррекции ТФ у маловесных детей. Разрастание неоинтимы как осложнение стентирования [11] незначительно, вероятно, оно не оказывает заметного препятствия кровотоку.
Заплата из ПТФЭ была интегрирована в плотную соединительную ткань стенки ЛА с образованием неоинтимы. На момент извлечения заплаты структура неоинтимы имела нетипичное строение. В обычном варианте строения неоинтима была преимущественно образована плотными слоями гладкомышечных клеток и клеток фибробластиче-ского ряда [7-9]. Главное отличие рассматриваемой неоинтимы состояло в том, что у всех образцов в ее структуре наблюдали большое количество эластических волокон, образующих прилегающий к эндотелию слой. Вероятно, появление эластического слоя было обусловлено возрастными особенностями регенерации сосудистых повреждений у детей. Характерно, что неоинтима на голометал-лическом стенте со сроком функционирования 3-6 мес не имела такого слоя. Если допустить, что неоинтима на голометаллическом стенте и заплате из ПТФЭ имеет общие механизмы формирования, то эластические волокна образуются на более поздних этапах формирования неоинтимы (через >6 мес после имплантации).
Извилистая форма заплаты в структуре ЛА обусловлена тем, что для выполнения пластики ЛА изначально использовалось избыточное количество материала с целью обеспечения возможности приспособления к возрастному увеличению диаметра протока. Однако этот резерв используется не полностью, что приводит к проявлениям недостаточности кровотока. Причиной ограничения дальнейшего увеличения диаметра кровяного русла может быть образование электронно-плотного слоя соединительной ткани с внутренней поверхности сосуда. Вероятно, на этапе исследования этот слой уже препятствует растяжению стенки ЛА.
Уменьшение толщины неоинтимы и редукция ее клеточного состава происходят за счет существенного уменьшения количества ГМК и клеток фибро-бластического ряда, скорее всего, это обусловлено возрастным ремоделированием сердца. По нашему мнению, увеличение размера сердца и разрастание его тканей без изменения диаметра ЛА приводят к повышению механического напряжения в заплате, рост которой ограничен свойствами ее материала и плотным слоем фиброцитов и коллагеновых волокон на границе с материалом заплаты. Такое механическое напряжение, вероятно, приводит
к механическому сдавливанию ГМК и фиброцитов, их гибели, а также растяжению и разрыву эластических волокон. Аналогичный вариант деструкции эластического слоя подтверждается другими авторами [12].
Суммарный эффект этих процессов выражается в истончении слоя неоинтимы. Характерно, что в участках с вогнутой структурой заплаты, где механическое напряжение меньше, слой неоинтимы толще, имеет меньшую электронную плотность и больше клеток по сравнению с выпуклыми участками. Отсутствие субэндотелиального разделительного слоя между эндотелием и эластическими волокнами, вероятно, приводит к тому, что концы разорванных эластических волокон могут пронизывать эндотелиоциты насквозь. В пользу этого предположения свидетельствует наличие коротких нитевидных структур на поверхности эндотелиоцитов и их ультраструктурные повреждения. Возможно, нарушение целостности эластических волокон частично обусловлено эластолизом при участии эла-стаз, выделяемых клетками моноцитарного ряда. Отсутствие ГМК, участвующих в синтезе эластина, в эластическом слое может рассматриваться как показатель отсутствия регенерации эластических волокон на данном этапе.
Кальцификация заплаты из ПТФЭ имела очаговый характер и присутствовала только в ее отдельных краевых участках, где отмечалось ее максимальное проявление. Возможно, начальным этапом кальцификации является разрушение клеток реципиента в месте контакта с заплатой, вызванное различиями в упруго-деформационных характеристиках этих материалов в режиме пульсирующего кровотока. Воспалительная реакция в месте разрушения клеток, сопровождающаяся выбросом цитокинов, могла быть стартовым сигналом для кальцификации [13]. Отдельные кальцификаты непосредственно на поверхности заплаты могут рассматриваться как подтверждение того, что начальные этапы кальцификации происходят именно в ткани пациента и не затрагивают саму заплату. В дальнейшем кальцификация может постепенно захватывать всю толщу заплаты и переходить на противоположную сторону соединительнотканного слоя ЛА.
Наблюдавшийся эластолиз может иметь самостоятельное значение в деструкции неоинтимы. Известно, что образующиеся при этом процессе эластокины вызывают различные клеточные и тканевые реакции, среди которых миграция воспалительных клеток, разрушение внеклеточного матрикса, активация перекисного окисления липи-дов, запуск иммунных реакций [14-18]. Поэтому высокая активность эластолиза может служить маркером проявления развивающейся сердечнососудистой патологии у этой группы пациентов.
Заключение
Полученные результаты показали, что в обоих вариантах реконструкции пути оттока в малом круге кровообращения происходит образование неоинтимы на поверхности имплантируемых элементов. В варианте использования стента для увеличения просвета сосуда образуется слой неоинтимы, представленный чередующимися слоями рыхлой и плотной ткани. В случае использования для реконструкции заплаты из ПТФЭ через 10 лет
функционирования, наоборот, происходило истончение неоинтимы. На основании представленных данных можно считать, что сроки выполнения реконструктивной операции для пациентов этой группы выбраны верно. На более поздних сроках можно ожидать дальнейшего развития негативных процессов, в частности нарушения целостности эндотелиального слоя и прогрессирования кальцификации, а также местных и системных процессов, индуцированных эластолизом.
Литература
1. Pashneh-Tala S., MacNeil S., Claeyssens F. The tissue-engineered vascular graft-past, present, and future // Tissue Eng. Part B Rev. 2016. Vol. 22, N 1. P. 68-100. DOI: https://doi. org/10.1089/ten.teb.2015.0100
2. Hiob M.A., She S., Muiznieks L.D., Weiss A.S. Biomaterials and modifications in the development of small-diameter vascular grafts // ACS Biomater. Sci. Eng. 2017. Vol. 3, N 5. P. 712-723. DOI: https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.6b 00220
3. Shoji T., Shinoka T. Tissue engineered vascular grafts for pediatric cardiac surgery // Transl. Pediatr. 2018. Vol. 7, N 2. P. 188-195. DOI: https://doi.org/10.21037/tp.2018.02.01
4. Севостьянова В.В., Миронов А.В., Антонова Л.В., Тарасов Р.С. Применение сосудистых заплат для артериальной реконструкции, проблемы и перспективные технологии // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2019. Т. 8, № 3. С. 116-129. DOI: https://doi.org/10.17802/2306-1278-2019-8-3-116-129
5. Brown S.C., Boshoff D.E., Heying R., Gorenflo M., Rega F., Eyskens B. et al. Stent expansion of stretch Gore-Tex grafts in children with congenital heart lesions // Catheter. Cardiovasc. Interv. 2010. Vol. 75, N 6. P. 843-848. DOI: https://doi.org/10.1002/ ccd.22400
6. De Meyer G.R., Bult H. Mechanisms of neointima formation - lessons from experimental models // Vasc. Med. 1997. Vol. 2, N 3. P. 179-189. DOI: https://doi.org/10.1177/135 8863X9700200304
7. Lijnen H.R., Van Hoef B., Umans K., Collen D. Neointima formation and thrombosis after vascular injury in transgenic mice overexpressing plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) // J. Thromb. Haemost. 2004. Vol. 2, N 1. P. 16-22. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1538-7836.2003.00533.x
8. Dobaczewski M., Gonzalez-Quesada C., Frangogiannis N.G. The extracellular matrix as a modulator of the inflammatory and reparative response following myocardial infarction // J. Mol. Cell. Cardiol. 2010. Vol. 48, N 3. P. 504-511. DOI: https://doi. org/10.1016/j.yjmcc.2009.07.015
9. O'Brien E.R., Ma X., Simard T., Pourdjabbar A., Hibbert B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury // Cardiovasc. Hematol. Disord. Drug Targets. 2011. Vol. 11, N 1. P. 30-39. DOI: https://doi.org/10.2174/187152911795945169
10. Mukhamadiyarov R.A., Bogdanov L.A., Glushkova T.V., Shishkova D.K., Kostyunin A.E., Koshelev V.A. et al. EMbedding and backscattered scanning electron microscopy: a detailed protocol for the whole-specimen, high-resolution analysis of cardiovascular tissues // Front. Cardiovasc. Med. 2021. Vol. 8. Article ID 739549. DOI: https://doi.org/10.3389/fcvm.2021.739549
11. Nakamura K., Keating J.H., Edelman E.R. Pathology of endovascular stents // Interv. Cardiol. Clin. 2016. Vol. 5, N 3. P. 391-403. DOI: https://doi.org/10.1016/j.iccl.2016.02.006
12. Chow M.J., Choi M., Yun S.H., Zhang Y. The effect of static stretch on elastin degradation in arteries // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 12. Article ID e81951. DOI: https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0081951 Epub 2013 Dec 16.
13. Kostyunin A., Mukhamadiyarov R., Glushkova T., Bogdanov L., Shishkova D., Osyaev N. et al. Ultrastructural pathology of atherosclerosis, calcific aortic valve disease, and bioprosthetic heart valve degeneration: commonalities and differences // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, N 20. P. 7434. DOI: https://doi. org/10.3390/ijms21207434
14. CoccioloneA.J., Hawes J.Z.,Staiculescu M.C.,Johnson E.O., Murshed M., Wagenseil J.E. Elastin, arterial mechanics, and cardiovascular disease // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2018. Vol. 315, N 2. P. H189-H205. DOI: https://doi.org/10.1152/ajp-heart.00087.2018 Epub 2018 Apr 6.
15. Antonicelli F., Bellon G., Debelle L., Hornebeck W. Elastin-elastases and inflammaging // Curr. Top. Dev. Biol. 2007. Vol. 79. P. 99-155. DOI: https://doi.org/10.1016/S0070-2153(06)79005-6
16. Lee S.H., Shin K., Park S. et al. Circulating anti-elastin antibody levels and arterial disease characteristics: associations with arterial stiffness and atherosclerosis [published correction appears in Yonsei Med. J. 2016. Vol. 57, N 1. P. 275] // Yonsei Med. J. 2015. Vol. 56, N 6. P. 1545-1551. DOI: https://doi. org/10.3349/ymj.2015.56.6.1545
17. Fulop T. Jr, Larbi A., Fortun A., Robert L., Khalil A. Elastin peptides induced oxidation of LDL by phagocytic cells // Pathol. Biol. (Paris). 2005. Vol. 53, N 7. P. 416-423. DOI: https://doi. org/10.1016/j.patbio.2004.12.023
18. Greaves D.R., Gordon S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease // Trends Immunol. 2001. Vol. 22, N 4. P. 180-181. DOI: https://doi.org/10.1016/s1471-4906(00)01848-2
References
1. Pashneh-Tala S., MacNeil S., Claeyssens F. The tissue-engineered vascular graft-past, present, and future. Tissue Eng Part B Rev. 2016; 22 (1): 68-100. DOI: https://doi.org/10.1089/ ten.teb.2015.0100
2. Hiob M.A., She S., Muiznieks L.D., Weiss A.S. Biomaterials and modifications in the development of small-diameter vascular grafts. ACS Biomater Sci Eng. 2017; 3 (5): 712-23. DOI: https:// doi.org/10.1021/acsbiomaterials.6b00220
3. Shoji T., Shinoka T. Tissue engineered vascular grafts for pediatric cardiac surgery. Transl Pediatr. 2018; 7 (2): 188-95. DOI: https://doi.org/10.21037/tp.2018.02.01
4. SevostyanovaV.V., Mironov A.V., Antonova L.V., Tarasov R.S. Vascular patches for arterial reconstruction, challenges and advanced technologies. Kompleksnye problemy serdechno-sosudistykh zabolevaniy [Complex Problems of Cardiovas-
cular Diseases], 2019; 8 (3): 116-29. DOI: https://doi. org/10.17802/2306-1278-2019-8-3-116-129 (in Russian)
5. Brown S.C., Boshoff D.E., Heying R., Gorenflo M., Rega F., Eyskens B., et al. Stent expansion of stretch Gore-Tex grafts in children with congenital heart lesions. Catheter Cardiovasc Interv. 2010; 75 (6): 843-8. DOI: https://doi.org/10.1002/ccd. 22400
6. De Meyer G.R., Bult H. Mechanisms of neointima formation - lessons from experimental models. Vasc Med. 1997; 2 (3): 179-89. DOI: https://doi.org/10.1177/1358863X9700200304
7. Lijnen H.R., Van Hoef B., Umans K., Collen D. Neointima formation and thrombosis after vascular injury in transgenic mice overexpressing plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1). J Thromb Haemost. 2004; 2 (1): 16-22. DOI: https://doi.org/10.1111/ j.1538-7836.2003.00533.x
8. Dobaczewski M.,Gonzalez-Quesada C.,Frangogiannis N.G. The extracellular matrix as a modulator of the inflammatory and reparative response following myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 2010; 48 (3): 504-11. DOI: https://doi.org/10.1016/j. yjmcc.2009.07.015
9. O'Brien E.R., Ma X., Simard T., Pourdjabbar A., Hibbert B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2011; 11 (1): 30-9. DOI: https://doi.org/10.2174/187152911795945169
10. Mukhamadiyarov R.A., Bogdanov L.A., Glushkova T.V., Shishkova D.K., Kostyunin A.E., Koshelev V.A., et al. EMbedding and backscattered scanning electron microscopy: a detailed protocol for the whole-specimen, high-resolution analysis of cardiovascular tissues. Front Cardiovasc Med. 2021; 8: 739549. DOI: https://doi.org/10.3389/fcvm.2021.739549
11. Nakamura K., Keating J.H., Edelman E.R. Pathology of endovascular stents. Interv Cardiol Clin. 2016; 5 (3): 391-403. DOI: https://doi.org/10.1016/j.iccl.2016.02.006
12. Chow M.J., Choi M., Yun S.H., Zhang Y. The effect of static stretch on elastin degradation in arteries. PLoS One. 2013; 8 (12): e81951. DOI: https://doi.org/10.1371/journal. pone.0081951 Epub 2013 Dec 16.
13. Kostyunin A., Mukhamadiyarov R., Glushkova T., Bogdanov L., Shishkova D., Osyaev N., et al. Ultrastructural pathology of atherosclerosis, calcific aortic valve disease, and bioprosthetic
heart valve degeneration: commonalities and differences. Int J Mol Sci. 2020; 21 (20): 7434. DOI: https://doi.org/10.3390/ ijms21207434
14. Cocciolone A.J., Hawes J.Z., Staiculescu M.C., Johnson E.O., Murshed M., Wagenseil J.E. Elastin, arterial mechanics, and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018; 315 (2): H189-205. DOI: https://doi.org/10.1152/ajp-heart.00087.2018 Epub 2018 Apr 6.
15. Antonicelli F., Bellon G., Debelle L., Hornebeck W. Elas-tin-elastases and inflammaging. Curr Top Dev Biol. 2007; 79: 99-155. DOI: https://doi.org/10.1016/S0070-2153(06)790 05-6
16. Lee S.H., Shin K., Park S., et al. Circulating anti-elastin antibody levels and arterial disease characteristics: associations with arterial stiffness and atherosclerosis [published correction appears in Yonsei Med J. 2016; 57 (1): 275]. Yonsei Med J. 2015; 56 (6): 1545-51. DOI: https://doi.org/10.3349/ ymj.2015.56.6.1545
17. Fulop T. Jr, Larbi A., Fortun A., Robert L., Khalil A. Elastin peptides induced oxidation of LDL by phagocytic cells. Pathol Biol (Paris). 2005; 53 (7): 416-23. DOI: https://doi.org/10.1016/j. patbio.2004.12.023
18. Greaves D.R., Gordon S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 2001; 22 (4): 180-1. DOI: https://doi.org/10.1016/s1471-4906(00)01848-2
