CC BY
50
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. - 2011. - Вип. 2, т. 1. - С. 95-100. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Medicine. - 2011. - Vol. 2, N 1. - P. 95-100.
УДК 579.841.11:577.18
К. М. Нестерук, І. Є. Соколова, О. В. Братусь
Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара
РOЗПOВСЮДЖEНІСТЬ KAРБAПEНEMРEЗИСТEНТНИX ШТAMІВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA - ПРOДУЦEНТІВ MEТAЛO-p-ЛAKТAMAЗ
У багатьох країнах із клінічного матеріалу виділено грамнегативні мікроорганізми, що виявилися продуцентами метало-р-лактамаз. Досліджено полірезистентні штами Pseudomonas aeruginosa, виділені із сечі пацієнтів. Oцінено чутливість штамів до іміпенему та досліджено продукцію карбапенемгідролізувальних ферментів у резистентних і помірно стійких штамів. За результатами фенотипового тесту встановлено високий рівень розповсюдженості метало-р-лактамаз. Це зумовлює необхідність здійснення моніторингу за поширенням продуцентів ферментів, які гідролізують карбапенеми.
Е. Н. Нестерук, И. Е. Соколова, Е. В. Братусь
Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара
PACTPOCTPAHEHHOCTb KAРБAПEНEMРEЗИСТEНТНЫX ШТAMMOВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA - ПРOДУЦEНТOВ MEТAЛЛO-p-ЛAKТAMAЗ
Во многих странах из клинического материала выделены грамотрицательные микроорганизмы, которые оказались продуцентами металло-р-лактамаз. Исследованы полирезистентные штаммы Pseudomonas aeruginosa, выделенные из мочи пациентов. O^tom чувствительность штаммов к имипенему и исследована продукция карбапенемгидролизирующих ферментов у резистентных и умеренно стойких штаммов. При использовании фенотипического теста установлен высокий уровень распространенности металло-р-лактамаз. Это обусловливает необходимость проведения мониторинга за распространением продуцентов ферментов, которые гидролизируют карбапенемы.
K. M. Nesteruk, I. E. Sokolova, O. V. Bratus Oles’ Нonchar Dnipropetrovsk National University
OCCURRENCE OF CARBAPENEM RESISTANT PSEUDOMONAS AERUGINOSA PRODUSING METALLO-P-LACTAMASES
The existence of Gram-negative bacilli producing metallo-p-lactamase has been increasingly reported in many countries. The polyresistant strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from patients’ urine were studied. The sensitiveness of strains to imipenem was assessed. The production of carbapenem-hydrolysing enzymes in resistant and moderately resistant strains was investigated. A high level of prevalence of the metallo-p-lactamase according to phenotypical test was showed. The necessity of monitoring of the distribution of carbapenem-hydrolysing enzymes producers is grounded.
© К. М. Нестерук, І. Є. Соколова, О. В. Братусь, 2011
Вступ
Інфекції сечовивідних шляхів відносять до найпоширеніших бактеріальних інфекцій в амбулаторній практиці урологів, акушерів-гінекологів і терапевтів [4]. У розвитку інфекцій сечовивідних шляхів головне місце займають грамнегативні мікроорганізми, проте етіологічна структура збудників змінюється із року в рік, що пов’язано з упровадженням нових антибіотиків та зміною мікрофлори людини. У зв’язку з цим важливим є дослідження структури комплексу збудників та їх чутливості до антибіотиків.
Стійкість мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів - неминучий наслідок широкого клінічного застосування останніх. У різні періоди - залежно від структури застосування антибіотиків - найрозповсюдженіші ті або інші механізми резистентності. Протягом останніх років карбапенеми, насамперед іміпенем і меропенем, міцно утримують одне з перших місць як препарати резерву при лікуванні інфекцій сечовивідних шляхів. Однак і ці антибіотики не стали винятком із загального правила, уже незабаром після впровадження карбапенемів описано мікроорганізми, що виявляють до них стійкість. Відомо декілька механізмів резистентності мікроорганізмів до карба-пенемів, однак основний із них - ферментативний гідроліз антибіотиків метало-Р-лактамазами (МрЛ) [3-5].
Враховуючи все вказане вище, мета даної роботи - оцінити розповсюдженість серед полірезистентних мікроорганізмів, виділених із сечі, карбапенемрезистентні штами Pseudomonas aeruginosa - продуцента метало-Р-лактамаз.
Матеріал і методи досліджень
Полірезистентні штами P. aeruginosa виділені із сечі пацієнтів у лабораторії Діагностичного центру медичної академії протягом 2010 року. При використанні дис-ко-дифузійного методу оцінки антибіотикочутливості виділених бактерій відібрано резистентні та помірно стійкі штами відносно іміпенему.
Принцип диско-дифузійного методу ґрунтується на феномені пригнічення антибіотиком поверхневого видимого росту мікроорганізмів на щільному агаровому середовищі. Для приготування інокуляту використовували 18-20-годинну агарову культуру досліджуваного штаму P. aeruginosa. Суспензію з агарової культури доводили до оптичної густини 0,5 за стандартом Мак-Фарланда [2]. Підготовлений таким чином інокулят наносили стерильним ватним тампоном на поверхню чашки Петрі із середовищем Мюллера-Хінтона та рівномірно розтирали по поверхні у декількох площинах. На поверхню агару накладали стандартний диск, який містив 10 мкг іміпенему. Діаметр зон затримки росту з урахуванням діаметра самого диска вимірювали з точністю до 1 мм. При вимірюванні зон затримки росту орієнтувалися на повне пригнічення видимого росту [2].
Для виявлення продукції карбапенемаз у P. aeruginosa застосовано Hodge тест. Досліджували помірно стійкі та резистентні до іміпенему штами.
Для приготування інокуляту використовували 18-20-годинну агарову культуру індикаторного мікроорганізму - Escherichia coli АТСС 25922, використаного як негативний контроль. Суспензію з агарової культури доводили до оптичної густини 0,5 за стандартом Мак-Фарланда. Інокулят розсівали на поверхні чашки Петрі із середовищем Мюллера-Хінтона. У центр чашки клали паперовий диск з іміпенемом (10 мг) і за допомогою мікродозатора наносили 10 мкл 50 мМ розчину ZnSO4. Відібрані добові штами P. aeruginosa підсівали до паперового диска з іміпенемом радіальною лінією від центра чашки до периферії. У такий самий спосіб на кожну чашку висівали штам 96
P. aeruginosa VIM-10, який слугував позитивним контролем. Після цього проводили добову інкубацію за температури +37 °С. Присутність зміненої зони пригнічення росту розглядали як позитивний результат продукції ферментів, які гідролізують карбапене-ми [6; 8; 9].
Для фенотипічного скринінгу продукції МрЛ застосовано метод DDST (від англ. DDST - double-disk synergy test) подвійних дисків з етилендиамінтетраоцговою кислотою (ЕДТО) [8]. Принцип методу ґрунтується на здатності ЕДТО хелатувати йони цинку з активного центру метало-Р-лактамаз і пригнічувати їх гідролітичну активність відносно Р-лактамних субстратів. При визначенні чутливості МрЛ-продуцентів методом диск-дифузії за присутності ЕДТО спостерігали розширення зон пригнічення росту навколо дисків із Р-лактамними антибіотиками, що пов’язано з інгібуванням МрЛ і відновленням активності Р-лактамів.
Постановка диско-дифузійного тесту здійснена для штамів P. aeruginosa - продуцентів карбапенемаз відповідно до методичних вказівок щодо виявлення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів. Досліджені культури P. aeruginosa висівали на середовище Мюллера-Хінтона означеним вище способом і через 5-10 хвилин на підсохлу поверхню агару накладали диски за такою схемою: у центр - пустий диск, на який наносили 5 мкл 0,5 М розчину ЕДТО (рН 8,0), з боків від нього на відстані 15 мм між центрами дисків - диски з цефтазидимом, іміпенемом і меропене-мом. Чашки інкубували в термостаті при +37 °С протягом 16-18 годин [2; 7; 8].
Одночасно з аналізом досліджуваних культур проводили оцінку контрольних штамів: P. aeruginosa VIM-10 - як позитивного контролю, P. aeruginosa АТСС 27853 -як негативного контролю.
Утворення розширеної зони пригнічення росту між диском з ЕДТО і хоч з одним диском, що містить лактамні антибіотики, вказує на продукцію МрЛ у тестованого мікроорганізму. Комбінація із трьох дисків (іміпенем, меропенем, цефтазидим) використовується для підвищення чутливості методу, оскільки деякі штами можуть проявляти синергізм тільки з одним з антибіотиків [9; 10].
Результати та їх обговорення
Із 17 досліджуваних штамів (табл.) визначено іі резистентних, 4 - помірно стійких і 2 - чутливих до іміпенему, що складають відповідно 64,7, 23,5 та 11,8 %. Для подальшого вивчення взято в роботу резистентні та помірно стійкі мікроорганізми (15 штамів). Фенотипічний Hodge-тест застосований для виявлення продукції карбапенемаз у P. aeruginosa. Досліджували помірно стійкі та резистентні штами до іміпенему, адже саме цей антибіотик використовується у клінічній практиці, він чутливіший до карбапенемаз [6; 8].
У ході експерименту серед 15 штамів (іі резистентних і 4 помірно стійких) за Hodge тестом визначено 6 штамів з активною продукцією карбапенемаз. Як позитивний результат у визначенні продукції ферментів, що гідролізують карбапенеми, приймали присутність зміненої зони інгібування навколо паперового диска з іміпенемом, обробленого розчином ZnSO4. Позитивні результати тесту для досліджуваних штамів збігалися з результатами, отриманими для позитивного контрольного штаму P. aeruginosa VIM-10 (рис. і).
Отримані 9 негативних результатів свідчать про наявність у штамів P. oeruginosa інших механізмів резистентності до карбапенемів, окрім дії карбапенемаз. До таких механізмів відносять втрату поринового білка opr D, хромосомну Р-лактамазу класу Amp Cта ефлюкс [і; 5].
Чутливість Pseudomonas aeruginosa до іміпенему та продукція ферментів, які гідролізують карбапенеми
Ступінь чутливості бактерій до антибіотиків Чутливість до іміпенему, % штамів Здатність продукувати карбапенемази, % штамів
Чутливі 11,8 -
Помірно стійкі 23,5 6,6
Резистентні 64,7 33,3
Рис. 1. Hodge тест - виявлення продукції карбапенемаз:
1 - позитивний контроль Pseudomonas aeruginosa VIM-10, 2 - негативний результат,
З, 4 - досліджувані штами P. аeruginosa - продуценти карбапенемаз (позитивний результат)
Отримані результати вказують на те, що розповсюдженість штамів-продуцентів карбапенемаз серед резистентних до іміпенему P. аeruginosa складає 39,9 %. Найбільшу групу карбапенемаз складають метало-Р-лактамази (молекулярного класу В), серед яких виділяють: VIM, SPM та IMP групи. До карбапенемаз також відносять ферменти класу А - груп SME, NMS/IMI та KPS; класу Д (ОХА), що здійснюють гідроліз пеніцилінів і цефалоспоринів [3].
На наступному етапі дослідження проведено скринінг метало-Р-лактамаз серед штамів P. аeruginosa - продуцентів карбапенемаз.
Метало-Р-лактамази належать до ферментів молекулярного класу В, і, на відміну від серинових Р-лактамаз, ферменти цього типу мають в активному центрі два атоми цинку. У результаті цього активність МрЛ пригнічується не класичними інгібіторами серинових Р-лактамаз (клавулановою кислотою, сульбактамом, тазобактамом), а різними хелатувальними, тобто зв’язуючими іони двовалентних металів агентами, наприклад, етилендиамінтетраоцтовою кислотою чи 2-меркаптопропіоновою кислотою. Білкова глобула МрЛ складається з двох доменів, у кожному з яких є по два атоми цинку. Обидва домени мають практично однакову топологію. Передбачається, що ці ферменти виникли в результаті дуплікації гена, який кодує один із доменів [2; 3; 8]. Метало-Р-лактамази ефективно гідролізують усі Р-лактамні антибіотики. Тому виявлення продуцентів МрЛ серед грамнегативних мікроорганізмів необхідне для оптимального лікування пацієнтів, контролю за швидкістю розповсюдження резистентності [8].
За результатами аналізу встановлено, що всі 6 досліджуваних штамів P. аeruginosa продукують МрЛ (рис. 2). Це свідчить про високий рівень розповсюдже-ності МрЛ-індукованої резистентності до карбапенемів.
За останнє десятиліття описано 5 генетичних груп набутих МрЛ: VIM, IMP, SPM, GIM i SIM. Найширше розповсюдження та клінічне значення отримали ферменти VIM і IMP типів. Швидке розповсюдження МрЛ значною мірою зумовлене тим, що їх кодувальні гени, за винятком blaSIM-1, локалізовані всередині мобільних генетичних елементів - інтегронів. Крім того, зчеплення генів МрЛ з іншими детермінантами резистентності у складі інтегронів - часта причина множинної антибіотикостійкості штамів-продуцентів МрЛ [3].
Рис. 2. Виявлення продукції метало-р-лактамаз за допомогою методу подвійних дисків з ЕДТО: 1-6 - досліджувані штами Р. аеги§іпв8а (позитивні результати, МрЛ+), 7 - Р. аеги§іпо8а УІМ-10 (позитивний контроль),
8 - Р. аеги§іпо8а АТСС 27853 (негативний контроль)
Зростаюча розповсюдженість набутих метало-Р-лактамаз змушує звернути увагу на підвищення їх клінічної важливості, а також необхідність здійснення моніторингу за поширенням продуцентів МрЛ.
Висновки
Серед 17 полірезистентних штамів Р. аeruginosa виявлено 11 резистентних і 4 помірно стійких до іміпенему. За підсумками Hodge-тесту, серед резистентних і помірно стійких до іміпенему штамів виявлено 6 позитивних результатів на продукцію карбапенемаз. Розповсюдженість штамів-продуцентів карбапенемаз серед резистентних і помірно стійких до іміпенему складає відповідно 33,3 та 6,6 %. Отримані 9 негативних результатів свідчать про наявність у штамів Р. аeruginosa інших механізмів резистентності до карбапенемів, крім дії карбапенемаз. За результатами фенотипічного тесту наявність метало-Р-лактамаз встановлена у 100 % штамів, що продукують карба-пенемгідролізувальні ферменти. Такий високий рівень розповсюдженості МрЛ зумов-
99
лений тим, що їх кодувальні гени локалізовані всередині мобільних генетичних елементів - інтегронів. Зчеплення генів МрЛ з іншими детермінантами резистентності у
складі інтегронів - причина множинної антибіотикостійкості штамів-продуцентів МрЛ.
Бібліографічні посилання
1. Антибактериальные лекарственные средства. Методы стандартизации препаратов. - М. : Медицина, 2004. - 944 с.
2. Методика клинических лабораторных исследований. Справочное пособие. - Т. 3. Клиническая микробиология. Паразитологические исследования. Инфекционная иммунодиагностика. Молекулярные исследования в диагностике инфекционных заболеваний / Под ред. В. В. Меньшикова. - М. : Лабора, 2009. - 880 с.
3. Сидоренко С. В. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам / С. В. Сидоренко, В. И. Тишков // Успехи биологической химии. - 2004. - Т. 44. - С. 263-306.
4. Страчунский Л. С. Резистентность грамотрицательных возбудителей инфекций мочевыводящих путей к антибактериальным препаратам / Л. С. Страчунский, С. В. Сехин, Э. Р. Абра-рова // Терапевтический архив. - 2000. - № 6. - С. 30-35.
5. Яковлев С. В. Устойчивость Pseudomonas aeruginosa к карбапенемам: уроки исследования MYSTIC // Фарматека. - 2007. - № S/9. - С. 56-62.
6. Anderson K. F. Evaluation of methods to identify the Klebsiella pneumoniae carbapenemase in Enterobacteriaceae / K. F. Anderson, D. R. Lonsway, J. K. Rasheed // Journal of Clinical Microbiology. - 2007. - Vol. S. - P. 2723-2725.
7. Arakawa Y. Convenient test for screening metallo-p-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds / Y. Arakawa, N. Shibata, K. Shibayama // Journal of Clinical Microbiology. -2000. - Vol. 6. - P. 40-43.
S. Lee K. Modified Hodge and EDTA-disk synergy tests to screen metallo-p-lactamase-producing
stains of Pseudomonas and Acinetobacter species / K. Lee, Y. Chong, H. B. Shin // Clinical Microbiology and Infection. - 2001. - Vol. 7. - P. 88-102.
9. Lee K. Evaluation of Hodge test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-P-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. / K. Lee, Y. S. Lim, D. Yong // Journal of Clinical Microbiology. - 2003. - Vol. 10. - P. 4623-4629.
10. Migliavacca R. Simple microdilution test for detection of metallo-p-lactamase-producing in Pseudomonas aeruginosa / R. Migliavacca, J. D. Docquier, C. Mugnaioli // Journal of Clinical Microbiology. - 2002. - Vol. 11. - P. 4388-4390.
Надійшла до редколегії 26.04.2011
