CC BY
162
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
© коллектив авторов, 2014
УДК 616.13-004.6-092:612.015.3:577.112.856
В.Н. титов1, В.А. Амелюшкина1, т.И. Коткина1, А.В. Ариповский2
РАЗЛИЧИЕ КОНФОРМАЦИИ АПОВ-100 В ЛИПОПРОТЕИНАХ НИЗКОЙ И ОЧЕНЬ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ЛИПОПРОТЕИНЫ И ДЕСТРУКТИВНОЕ ВОСПАЛЕНИЕ В ИНТИМЕ АРТЕРИЙ (ЛЕКЦИЯ)
1ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России, 121552, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15-а; Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора РФ, г. Оболенск, Московская обл.
Формирование лиганда в филогенетически ранних липопротеинах очень низкой плотности (ЛПОНП), более поздних ЛПОНП происходит, когда апоВ-100 в ассоциации с эссенциальными полиеновыми жирными кислотами (ЖК) в форме эфиров со спиртом холестерином (ХС), пальмитиновыми и олеиновыми триглицеридами (ТГ) принимает активную кон-формацию. В ЛП низкой плотности (ЛПНП) формируется апоВ-100-домен-лиганд, в ЛПОНП - апоЕ/В-100-лиганд. Ли-гандные ЛП поглощают клетки путем апоЕ/В-100- и апоВ-100-рецепторного эндоцитоза. При избытке в крови пальмитиновых ТГ и одноименных ЛПОНП, при нарушении первичной структуры постгепариновой, печеночной липопротеин-липазы и коферментов апоС-II и апоС-II, при фенотипе Е2/Е2 в крови накапливаются прелигандные, богатые ТГ ЛП. При патологии апов-100 рецептора накапливаются постлигандные ЛПНП с малым содержанием ТГ. Все безлигандные ЛП физиологично денатурируют нейтрофилы; наличие патологии вызывает модификацию при действии иных агентов (гли-котоксины). Пре-ЛП формируют в интиме артерий мягкие объемные бляшки и деструктивно-воспалительный процесс - атеротромбоз. Пост-ЛП формируют плоские бляшки и деструктивно-воспалительный атероматоз. Атеросклероз можно назвать болезнью конформации. Малые, плотные, атерогенные ЛП, по данным ядерно-магнитной резонансной спектроскопии, - по составу ЖК - пальмитиновые ЛПОНП с гидратированной плотностью ЛПНП. Причины поражения интимы - избыток в пище пальмитиновой насыщенной ЖК, фенотип Е2/Е2 и делеция гена апоВ-100-рецептора. Безлигандные ЛП формируют деструктивный процесс, погибающие пенистые клетки, макрофаги - воспалительный компонент. Атероматоз - результат реализации биологической функции эндоэкологии, поддержания «чистоты» межклеточной среды.
Ключевые слова: апоВ-100; конформация; жирные кислоты; атероматоз и атеротромбоз; модифицированные липопротеины
V.N. Titov1, V.A. Ameliyushkina1, T.I. Kotkina1, A.V. Aripovskiy2
the difference of conformation of ApoB-Ш in lipoproteins of low and very low density. the modified lipoproteins and destructive inflammation in intima of arteries: A lecture
1The Russian cardiologic R&D production complex of Minzdrav of Russia, 121552 Moscow, Russia; 2The state research center of applied microbiology and biotechnology of Rospotrebnadzor of Russia, Obolensk, Moscowskaya oblast, Russia
The formation of ligand occurs in phylogenetically earlier lipoproteins of very low density and later lipoproteins of very low density when apoB-100 takes active conformation in association with essential polyenoic fatty acids, in form of ethers with alcohol cholesterol, palmitic and oleic triglycerides. In lipoproteins of low density apoB-100-domain-ligand is formed, in lipoproteins of very low density apoE/B-100-ligand is formed. The ligand lipoproteins absorb cells using apoE/B-100 and apoB-100 receptor endocytosis. In cases of excess ofpalmitic triglycerides
and lipoproteins of very low density of the same name in blood, damage of primary structure of post-heparin, hepatic lipoprotein lipase and co-enzymes apoC-II and apoC-II, phenotype E2/E2 blood accumulates pre-ligand lipoproteins rich in triglycerides. In case of pathology of apoB-100-receptor post-ligand lipoproteins of low density with low content of triglycerides are cumulated. All non-ligand lipoproteins in a physiological way denature neutrophils. The presence of pathology induces modification in case of action of other agents (glyсo-toxins). The pre-lipoproteins form in the intima of arteries soft voluminous plaques and such destructive inflammatory process as athero-thrombosis. The post-lipoproteins form flat plaques and destructive inflammatory atheromatosis. The atherosclerosis can be labeled as disease of conformation.
The surplus of palmitic saturated fatty acids in food, phenotype E2/E2 and deletion of gene apoB-100-receptor are causes of intima lesion. The non-ligand lipoproteins form destructive process, dying foam cells and macrophages - inflammatory component. The atheromatosis is a result of realization of biological function of endoecology, support of «purity» of intercellular medium.
Keywords: apoB-100, conformation, fatty acid, atheromatosis, athero-thrombosis, modified lipoproteins
Для корреспонденции:
Титов Владимир Николаевич, д-р мед. наук, проф., рук. лаб. клин. биохимии липидов Адрес: 121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 14А E-mail: [email protected]
Как следует из филогенетической теории общей патологии, на ступенях филогенеза последовательно сформировались три системы переноса к клеткам в гидрати-рованной (водной) межклеточной среде гидрофобных (липофильных) жирных кислот (ЖК). На ранних ступенях филогенеза перенос всех ЖК проходил (и проходит) в составе липопротеинов (ЛП) высокой плотности (ЛПВП) в форме полярных липидов (фосфолипидов -ФЛ и диглицеридов - эфиров со спиртом глицерином); из ЛПВП клетки поглощали липиды только пассивно. На более поздних ступенях филогенеза произошло формирование ЛП низкой плотности (ЛПНП). Они стали переносить к клеткам ЖК в форме неполярных липидов: насыщенные ЖК (НЖК), моноеновые ЖК (МЖК) и ненасыщенные ЖК (ННЖК) в форме эфиров с трехатомным спиртом глицерином, а эссенциальные полиеновые ЖК (ЭСПНЖК) в форме эфиров с одноатомным циклическим спиртом холестерином (ХС). Из состава ЛПНП клетки поглощали НЖК, МЖК, ННЖК и ЭСПНЖК уже активно, путем рецепторного апоВ-100-эндоцитоза. Существенно позднее, при становлении биологической функции локомоции и системы инсулина произошло становление ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП). Они стали в большом количестве переносить к клеткам только НЖК и МЖК как субстраты для наработки клетками энергии, синтеза АТФ, а инсулинза-висимые клетки стали их поглощать путем апоЕ/В-100-рецепторного эндоцитоза. Совершенствование системы ЛП на ступенях филогенеза продиктовано биологической необходимостью, развитием и совершенствованием организма, становлением новых биологических функций и биологических реакций.
По какой же причине ЛПОНП, сформированные в гепатоцитах одним апоВ-100, имеют разную гидратированную плотность - ЛПНП и ЛПОНП? Это определено, мы полагаем, тем, что гепатоциты формируют ЛПОНП в условиях, когда апоВ-100 раздельно связывает пальмитиновые, олеиновые, линолевые и линоленовые три-глицериды (ТГ), у которых в позиции sn-2 трехатомного спирта глицерина (с вторичной спиртовой группой) этерифицирована соответственная ЖК. Это определено тем, что в составе пальмитиновых ТГ, таких,
как пальмитоил-пальмитоил-пальмитат, все ЖК имеют длину С16; одна из ЖК может быть и С14. В таких ТГ, как пальмитоил-пальмитоил-олеат, две ЖК имеют длину С16 и один остаток ЖК - С18. Олеиновыми же ТГ могут быть также как олеил-олеил-пальмитат, которые содержат две ЖК С18 и одну С16, а также такие ТГ, как стеарил-олеил-стерат, все ЖК С18. Начиная с олеиновых ТГ, таких как олеил-олеил-олеат, все остатки ЖК в составе ТГ имеют длину С18. В линолевые и линоле-новые ТГ могут быть включены также С20:3 дигомо-у-линоленовая ННЖК и даже С20:4 арахидоновой (Ара-хи) ЭСПНЖК. Из этого следует, что гидратированная плотность пальмитиновых ТГ самая низкая, как и пальмитиновых ЛПОНП, плотность олеиновых, стеариновых, линолевых и особенно линоленовых ТГ и ЛПОНП более высокая. В постпрандиальном периоде после приема пищи гепатоциты секретируют в кровь пальмитиновые и олеиновые ЛПОНП с меньшей гидратиро-ванной плотностью, а также линолевые и линоленовые ЛП с большей плотностью, которая, однако, ниже, чем у ЛПНП (рис. 1). В постпрандиальном периоде гепатоци-ты секретируют в кровоток пальмитиновые, олеиновые, линолевые и линоленовые ЛПОНП, плотность которых разная, но ниже, чем плотность ЛПНП.
Наименьшую гидратированную плотность (самые малые размеры) имеют пальмитиновые ЛПОНП, в которых апоВ-100 связывает количество ТГ в зависимости от числа гидрофобных а-спиралей и связующих доменов; в каждом ЛПОНП апоВ-100 связывает примерно одинаковое число молекул ТГ. Более высокая гидратированная плотность ЛПНП обусловлена не различием физико-химических свойств ТГ, а содержанием в ЛПНП более плотных и гидрофобных ЭСПНЖК в форме эфиров со спиртом ХС. Они при действии белка, переносящего эфиры холестерина, спонтанно переходят из ЛПВП в ли-нолевые и линоленовые ЛПОНП, превращая их в ЛПНП с более высокой плотностью. Структурная и функциональная гетерогенность ЛПОНП является основой того, что на ступенях филогенеза поглощение их клетками путем рецепторного эндоцитоза происходит по-разному. Начнем с более поздних в филогенезе, но количественно
Рис. 1. Спектр индивидуальных ТГ (ТАГ) в плазме крови здорового ребенка и эфиров ЭСПНЖК со спиртом ХС (ЭХ). Цифры - молекулярная масса ТГ.
доминирующих в крови и межклеточной среде ЛПОНП. В физиологических условиях ЛПОНП переносят к инсу-линзависимым клеткам НЖК + МЖК во много раз больше, чем ЛПНП доставляют ННЖК + ЭСПНЖК. Количество НЖК, МЖК и ННЖК + ЭСПНЖК, переносимых в составе ЛП, соотносится как 100:10:1.
Клетки поглощают пальмитиновые и олеиновые ЖК в форме ТГ в одноименных ЛПОНП, а линолевые, лино-леновые ЖК в форме ТГ и ЭСПНЖК в форме эфиров ХС в филогенетически ранних ЛПНП. Для этого апоВ-100 в ЛПОНП, в ассоциации с уменьшенным при липолизе количеством ТГ, принимает функционально активную конформацию, связывается с доменом апоЕ и формирует на поверхности ЛПОНП кооперативный апоЕ/В-100-лиганд; в линолевых и линоленовых ЛПНП, в ассоциации с более гидрофобными ЭСПНЖК в форме эфиров ХС, апоВ-100 принимает иную активную конформацию и выставляет на поверхность ЛПНП апоВ-100-лиганд. Связывая его одноименными рецепторами, клетки поглощают ЛПНП со всеми переносимыми ими ННЖК и ЭСПНЖК. Что же такое конформация, которая позволяет апоВ-100 в ЛПОНП сформировать один лиганд, а в ЛПНП - другой и обеспечить пути рецепторного поглощения клетками раздельно ЛПОНП и ЛПНП?
1. Конформация апоВ-100, формирование лиганда в ЛПНП, ЛПОНП и поглощение ЛП клетками
До недавнего времени все придерживались мнения, согласно которому последовательность аминокислотных остатков - первичная структура полипептида содержит всю информацию, которая необходима для сворачивания молекулы в биологически активную структуру (фолдинг молекулы). По мере накопления экспериментальных данных стало ясно, что в клетке фолдинг белков обеспечивают и белки-помощники, семейство молекул шаперонов (в частности белки теплового шока). Это позволяет по-иному рассмотреть взаимосвязь пространственной структуры (конформации) и первичной структуры белка.
1. Структура молекулы белка такова, что гидрофобные аминокислотные остатки сгруппированы на одной стороне а-спиралей и Р-складчатых структур, образуя гидрофобные кластеры.
2. Они при формировании вторичной структуры, взаимодействуя друг с другом, образуют гидрофобное ядро, которое обеспечивает глобулярные свойства белка.
3. Элементы вторичной структуры занимают в макромолекуле определенное положение относительно друг друга; это определяет плотную третичную упаковку белка.
4. Большинство боковых групп глобулярного белка плотно упакованы, что в большой мере ограничивает их внутримолекулярную подвижность и придает третичной структуре белка определенную жесткость.
Для понимания формирования физиологически активных форм белков, их конформации важно выяснить взаимосвязь разных уровней структурной организации молекул белка и роль активных, стабильных конфор-маций молекулы, которые являются промежуточными состояниями между глобулярной (жесткой) и развернутой (ламеллярной) структурой. Функционально активной конформацией при разворачивании (сворачивании) белков являются не начальная и не конечная, а промежуточные, стабильные состояния. Особенностями структуры конформационных состояний являются: высокое содержание функциональных групп во
вторичной структуре, сохранение гидрофобного ядра и лабильная упаковка боковых групп с увеличением их внутримолекулярной подвижности. Это позволяет воде проникать вглубь молекулы белка, не нарушая целостность гидрофобного ядра, или формировать гидрофобное ядро молекулы апобелка в ассоциации с неполярными липидами.
Применение моноклональных антител для определения конформации апоВ-100-домена в составе ЛП несомненно позитивно. Оно позволило определить домен-лиганд, проследить стабильность его на ступенях фило-геназа, выявить различие антигенных свойств апоВ-100 в зависимости от содержания в ЛПОНП ТГ. Связывание ЛПНП разных видов животных с апоВ-100-рецепторами фибробластов человека свидетельствует о том, что в филогенезе структура домена-лиганда апоВ-100 изменилась мало. С ЛПНП-рецепторами человека взаимодействовали ЛПНП морской свинки, кролика, медведя, льва; не было взаимодействия с ЛПНП крыс и мышей. Одновременно иные панели моноклональных антител, которые обладают тропностью к другим доменам апоВ-100, специфичны только для человека. Это свидетельствует о том, что первичная структура четырех липидсвязывающих доменов апоВ-100 у разных видов животных изменена; неизменным остался только домен-лиганд. Связывая его моно-клональными антителами, удается блокировать поглощение фибробластами человека меченых ЛПНП от иных видов животных.
Моноклональные антитела позволили выявить различия конформации апоВ-100 в составе ЛПОНП и ЛПНП. Пептиды, которые получены при протео-лизе трипсином ЛПОНП, имели иную конформацию, чем эти же пептиды в структуре ЛППН. Количество ТГ в ЛПОНП выраженно влияет на антигенные свойства апоВ-100 и его взаимодействие с апоВ-100-рецептором. Меняется конформация апоВ-100 тогда, когда апо связывает неполярные ТГ и полярные ФЛ. При инкубации апоВ-100 ЛПОНП с фосфатидилхоли-ном (ФХ) спонтанно формируются гомогенные ЛПНП с диаметром ~ 20 нм; каждая молекула апоВ-100 связывала ~ 300 молекул ФХ. Ассоциация с ФЛ увеличивает в молекуле апоВ-100 количество а-спиральных структур и отрицательный заряд на поверхности ЛПНП; апоВ-100 связывает ТГ и ФЛ разными доменами. В ходе связывания Р-складчатые структуры апоВ-100 остаются стабильными; именно амфипатные а-спиральные структуры связывают липиды с разной гидрофобностью.
Последние работы выявили выраженное изменение конформации апоВ-100 в ЛПНП при переносе к клеткам ЭСПНЖК. В гепатоцитах апоВ-100 формирует разные по гидратированной плотности ЛПОНП, составленные из пальмитиновых, олеиновых, линолевых и линолено-вых ТГ. При переносе к клеткам ЖК в составе ЛПОНП происходит гидролиз оптимального количества неполярных ТГ и размеры ЛПОНП постепенно становятся все меньше. Изменение конформации апоВ-100 подтверждает и формирование разных апоВ-100-лигандов в составе ЛПОНП и ЛПНП. Параметры связанных апоВ-100-липидов в ЛПОНП и ЛПНП оказывают влияние на количество эпитопов на поверхности. В секретируемых гепатоцитами в кровоток ЛПОНП домена-лиганда апоВ-100 на поверхности нет; он полностью экранирован избытком ТГ.
После гидролиза оптимального количества ТГ в пальмитиновых и олеиновых ЛПОНП на поверхности формируется кооперативный апоЕ/В-100-домен-лиганд, который инсулинзависимые клетки связывают апоЕ/В-100-рецепторами. Одновременно при гидролизе ли-нолевых и линоленовых ТГ, при переходе в ЛПНП из ЛПВП ЭСПНЖК, этерифицированных спиртом ХС, апоВ-100 принимает иную активную конформацию и на поверхности ЛПНП формируется апоВ-100-лиганд. Его своими апоВ-100-рецепторами связывают все клетки in vivo и активно поглощают лигандные ЛПНП путем апоВ-100-рецепторного эндоцитоза. Таким образом, в ходе липолиза и удаления из ЛПОНП и ЛПНП излишков ТГ на поверхность ЛП выходят эпитопы, которые были экранированы неполярными, гидрофобными ТГ. Рецепторный эндоцитоз является активным; клетки сами, на аутокринном уровне, регулируют количество рецепторов на мембране и количество поглощаемых ими ЛПОНП или ЛПНП.
Эксперименты с моноклональными антителами позволяют уловить тонкие изменения индивидуальных эпитопов. Применение мышиных моноклональных антител, тропных к разным эпитопам апоВ-100, позволило определить иммунореактивность субфракций ЛПНП. Три моноклональных антитела одинаково взаимодействовали со всеми субфракциями ЛПНП. Все ЛПНП имеют определенное число гидрофильных эпитопов, которые находятся на поверхности; они не экранированы липидами и экспрессированы во всех апоВ-100-ЛП. Различия иммунореактивности апоВ-100 определены изменением конформации апоВ-100 в субфракциях ЛПНП; это вызвано гидролизом неполярных ТГ и наличием на поверхности ЛПНП эпитопов, которые ранее были скрыты под неполярными ТГ. Взаимодействие моно-клональных антител с апоВ-100 усиливается по мере уменьшения в них количества липидов и соответственно увеличению гидратированной плотности субфракций ЛПНП.
Для оценки конформационных изменений апоВ-100 при превращении в крови: секретированные ЛПОНП ^ ЛП промежуточной плотности ^ ЛПНП использована панель из 29 мышиных антител к апоВ-100. Выявлены эпитопы, которые постоянно экспонированы на поверхности всех апоВ-100-ЛП; они располагаются вблизи апоВ-100-домена-лиганда. Далее определены два эпи-топа, которые в первичной структуре апоВ-100 соответствуют аминокислотным остаткам от 4324 до 4536 и существенно более активны в ЛПНП малого и среднего размера по сравнению с ЛПОНП и даже больших ЛПНП. Таким образом, конформация апоВ-100 является разной как в малых - пальмитиновых ЛПОНП, так и в больших - линолевых ЛПНП. Это дает основание говорить, что при формировании лигандных ЛПОНП и ЛПНП апоВ-100 принимает разную конформацию; она-то и формирует на поверхности апоВ-100-ЛП домены лиганды: апоЕ/В-100 в ЛПОНП и апоВ-100 в ЛПНП. Это означает также и то, что функции филогенетически ранних ЛПНП и более поздних ЛПОНП разные.
Если рассматривать ЛПНП в филогенезе, предназначены они в первую очередь для переноса и активного поглощения клетками эссенциальных ННЖК и ЭСПНЖК. Содержание в пище С 18:2 линолевой + С 18:3 линоленовой + ЭСПНЖК (С 20:4 Арахи и С 20:5 эйкозапентаеновой) во много раз меньше, чем экзоген-
ных Пальм НЖК и олеиновой МЖК в пище. Оно существенно меньше и количества эндогенной Пальм НЖК + олеиновой МЖК, которое гепатоциты синтезируют из углеводов пищи, из глюкозы (ГЛЮ). Этот синтез определен тем, что количество углеводов, которое мы поедаем, in vivo депонировать негде. В зависимости от того, какая из ЖК этерифицирована со спиртом глицерином в средней (sn-2) позиции (со вторичной спиртовой группой), ТГ разделяют на пальмитиновые, олеиновые, линолевые и линоленовые. Особенность sn-2 в молекуле ТГ определена тем, что ЖК в этой позиции гидролизована in vivo быть не может; у позвоночных нет липаз для гидролиза эфиров ЖК с вторичной спиртовой группой глицерина; всасывание происходит в форме 2-моноацилглицерола.
Ранние в филогенезе ЛПНП и более поздние ЛПОНП клетки поглощают по-разному. Преемственность формирования в филогенезе вначале ЛПНП и позже ЛПОНП состоит в том, что гепатоциты все экзогенные ЖК -Пальм НЖК, олеиновую МЖК, линолевую и линолено-вую ННЖК - этерифицируют с трехатомным спиртом глицерином в состав одноименных ТГ. Далее апоВ-100 раньше в филогенезе начал структурировать линолевые и линоленовые ТГ в ЛП с гидратированной плотностью ЛПНП. Позже в филогенезе апоВ-100 стал включать во много раз большее количество пальмитиновых и олеиновых ТГ в состав одноименных ЛП, но уже с гидра-тированной плотностью ЛПОНП. В постпрандиальном периоде, да и натощак тоже, количество пальмитиновых и олеиновых ТГ в апоВ-100 ЛП на порядок (в 10 раз) превышает количество линолевых и линоленовых ТГ.
Нарушения поглощения клетками ЛПОНП путем апоЕ/В-100 рецепторного эндоцитоза по причине отсутствия формирования апоЕ/В-100-лиганда можно рассматривать как «болезнь конформации». Функционально активная конформация белка является, как правило, не начальной и не конечной, а промежуточной. В момент конформации - изменения третичной, стерической структуры, в частности транспортных протеинов, при действии разных факторов быстро формируется иная, стерическая, пространственная форма молекулы с образованием на поверхности белка функционально активных радикалов и доменов.
Несмотря на то что установлена первичная структура апоВ-100, выявлены варианты генетических аномалий, третичная структура апоВ-100-ЛП основана на постулатах, предположениях и математическом моделировании. Не осталось ни одного физико-химического метода, который бы не был применен для выяснения структуры апоВ-100 ЛПНП. В этой ситуации мы предлагаем всю накопленную информацию рассмотреть по-иному, используя для этого биологическую функцию интеллекта. Детальное рассмотрение данных электронной микроскопии разных классов ЛП дало нам основание предложить структуру апоВ-100-ЛП, отображенную на рис. 2. Мы давно описали динамичную конформацию апоВ-100 в процессе превращения в кровотоке ЛПОНП в ЛПНП с формированием двух физиологично активных и одной промежуточной конформации.
С помощью электронной микроскопии нативных, замороженных в водном забуференном растворе апоВ-100-ЛП человека выявили три разные формы, которые авторы назвали следующим образом: тороид (кольцеобразная структура), бислой белок - липид и глобула (рис. 3).
m Q
Рис. 2. Схема последовательного превращения ЛПОНП. 1 - бислой апоВ-100 + ТГ; 2 - бислой апоВ-100 + ТГ + эфиры ЭСПНЖК со спиртом ХС; 3 - глобула апоВ-100 + эфиры ХС.
Это дало нам основание более 20 лет назад опубликовать предложение, согласно которому апоВ-100 ЛП являются вариантами единой структуры белок - липид, сформированной в гепатоцитах. В ЛПОНП молекула апоВ-100 последовательно принимает три конформации; назвали мы их так: большая псевдоглобула с полостью внутри (псевдосфера), бислой белок - липид и малая глобула с липидами внутри. Одновременно мы объяснили причины, которые инициируют функционально значимые изменения конформации апоВ-100 в ЛПОНП и ЛПНП. Руководствуясь филогенетической теорией общей патологии, мы первыми объяснили биологический смысл активированного перехода ЭСПНЖК в форме эфиров ХС из ЛПВП в линолевые и линоленовые ЛПОНП. Поскольку размеры молекулы ЭСПНЖК со спиртом ХС на треть меньше таковых ТГ и гидрофобность их выше, ли-нолевые и линоленовые ЛПОНП при переходе липидов из ЛПВП становятся меньше и приобретают гидрати-рованную плотность ЛПНП. Напомним, что и в физиологических условиях концентрация пальмитиновых и олеиновых ЛПОНП в плазме крови почти на порядок выше, чем линолевых и линоленовых ЛПОНП.
С помощью электронной микроскопии нативных ЛП выявили гетерогенность ЛПОНП в начальной конфор-мации - бислой белок - липид в водной среде в форме псевдосферы; это начальная, неактивная конформация, и лиганда на поверхности ЛП еще нет. Среди ЛП преоб-
ладают большие ЛПОНП, вероятно, олеиновые и пальмитиновые, и меньше более малых, линолевых и лино-леновых ЛПОНП; для всех ЛПОНП характерна форма псевдосферы. Мы полагаем, что апоВ-100 структурирует в состав ЛПОНП раздельно пальмитиновые, олеиновые, линолевые и линоленовые ТГ с образованием одноименных, функционально разных ЛПОНП. Это, по нашему мнению, определено пространственной формой ТГ, которая для каждого ТГ является разной; энергетически, вероятно, выгодно, чтобы апоВ-100 структурировал в состав ЛПОНП одинаковые ТГ.
В переносе ТГ в крови и межклеточной среде в составе ЛП, апоВ-100, по нашему мнению, последовательно принимают участие три пространственные формы, три конформации. Функционально неактивную конформацию имеет апоВ-100 во всех ЛПОНП, которые имеют псевдосферическую форму. Функционально значимыми конформациями апоВ-100 являются следующие:
а) деформированный бислой белок - липид, при котором в ЛПОНП происходит формирование кооперативного апоЕ/В-100-лиганда и поглощение ЛПОНП инсулин-зависимыми клетками путем апоЕ/В-100-рецепторного эндоцитоза;
б) белковая глобула ЛПНП с неполярными липида-ми в «кармане», при которой формируется апоВ-100-лиганд и все клетки рецепторно поглощают ЛПНП. Конформация деформированного бислоя белок - ли-пид (апоВ-100 + ТГ) в форме псевдосферы является не активной (рис. 4).
Сложности трактовки данных электронной микроскопии состоят в том, что для пучка электронов плотность липидов практически равна плотности воды, поэтому отображения липидов на электронных микрофотографиях практически нет. На рис. 5 приведено электронное микроскопическое изображение ЛПОНП в форме кольца, бислоя белок - липид и глобулы с липидами внутри. Одновременно приведены результаты компьютерного моделирования структуры ЛПОНП в форме деформированного бислоя белок - липид (псевдоглобулы) с липидами снаружи и ЛПНП в форме глобулы с липидами внутри.
В крови в пальмитиновых и олеиновых ЛПОНП в процессе гидролиза ТГ при действии постгепариновой липопротеинлипазы (ЛПЛ) и кофактора апоС-II уменьшается количество ТГ. Освобожденные при гидролизе неэтерифицированные ЖК (НЭЖК) связывает альбумин; диглицериды спонтанно переходят в полярные по структуре ЛПВП. Когда в ассоциации с апоВ-100 остается оптимальное количество ТГ, стерическая фор-
Рис. 3. Электронная микроскопия нативных ЛП человека, замороженных в водном, забуференном растворе.
Рис. 4. Псевдосферическая форма ЛПОНП при электронной микроскопии с негативным контрастированием; видна полость, образованная деформированным бислоем белок-липид в гидратированной среде.
ма апоВ-100 резко меняется, принимая активную кон-формацию; активные домены апоВ-100 ассоциируются с белок-белковым доменом апоЕ; формируется кооперативный апоЕ/В-100-лиганд и происходит выставление его на поверхность пальмитиновых и олеиновых ЛПОНП. Все инсулинзависимые клетки in vivo связывают лиганды апоЕ/В-100 рецепторами на плазматической мембране и поглощают пальмитиновые и олеиновые ЛПОНП. Филогенетически ранние ЛПНП не содержат апоЕ; последние являются компонентом только филогенетически более поздних, инсулинзависимых ЛПОНП.
При гидролизе линолевых и линоленовых ТГ и переходе в ЛПНП из ЛПВП ЭСПНЖК, этерифицированных спиртом ХС, апоВ-100 формирует иную, чем в ЛПОНП, активную конформацию - малую глобулу с липидами внутри и выставляет на поверхность ЛПНП апоВ-100-лиганд. Лигандные ЛПНП своими рецепторами связывают все клетки, поглощая их путем апоВ-100-эндоцитоза. Лиганды и рецепторы апоЕ/В-100 в ЛПОНП и апоВ-100 в ЛПНП, хотя и сформированы апоВ-100, в функциональном отношении существенно различаются.
В крови при гидролизе ТГ в пальмитиновых и олеиновых ЛПОНП при действии постгепариновой ЛПЛ, в процессе уменьшения количества ТГ, которые связаны с доменами апоВ-100, последний принимает первую активную конформацию деформированного бислоя белок - липид и формирует кооперативный апоЕ/В-100-лиганд. В составе ЛПНП при связывании более гидрофобных ЭСПНЖК, этерифици-рованных спиртом ХС, апоВ-100 принимает вторую активную кон-формацию малой глобулы с липи-
Рис. 5. Криоэлектронная микроскопия ЛПОНП с активной конформацией апоВ-100 в форме бислоя белок-липид (а - вид сверх и сбоку) и активная конформация апоВ-100 в ЛПНП в форме белковой глобулы с неполярными липидами в «кармане» (б). Компьютерное моделирование глобулы апоВ-100 с неполярными липидами и формирование апоВ-100-лиганда (в, г).
Рис. 6. Компьютерная модель первой активной конформации апоВ-100, которая формирует апоЕ/В-100-лиганд (вверху) и второй активной конфор-мации апо, которая формирует апов-100-лиганд (внизу).
Рис. 7. Спектр ЯМР; пики его позволяют рассчитать концентрацию ФЛ, ТГ и эфиров ПНЖК со спиртом ХС и отобразить состав субклассов ЛПНП. Черный фрагмент - пик метильных групп - СН
дами внутри. Компьютерное моделирование этих двух активных конформаций апоВ-100 приведено на рис. 6. Если рецепторного поглощения лигандных ЛПОНП не происходит по причине афизиологических рецепторов, они при продолжении липолиза превращаются в по-стлигандные пальмитиновые и олеиновые ЛПОНП с ги-дратированной плотностью ЛПНП.
ЭСПНЖК, этерифицированные спиртом ХС, обеспечивают образование второй активной конформа-ции апоВ-100 в ЛПНП в форме белковой глобулы с неполярными липидами внутри и апоВ-100-лиганда. Физиологично ЭСПНЖК, этерифицированные спиртом ХС, из ЛПВП переходят только в линолевые и линоленовые ЛПОНП, увеличивают их гидратиро-ванную плотность, уменьшают размеры и превращают ЛПОНП в ЛПНП. В афизиологических условиях ЭСПНЖК переходят в состав иных, пальмитиновых ЛПНП, которых в крови может быть в несколько раз больше, чем линолевых и линоленовых ЛПОНП вместе взятых.
Поскольку в крови через несколько часов после еды физиологически уже не бывает пальмитиновых и олеиновых ЛПОНП, ЭСПНЖК в форме эфиров ХС физиологически переходят в состав только линолевых и линоленовых ЛПНП. При длительной циркуляции в крови пальмитиновых ЛПОНП, при нарушенном ли-полизе ЭСПНЖК, этерифицированные спиртом ХС, переходят в крови не в физиологические линолевые и линоленовые ЛПНП, а в афизиологические пальмитиновые ЛПНП. Действие двух афизиологических процессов (медленный гидролиз пальмитиновых ТГ при действии постгепариновой ЛПЛ и уменьшение количества ТГ в ассоциации с апоВ-100 в ЛПОНП; переход более гидрофобных ЭСПНЖК, этерифицированных спиртом ХС, не в физиологические ЛПНП, а в афизио-логические ЛПНП, в первую очередь в пальмитиновые ЛПНП) вызывает выраженные нарушения в составе
ЛПНП и практически блокирует поглощение клетками ЭСПНЖК в форме ЛПНП путем апоВ-100-эндоцитоза. Биодоступность для клеток ЛПНП и ЭСПНЖК становится афи-зиологически низкой.
Можно обоснованно говорить, что патологические изменения в системе филогенетически ранних ЛПНП по сравнению с ЛПОНП происходят редко. ЛПНП являются филогенетически устоявшейся системой; единственной значимой их патологией является мутация апоВ-100-рецептора, уменьшение (отсутствие) их количества на плазматической мембране клеток при семейной гомо- или гетерозиготной гиперхолесте-ринемии. Значительно чаще в клинике происходят нарушения переноса в межклеточной среде и поглощения клетками тех ЖК, которые являются субстратом для обеспечения энергией биологической функции локомоции, функции движения. Сформированные в филогенезе на более поздних ступенях филогенеза и регулируемые инсулином, ЛПОНП переносят к клеткам НЖК + МЖК; на 80% это всего-то две ЖК - Пальм НЖК и олеиновая МЖК.
Теоретически в краткие (длительные) промежутки времени в крови в норме и при патологии могут циркулировать девять функциональных субклассов ЛП - прелигандные, лигандные и постлигандные хило-микроны (ХМ), ЛПОНП и ЛПНП. В физиологических условиях при формировании активной конформации апоВ-100 и превращении ЛП лигандные ХМ, ЛПОНП и ЛПНП быстро связывают апоЕ/В-48, апоЕ/В-100 и апоВ-100-рецепторами и поглощают клетки; при этом в крови не могут образоваться пост-ЛП. В афизиоло-гических же условиях, при нарушении гидролиза ТГ во всех классах ЛП формируются прелигандные ХМ, ЛПОНП и ЛПНП, которые могут накапливаться в крови. При наличии физиологического, но не оптимального субстрата липолиза - пальмитиновых ТГ и одноименных ЛПОНП; при нарушении первичной структуры постгепариновой ЛПЛ, апоС-11, печеночной ЛПЛ и апоС-111 в крови накапливаются прелигандные ХМ, ЛПОНП и ЛПНП. При патологии первичной структуры лиганда или рецептора, при блокаде поглощения клетками лигандных ЛП в крови накапливаются пост-ХМ, пост-ЛПОНП и пост-ЛПНП. Эти безлигандные пре-ЛП и пост-ЛП и формируют гетерогенность ЛПНП, которую можно выявить при зональном ультрацентрифугировании и диск-электрофорезе. Рефе-ренсным методом для оценки гетерогенности ЛПНП считают ядерную магнитную резонансную (ЯМР) спектроскопию (рис. 7).
Применение ЯМР-спектроскопии выявляет в составе ЛПНП 4 субкласса с разными физико-химическими свойствами; метод применен исследователями неоднократно. Не сделано только одно: не объяснено происхо-
Рис. 8. Гетерогенности субклассов ЛПНП по данным ЯМР спектроскопии. Выявление ЛПНП-1 - ЛПНП-4, которые образуются из пальмитиновых, олеиновых ЛПОНП, линолевых и линоленовых ЛПНП.
ждение четырех субклассов ЛПНП и диагностическое значение относительного преобладания каждого из четырех пиков. Детальное рассмотрение биохимических превращений ХМ, ЛПОНП и ЛПНП и сопоставление их физико-химических свойств с фенотипами гиперлипо-протеинемии (ГЛП) позволило установить следующее. Четыре субкласса ЛПНП, которые можно определить на основании ЯМР спектроскопии, названы ЛПНП-1 -ЛПНП-4. Самые большие с меньшей гидратированной плотностью - ЛПНП-1; самые малые и с наиболее высокой плотностью - это ЛПНП-4. Плотность и размеры субклассов ЛПНП определены содержанием в них связанных апоВ-100 ТГ и ЭСПНЖК, этерифицированных ХС. Формирование их ассоциировано с фенотипами ГЛП, которые мы выявляем при электрофорезе ЛП в геле агарозы (рис. 8).
Можно утверждать, что в более поздно сформированных в филогенезе ЛПОНП при переносе в межклеточной среде и поглощении клетками НЖК + МЖК существует на порядок больше условий для развития патологии, чем в филогенетически «устоявшихся» ЛПНП. Мы полагаем, что ЛП в плазме крови, которые мы считаем ЛПНП, на самом деле, кроме семейной ГЛП фенотипа 11а, являются афизиологическими ЛПОНП. При биохимических превращениях в крови ЛПОНП приобрели гидратированную плотность, равную таковой ЛПНП, однако по составу ЖК, которые они переносят, остаются ЛПОНП. Можно обоснованно говорить, что в составе афизиологических ЛПНП могут преобладать разные формы ТГ; чаще это пальмитиновые ТГ, такие как как олеил-пальмитоил-олеат, пальмитоил-пальмитоил-олеат и пальмитоил-пальмитоил-пальмитат. У некоторых пациентов в составе ТГ афизиологических ЛПНП при фенотипе Е2/ Е2 и аллеле е4 могут преобладать иные формы ТГ, такие, как олеил-пальмитоил-пальмитат, олеил-олеил-пальмитат и даже олеил-олеил-олеат. Однако ни один из этих ТГ не характерен для физиологических ЛПНП, которые переносят к клеткам линолевые, линоленовые ТГ и эссенциальные поли-ЖК в форме эфиров со спиртом ХС. И хотя мы уверены, что определяем ХС-ЛПНП, сделать это возможно только при физиологическом
уровне ТГ; при гипертриглицеридемии мы определяем не ХС-ЛПНП, а ХС афизиологических ЛПОНП, но с гидратированной плотностью ЛПНП.
Афизиологические пальмитиновые и олеиновые ЛПОНП с плотностью ЛПНП накапливаются в плазме крови при семейной ГЛП фенотипа I по классификации ВОЗ, при наследственной гиперхиломикронемии; семейной комбинированной ГЛП фенотипа II6; семейной гипербеталипопротеинемии, дисбеталипопротеинемии, ГЛП фенотипа III, эндогенной гипертриглицеридемии, ГЛП фенотипа IV и наследственной гипертриглицеридемии, ГЛП фенотипа (типа) V. Когда методом ЯМР-спектроскопии мы разделяем ЛПНП на 4 субкласса, сравнение их количества (в процентах) позволяет оценить афизиологические изменения в ЛПОНП. Диагностически важно выяснить, из каких секретированных гепатоцита-ми - пальмитиновых, олеиновых, линолевых и линоленовых - ЛПОНП формируются субклассы ЛПНП.
ЛПНП-1 - самые богатые ТГ постлигандные ЛПОНП с наиболее низкой плотностью, характерной для ЛПНП; это преимущественно физиологические олеиновые ЛПОНП (широкая пре^-фракция ЛП при электрофорезе), которые формируются в крови при семейной дис-беталипопротеинемии, фенотипе апоЕ - Е2/Е2, при ГЛП фенотипа III, преобладании в ЛПОНП и ЛПНП таких ТГ, как олеил-олеил-пальмитат и олеил-олеил-олеат. Содержат они и стеариновые ТГ, такие, как олеил-стеарил-пальмитат.
ЛПНП-2 - прелигандные, богатые ТГ ЛПОНП с плотностью ЛПНП - пальмитиновые и олеиновые ЛПОНП; они отражают ГЛП фенотипа Пб - семейную комбинированную ГЛП и ГЛП фенотипа IV. Образованы они при разных по этиологии нарушениях гидролиза ТГ, при избытке не только пальмитиновых, но и олеиновых ТГ, а, возможно, и при недостаточной экспрессии синтеза инсулином стеарил-КоА-десатуразы-2. В них преобладают такие ТГ, как олеил-пальмитоил-олеат и пальмитоил-олеил-пальмитат. Содержат они и стеариновые ТГ, такие, как пальмитоил-стеарил-олеат.
ЛПНП-3 - постлигандные ЛПНП, которые содержат физиологические линолевые и линоленовые ЛПОНП в форме одноименных ТГ и эссенциальных поли-ЖК в форме эфиров со спиртом ХС, которые перешли в ЛПНП из ЛПВП.
ЛПНП-4 - выраженно афизиологические (малые, плотные) пре-ЛПОНП с наиболее высокой плотностью ЛПНП; это пальмитиновые ЛПНП; образованы они пальмитиновыми ТГ, такими как олеил-пальмитоил-пальмитат, пальмитоил-пальмитоил-олеат и пальмитоил-пальмитоил-пальмитат. Содержат они и стеариновые ТГ, такие, как пальмитоил-стеарил-стеарат. Сформировались они при избытке в пище экзогенной Пальм НЖК и при синтезе in vivo из ГЛЮ пищи нефизиологической олеиновой моно-ЖК и олеиновых ТГ, а Пальм НЖК и одноименных ТГ при нарушении физиологического действия инсулина - низкой активности стеарил-КоА-десатуразы-2. Заметим, что из всех длинноцепочечных ЖК Пальм ЖК самая короткая; самым малым ТГ является пальмитоил-пальмитоил-пальмитат; поэтому при одинаковом количестве связанных a-спиралями апоВ-100 ТГ пальмитиновые ЛПНП - самые малые.
Причинами формирования афизиологических субклассов ЛПНП являются главным образом три фактора.
NADP-оксидаза
Рис. 9. Субклассы ЛП, полученные методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, у здорового добровольца (а) и у пациента с ГЛП фенотипа I, при семейной гиперхиломикронемии (б). По оси абсцисс - время элюирова-ния (в мин). Размеры ЛП в субклассах приведены в нм.
1. Афизиологически высокое содержание в пальмитиновых ЛПОНП таких ТГ, которые являются неоптимальным субстратом для постгепариновой ЛПЛ.
2. Нарушение образования активной конформации апоВ-100 в ЛПОНП и ЛПНП, отсутствие в ЛПОНП апоЕ/В-100-лиганда и апоВ-100-лиганда в ЛПНП.
3. Низкая аффинность, снижение числа или отсутствие рецепторов для ЛП на плазматической мембране клеток.
ЛПНП-1 преобладают по причине низкой аффинности апоЕ/В-100 рецептора к апоЕ/В-100-лиганду в лигандных пальмитиновых и олеиновых ЛПОНП. Это тест диагностики семейной дислипопротеинемии, ГЛП фенотипа III.
ЛПНП-2 преобладают в ЛПНП, более вероятно, по нескольким эндогенным причинам; это семейная комбинированная ГПЛ фенотипа 11б. Они включают патологию липолиза по причине врожденно нарушенной первичной структуры и активности постгепариновой ГПЛ или ее кофактора апоС-11, при мутации белка переносящего эфиры ХС, при редкой первичной патологии печеночной ЛПЛ, при синдроме резитентности к инсулину. Среди пациентов с ГЛП фенотип 11б встречается намного чаще, чем ГЛП фенотипа IV.
ЛПНП-3 - тест семейной гиперхолестеринемии, ГЛП фенотипа Па при снижении (отсутствии) на плазматической мембране апоВ-100-рецепторов.
ЛПНП-4 преобладают в составе ЛПНП, наиболее часто при доминировании пальмитиновых ЛПОНП, в том числе и над олеиновыми. Происходит это при избытке в пище экзогенной Пальм НЖК и синтезе гепатоцитами из углеводов и ГЛЮ пищи нефизиологической олеиновой МЖК, олеиновых ТГ и ЛПОНП, а только Пальм НЖК,
одноименных ТГ и ЛПОНП; происходит это при недостатке in vivo инсулина или при синдроме резистентности к нему.
Достоверность деления ЛП класса ЛПНП на 4 субкласса (ЛПНП-1 - ЛПНП-4) методом ЯМР-спектроскопии подтверждают и данные высокоэффективной жидкостной хроматографии при использовании колонок, заполненных гелем TSK липо-пропат XL; разделение ЛПНП произошло также на 4 субкласса. При этом общее число субфракций в ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП превысило 20 (рис. 9).
4. Пре- и постлигандные (безлигандные) ЛПОНП и ЛПНП - субстрат для физиологической и патологической модификации.
Нарушение последовательного превращения ХМ, ЛПОНП и ЛПНП в 3 формы (прелигандные ХМ, ЛПОНП и ЛПНП; лигандные формы трех ЛП, пост-ХМ, ЛПОНП и ЛПНП) заканчивается формированием безлигандных ЛП. При отсутствии лиганда их не могут поглотить клетки; они становятся в крови биологическим «мусором». В соответствии с филогенетической теорией общей патологии все они будут удалены из кровотока при реализации биологической функции эндоэкологии, биологической реакции воспаления.
Филогенетически реализация биологической функции воспаления и утилизация биологического «мусора» является функцией оседлых (резидентных) макрофагов в локальном пуле рыхлой соединительной ткани. Пул рыхлой соединительной ткани для поддержания «чистоты» во внутрисосу-дистом пуле межклеточной среды филогенетически локализован в интиме артерий, эластического и сме-
Рис.10. Образование АФК и иона гипохлорида нейтрофила-ми в реакции «респираторного взрыва»; денатурация ими эндогенных флогогенов и инфекционных патогенов.
■Й HV0MCEL Т U№ + 1ДО KrtMGCiniPOtUií») в HKwweii u« tifw ©
ll.illl t a.^FTc
Рис. 11. Фракция Р-ЛП с окисленными ЛПНП приближается к фракции а-ЛП наиболее близко. Полоса ЛП за а-фракцией ЛП - ЛП(а), перед ней - НЭЖК + альбумин.
шанного (мышечно-эластического) типа. Однако без-лигандные ЛП находятся в крови, а оседлые макрофаги - в интиме артерий, между ними непроницаемый для биологического «мусора» монослой эндотелия. Часто можно слышать, что ЛП «инфильтрируют» стенку артерий; биологически это нереально. Выведение безли-гандных ЛП в интиму активно осуществляют биологические реакции воспаления и трансцитоза, которые реализует монослой эндотелия. В течение двух десятков лет мы излагаем, как накопленные в крови безлиганд-ные ЛПОНП и ЛПНП становятся эндогенными флого-генами - инициаторами биологической реакции воспаления. Позже они накапливаются в интиме артерий и формируют афизиологический процесс, который мы именуем атероматозом и который является причиной клинической картины острого коронарного синдрома.
Несмотря на то что все безлигандные ЛП являются биологическим «мусором», они синтезированы эндогенно и они «свои». Удаление их из кровотока в биологической реакции воспаления начнется тогда, когда толл-подобные рецепторы на мембране иммуннокомпетентных клеток, которые разделяют in vivo все макромолекулы белка на «свой - не свой», не признают ЛП «не своими». Для этого все безлигандные ЛП требуется физиологично денатурировать. Реализуют этот этап физиологической реакции воспаления нейтрофилы, которые в реакции «респираторного взрыва» нарабатывают активные формы кислорода (АФК) и денатурируют апоВ-100, формируя на поверхности афизиологические эпитопы. Далее следует опсони-зация «не своих» ЛП компонентами комплемента. После клетки монослоя эндотелия реализуют биологическую реакцию трансцитоза и выводят безлигандные, модифицированные, а по-сути, физиологично денатурированные ЛП в интиму артерий, реализуя при этом биологическую функцию эндоэкологии и биологическую реакцию воспаления.
Наработка нейтрофилами АФК в биологической реакции воспаления всегда является вторичной, субстрат-зависимой; насколько много в крови ЛП, которые не сформировали лиганд, в которых нарушена конформация апоВ-100, которые подлежат удалению, настолько выраженной будет и адекватная физиологическая денатурация. Чем больше гепатоциты секретируют пальмитиновые ЛПОНП, чем чаще в них нарушена конформация апоВ-100, тем больше нейтрофилы нарабатывают патофизиологические АФК (рис. 10), а монослой эндотелия выводит
модифицированные ЛП в интиму артерий эластического типа путем активно инициированной биологической реакции трансцитоза; ни о какой пассивной инфильтрации речи не идет. Трансцитоз - это активная функция монослоя эндотелия, которая анатомически разъединяет, а функционально объединяет in vivo все локальные пулы межклеточной среды.
О модифицированных ЛП как промежуточных формах в физиологической реакции воспаления сказано и написано много.
1. Охарактеризованы биохимические и физико-химические реакции, которые приводят к их образованию.
2. Предложены разные физико-химические методы определения содержания в крови циркулирующих модифицированных ЛП.
3. Выявлены физико-химические различия физиологических ЛПОНП и ЛПНП по сравнению с безли-гандными, физиологически модифицированными ЛП (размеры, плотность, наличие отрицательного заряда, сниженное содержание ФЛ и ТГ; рис. 11).
4. Выяснено воздействие нейтрофилов на безлигандные ХМ, ЛПОНП и ЛПНП с формированием физиологических модифицированных форм in situ в интиме артерий.
5. Установлены механизмы физиологической денатурации нейтрофилами безлигандных ЛП путем перекис-ного окисления апоВ-100 (формирование иммуноген-ных детерминант), а заодно и ЖК.
6. Показано взаимодействие модифицированных ЛП с компонентами гликокаликса и оседлыми макрофагами интимы артерий.
7. Определена склонность модифицированных ЛП к агрегации при наличии на поверхности отрицательного заряда, что нехарактерно для физиологических ЛПНП и ЛПОНП.
8. Показана ведущая роль безлигандных модифицированных ЛП в формировании липидных атероматозных масс в интиме артерий.
Химическими агентами, которые могут модифицировать безлигандные ЛП в крови, кроме АФК, являются: малоновый диальдегид, гликотоксины (глиоксаль, метилглиоксаль, иные диальдегиды), разные бифункциональные реагенты. Модификацию ЛПОНП и ЛПНП формируют биохимические реакции пальмитоилирова-ния, сиалирования, гликирования, ацилирования и ацети-лирования, образование в кровотоке аутоантител к эпи-топам модифицированных безлигандных ХМ, ЛПОНП и ЛПНП. Давно отмечено, что в модифицированных ЛПНП по сравнению с физиологическими выраженно изменена третичная структура апоВ-100 - нет активной конформа-ции; все безлигандные модифицированные ЛП не могут связывать ни апоЕ/В-48-, ни апоЕ/В-100-, ни апоВ-100-рецепторы.
В биологической реакции воспаления при накоплении в межклеточной среде пре-ХМ и пре-ЛПОНП в интиме артерий формируется деструктивно-воспалительное поражение по типу атеротромбоза с образованием «мягких», объемных, богатых пальмитиновыми и олеиновыми ТГ липидов. Они склонны к разрыву монослоя эндотелия, который их покрывает, с формированием тромбоза коронарных артерий. Если в плазме крови накапливаются пост-ЛП, в интиме артерий формируется деструктивно-воспалительное поражение по типу ате-
Рис. 12. Многоплановая функция макрофага в регуляции иммунного ответа на стимуляцию эндогенными флогогенами или инфекционными патогенами.
Стимул
Лейкоцит
Активация IFN^y
Активация
TNFcx
СИМПТОМЫ
Фактор
Мобилизация хемотаксиса (RANTES)
Т-лимфоцит
Мобилизация
Ф ~ фузафунгин
роматоза. При этом формируются плотные, плоские, не суживающие просвет атероматозные массы из эфиров ХС и кристаллов спирта ХС-моногидрата. Подобные бляшки не рвутся, но в центре некротизированные массы подвергаются эрозии, они также являются местом формирования тромбоза коронарных артерий. Из 10 разорвавшихся бляшек в интиме артерий девять являются мягкими, атеротромботическими и только одна - атеро-матозная.
Основная роль в формировании деструктивно-воспалительного процесса в интиме артерий принадлежит оседлым, резидентным макрофагам. Они призваны утилизировать разнообразный эндогенный и экзогенный биологический «мусор», который макрофаги поглощают, выполняя функцию скевенджер-рецепторов, рецепторов-»мусорщиков». Ими макрофаги поглощают и все пре-ЛП и пост-ЛП; клетки воспринимают их как денатурированные макромолекулы белка. Имея высокоактивные лизосомы с разными гидролазами, оседлые макрофаги подвергают гидролизу все эндогенные флогогены и экзогенные патогены до аминокислот, коротких пептидов и малого биологического «мусора», который может экс-кретироваться с мочой. Поглощая пост-ЛП как глобулы с липидами внутри, макрофаги не оценивают особенности этих липидов.
Когда дело доходит до гидролиза ЭСПНЖК, этерифи-цированных спиртом ХС, оказывается, что в лизосомах макрофагов нет кислых гидролаз для эфиров ХС. Согласно филогенетической теории общей патологии, макрофаги, мы полагаем, стали функционировать на ранних ступенях филогенеза, когда все ЖК к клеткам переносили только ЛПВП в форме полярных липидов и в форме ФЛ. В силу филогенетически раннего происхождения макрофаги не имеют на плазматической мембране апоВ-
100-рецепторов, а в лизосомах нет кислой гидролазы для ЭСПНЖК этерифицированных спиртом ХС. ЭСПНЖК в форме эфиров накапливаются в цитозоле, формируют специфичные афизиологические пенистые клетки, которые погибают путем некроза. С этого момента деструктивное поражение интимы становится деструктивно-воспалительным. Некротизированные массы начинают поглощать новые сформированные из моноцитов макрофаги, и процесс продолжается. Основным компонентом бляшек, которые формируют макрофаги из пост-ЛП, являются ЭСПНЖК в форме эфиров со спиртом ХС, которых так не достает всем иным клеткам in vivo. Дефицит в клетках ЭСПНЖК и формирует патогенетическую основу атеросклероза.
В диагностическом процессе клинического биохимического исследования содержание модифицированных ЛПНП не определяют, в этом нет необходимости. При проведении электрофореза ЛП разная длина пробега фракции Р-ЛП указывает на присутствие модифицированных ЛП; последние продвигаются к аноду на большее расстояние и оказываются ближе к фракции а-ЛП (рис. 12). Несомненно, все апоВ-100 ЛП, содержание которых в плазме крови натощак превышает физиологическое, являются функционально денатурированными, модифицированными. Клиническая биохимия как дисциплина диагностическая разумно консервативна. И если два теста достоверно, высокозначимо коррелируют между собой, то один из них в диагностике явно не нужен. Вместе с тем при оценке разных методов модификации неоднократно показана высокая корреляционная зависимость между содержанием модифицированных ЛП, уровнем ТГ в плазме крови и ХС-ЛПНП. Величина ХС-ЛПНП достоверно информирует нас о том, что эквимольно концентра-
ции спирта ХС в межклеточной среде накапливаются ЭСПНЖК, которые по причине отсутствия лигандов у ЛПНП не могут поглотить клетки и становятся компонентами атероматозных масс в интиме артерий.
Каким бы из предложенных тестов мы не определяли содержание модифицированных ЛПНП, оно всегда будет высокозначимо коррелировать с уровнем ХС-ЛПНП. Поскольку ХС-ЛПНП определять существенно проще, измерение модифицированных ЛПНП в диагностике не востребовано. Применение статинов снижает в крови содержание модифицированных, электронегативных ЛПНП; параллельно в плазме крови снижается уровень ХС-ЛПВП и уменьшается содержание ТГ. В эксперименте показано, что скорость движения Р-ЛП при электрофорезе зависит от длительности преинкубации с АФК. Чем более окисленным (денатурированным) является апоВ-100 в ЛПНП, тем большим оказывается их пробег к аноду.
Все рассуждения о первичной активации перекисно-го окисления липидов и апоВ-100 не имеют достаточных оснований. Это субстратзависимая биологическая реакция в рамках биологической функции эндоэколо-гии, биологической реакции воспаления. Единственно физиологической является модификация безлигандных ЛП при действии АФК. Модификация иными способами является патологической и происходит при накапливании в межклеточной среде афизиологических метаболитов, в частности гликотоксинов при сахарном диабете. Наиболее атерогенными ЛП, согласно единому мнению, являются малые, плотные ЛПНП-4, которые образуются в кровотоке из пальмитиновых ЛПОНП. В них Пальм НЖК является филогенетически ранним, физиологическим, но далеко не оптимальным субстратом для гидролиза филогенетически поздней постгепариновой ЛПЛ. Основной причиной повышения в крови содержания физиологически денатурированных модифицированных пост-ЛП является нарушение биологической функции трофологии, биологической реакции экзотрофии и высокого содержания в пище Пальм НЖК.
В клинической биохимии определение индивидуально модифицированных безлигандных ЛП в плазме крови, как и антител к ним, диагностического значения не имеет. Каким бы образом не были модифицированы ЛП, фибробласты никогда не начнут поглощать безлиганд-ные ЛП; макрофагам же как клеткам-«мусорщикам»
безразлично, каким образом денатурированы ЛП. С позиций диагностики более важно определить в плазме крови содержание ЖК и индивидуальных ТГ, а далее на этой основе выстроить практически значимую профилактику атеросклероза, атероматоза интимы артерий эластического типа и острого коронарного синдрома.
Вопросы для самоконтроля
1. Что такое конформационные изменения в молекуле белка?
2. Какие ЛПОНП секретируют в кровоток гепатоциты?
3. Какие три этапа претерпела система ЛП на ступенях филогенеза?
4. Каковы условия формирования апоЕ/В-100-лиганда в ЛПОНП и апоВ-100-лиганда в ЛПНП?
5. Отличается ли физиологическая денатурация без-лигандных ЛП при действии АФК от афизиологической модификации при патологических процессах?
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Титов В.Н., Амелюшкина В.А. Электрофорез белков сыворотки крови. М.: Оптимум пресс; 1994.
2. Титов В.Н. Первичный и вторичный атеросклероз, атероматоз и атеротромбоз. М.: Триада; 2008.
3. Титов В.Н. Филогенетическая теория общей патологии, Патогенез метаболических пандемий. Атеросклероз. М.: ИНФРА-М; 2013.
4. ТитовВ.Н. Статины, холестерин, жирные кислоты и диабет. Научный диалог. 2013; 3 (15): 148-83.
5. Титов В.Н., Востров И.А. ШиряеваЮ.К., Каба С.И. Становление в филогенезе липопротеинов низкой, очень низко плотности и инсулина. Липотоксичность жирных кислот и липидов. Позиционные изомеры триглицеридов. Успехи современной биологии. 2012; 132 (5): 516-36.
REFERENCES
1. Titov V.N., Amelyushkina V.A. Electrophoresis of serum proteins. Moscow: Optimum press; 1994 (in Russian).
2. Titov V.N. Primary and secondary atherosclerosis, atheromatosis and atherothrombosis. M.: Triada; 2008 (in Russian).
3. Titov V.N. Phylogenetic theory of general pathology, pathogenesis of metabolic pandemics. Atherosclerosis. M.: INFRA-M; 2013 (in Russian).
4. Titov V.N. statins, cholesterol, fatty acids and diabetes. Nauchnyi dialog. 2013; 3 (15): 148-83 (in Russian).
5. Titov V.N., Vostrov I.A., Shiryaevf J.K., Kaba S.I. Becoming a phylogeny lipoprotein, very low density and insulin. Lipotoxicity fatty acids and lipids. The positional isomers of triglycerides. Uspechi sovremenoy biologii. 2012; 132 (5): 516-36 (in Russian).
Поступила 20.06.13
