CC BY
32
МЕДИ^
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ЭРИТРОМИЦИН- И ТЕТРАЦИКЛИН-РЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ S. MUTANS, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ЗУБНОГО НАЛЕТА ДЕТЕЙ ГОРОДА САНКТ-ПЕТЕРБУРГА
Актуальность. S. mutans считается представителем нормальной микрофлоры полости рта, отдельные вирулентные штаммы могут являться этиологическим фактором кариеса зубов, а также некоторых системных заболеваний. Имеются сведения, что среди этих бактерий распространено носительство генов антибиотикорезистентности, возможна их горизонтальная передача более патогенным микроорганизмам. Цель исследования. Оценить распространенность эритромицин- и тетрациклин-резистентных штаммов S. mutans, изолированных из зубного налета детей. Определить ведущий механизм их устойчивости к макролидам. Материалы и методы. Исследовано 86 штаммов S. mutans, изолированных из зубного налета детей 6-17 лет. Скрининг на резистентность к эритромицину осуществлялся двумя методами - фенотипическим и генотипическим, к тетрациклину - только фенотепическим. Результаты. Доля изолятов S. mutans, фенотипически-резистентных к эритромицину, составила более 16%, к тетрациклину -26,7%. Преобладающий молекулярно-генетический механизм резистентности к эритромицину - наличие mef A-гена (78,6% всех эритромицин-резистентных штаммов). 10,5% всех исследованных штаммов S. mutans являются потенциальным резервуаром генов антибиотикорезистентности (erm B и mef A) в горизонтальной передаче.
Ключевые слова: S. mutans, Viridans Streptococci, гены антибиотикорезистентности, ПЦР, erm B, mef A.
Т.В. Бродина1, А.В. Любимова1, А.Е. Фетинг1, А.В. Силин1, Р.Ф. Юсупова1, Е.А. Климова2,
1ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. ИИ Мечникова», г. Санкт-Петербург, 2ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»
Бродина Татьяна Владимировна -e-mail: [email protected]
Relevance. S. mutans is considered a representative of normal flora of oral cavity, separate virulent strains may become an etiological factor of dental caries, as well as of some other systemic diseases. The data on spread of gene carrying capacity of antibiotic resistance among these bacteria is available, their horizontal transmission to more pathogenic microorganisms is also possible. Purpose of the study. Evaluation of the spread of erythromycin and tetracycline resistant strains of S. mutans, which were isolated out of dental deposits of children. Determination of the basic mechanism of their resistance to macrolides. Materials and methods. 86 strains of S. mutans isolated out of dental deposits of 6-17 year old children were studied. The screening of resistance to erythromycin was carried out with the use of two methods, phenotypic and genotypic, including application of only phenotypic methods in case of determining resistance to tetracycline. Results. The part of isolates of S. mutans which are phenotypically resistant to erythromycin comprised more than 16%, to tetracycline - 26,7%. The predominant molecular and genetic mechanism of resistance to erythromycin presupposes the occurrence of mef A-gene (78,6% of all erythromy-cin-resistant strains). 10.5% of all the studied strains of S. mutans constitute potential reservoirs of antibiotic resistance genes (erm B and mef A) in horizontal transmission.
Key words: S. mutans, Viridans Streptococci, antibiotic resistance genes,
PCR, erm B, mef A.
ВВЕДЕНИЕ
S. mutans из группы Viridans Streptococci (VGS) являются частью нормальной микрофлоры ротовой полости, которая играет важнейшую роль в подавлении колонизации полости рта другими патогенами. Однако, вирулентные штаммы S. mutans способны инициировать развитие кариеса зубов. У пациентов со снижением иммунитета (нейтро-пения, иммунокомпромисс) их наличие считается фактором риска аутоиммунного нефрита, неалкогольного стеа-тогепатита, атеросклероза, они также способны вызывать
серьезные инфекции - эндокардит, сепсис и менингит [1-5]. Кроме того, эти бактерии могут обмениваться генетическим материалом с другими микроорганизмами, разделяющими их среду обитания. Известно, что у S. mutans и других VGS растет устойчивость ко многим антибиотикам, включая макролиды и тетрациклины [6, 7].
Стрептококки приобретают устойчивость к макролидам тремя механизмами: 1) посттранскрипционной модификацией 23S субъединицы рРНК аденин^б-метил-трансферазами (кодируемые егт-геном);
МЕДИНА ЛЬ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
2) механизмом эффлюксного насоса, опосредованным геном mef A, что помогает создать низкую концентрацию внутриклеточного лекарственного средства;
3) рибосомными мутациями в ключевом сайте связывания с антибиотиками.
Наиболее распространенный способ обмена детерминантами резистентности среди близкородственных бактерий происходит через генетический перенос in vivo. В одном из исследований была показана сильная корреляционная связь между концентрацией антибиотиков в слюне и ростом уровня колонизации резистентных штаммов S. mutans [8]. И как следствие, S. pneumoniae или S. pyogenes и многие другие патогенные стрептококки становятся все более устойчивыми к макролидам.
Наконец, индукция устойчивости к макролидам также может непреднамеренно способствовать устойчивости к тетрациклину, так как их основные детерминанты резистентности - гены erm B и tet M, часто располагаются на одном и том же мобильном элементе. Таким образом, потенциальную роль S. mutans в качестве резервуара устойчивости к макролидам нельзя игнорировать.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: определение распространенности эритромицин- и тетрациклин-резистентных штаммов S. mutans, установление основного механизма приобретения резистентности.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Микробиологическому исследованию был подвергнут зубной налет детей 6-17 лет, полученный при профилактическом осмотре в 2016-2017 г. 80 детей.
Пробы зубного налета отбирались стерильными деревянными зубочистками, образцы сразу помещались в пробирки Eppendorf. Содержимым пробирки являлась транспортная среда - триптозно-соевый бульон объемом 200 мкл с 20% содержанием сахарозы и 10% глюкозы (либо THB, BHI), в который предварительно опускали диск с антибиотиком бацитрацином концентрацией 0,04 ед. в качестве селективного фактора. Пробы хранились при температуре 4°С и доставлялись в лабораторию в первые сутки после отбора.
Культивирование S. mutans осуществлялось при t=37°C на дифференциально-диагностических плотных питательных средах Mitis Salivarius agar в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов.
Чувствительность к эритромицину, клиндамицину и тетрациклину определялась диско-диффузионным методом коммерческими дисками, минимальные ингибирую-щие концентрации интерпретировались в соответствии с критериями NCCLS (США) [9].
Изоляты S. mutans были изучены на устойчивость к макролидам, был определен их фенотип методом «двойных дисков» на чашках Петри с Muller-Hinton агаром. Для
этого диски с эритромицином (15 мкг) и клиндамицином (2 мкг) были размещены на расстоянии 16 мм друг от друга. После инкубации отмечались два различных вида устойчивых фенотипов [10]. Устойчивость к клиндамицину и эритромицину интерпретировалась как конститутивный тип макролида - линкозамид стрептомицина (cMLSB). Восприимчивость к клиндамицину и резистентность к эритромицину без Д-зоны дифференцировался как фенотип М. Чувствительность к тетрациклинам также определялась диско-диффузионным методом с концентрацией диска 30 мкг.
Геномная ДНК выделялась с помощью набора химических реагентов для выделения ДНК из проб («ДНК-экспресс» производства НПФ «Литех», г. Москва) в соответствии с инструкциями производителя.
Наличие генов erm В и mef А определяли методом ПЦР-амплификации, используя ранее описанные специфичные праймеры (10-превалентность).
Амплификация выполнялась в термоциклере CFX-96 (BIO-RAD, США) с последующей электрофоретической оценкой результатов реакции. Каждый раз при постановке реакции совместно с образцами ставится положительный и отрицательный контроль с целью предотвратить получение ложных результатов.
Анализ ПЦР-продуктов осуществлялся методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской ДНК этидиумом бромида (10 MG/ML) производства «НеУхоп» (г. Москва) и визуализацией в УФ-лучах на трансиллюминаторе « UVT1» производства «Biokom». В качестве стандарта для оценки длины полученных ампликонов использовали маркер длин фрагментов с шагом в 100 пар нукле-отидов производства НПО «Сибэнзим» (8 мкл маркера на дорожку). Электрофорез осуществлялся при помощи источника питания для электрофореза нуклеиновых кислот в агарозных и акриламидных гелях «Эльф-4» и «Эльф-8». Параметры электрофореза: 180 В, 19,0 Вт, 180 мА в течение 25 минут.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате обследования было выделено 86 штаммов S. mutans. Из 86 тестируемых изолятов S. mutans у 11 (12,8%) был выявлен M-фенотип резистентности к макролидам, у 3 (3,5%) изолятов - cMLSB фенотип. Индуцибельный тип iMLSB выявлен не был. Остальные 72 (83,7%) штамма были восприимчивы к антибиотикам.
Количество фенотипически резистентных штаммов S. mutans к тетрациклину составило 23 изолята (26,7%).
Среди 14 резистентных к макролидам изолятов 11 (78,6%) имели mef A-ген. Один (33,3%) штамм с cMLSB-фенотипом был позитивен на erm B-ген. М-фенотип был доминирующим (78,6%) среди устойчивых к эритромицину штаммов. Другие исследования также показали,
МЕДИНА ЛЬ
что М-фенотип преобладает среди VGS из ротоглотки [11]. В нашем исследовании erm B-ген обнаруживался в изо-лятах с cMLSB фенотипом, также сообщают и другие исследователи [11, 12]. Ген mef A был обнаружен исключительно у штаммов с фенотипом М.
Доля изолятов S. mutans, фенотипически резистентных к эритромицину, составила более 16%, к тетрациклину -26,7%. Преобладающий молекулярно-генетический механизм резистентности к эритромицину - наличие mef A-гена (78,6% всех эритромицин-резистентных штаммов). 10,5% всех исследованных штаммов S. mutans являются потенциальным резервуаром генов антибиотикоре-зистентности (erm B и mef A) в горизонтальной передаче.
ВЫВОДЫ
1. Обнаружена высокая частота резистентности штаммов S. mutans к макролидам и тетрациклинам среди детей в Санкт-Петербурге.
2. Необходим мониторинг за резистентностью к антибиотикам как S. mutans, так и среди других видов стрептококков, в том числе и молекулярно-генетический. Это поможет координировать вектор терапевтической стратегии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bruckner L., Gigliotti F. Viridans group streptococcal infections among children with cancer and the importance of emerging antibiotic resistance. Semin. Pediatr. Infect. Dis. 2006. № 17. P. 153-160.
2. Balletto E., Mikulska M. Bacterial infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. Mediterr. J. Hematol. Infect. Dis. 2015. № 7. P. 101-109.
3. Douglas C. Identity of viridans streptococci isolated from cases of infective endocarditis. J. Med. Microbiol. 1993. № 39. P. 179-182.
4. Kennedy H.F., Gemmell C.G., Bagg J., Gibson B.E.S., Michie J.R. Antimicrobial susceptibility of blood culture isolates of viridans group streptococci: relationship to a change in empirical antibiotic therapy in febrile neutropenia. J. Antimicrob. Chemother. 2001. № 47. P. 693-696.
5. Luna V.A., Coates P., Eady E.A., Cove J.H., Nguyen T.T., Roberts M.C. A variety of gram-positive bacteria carry mobile mef genes. J. Antimicrob. Chemother. 1999. № 44. P. 19-25.
6. Gordon K.A., Beach M.L., Biedenbach D.J., Jones R.N., Rhomberg P.R., Mutnick A.H. Antimicrobial susceptibility patterns of hemolytic and viridans group streptococci: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997— 2000). Diag. Microbiol. Infect. Dis. 2002. № 43. P. 157-162.
7. Seppala H., Haanpera M., Al-Juhaish M., Jarvinen H., Jalava J., Huovinen J. Antimicrobial susceptibility patterns and macrolide resistance genes of viridans group streptococci from normal flora. J. Antimicrob. Chemother. 2003. № 52. P. 636-644.
8. Soriano F., Rodriguez-Cerrato V. Pharmacodynamic and kinetic basis for the selection of pneumococcal resistance in the upper respiratory tract. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2002. № 50. P. 51-58.
9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2003). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing — Thirteenth Informational Supplement M100-S13. NCCLS, Wayne, PA, USA.
10. Seppala H., Nissinen Yu.Q., Huovinen P.A. Three different phenotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes in Finland. J. Antimicrob. Chemother. 1993. № 32. P. 885-891.
11. Ioannidou S., Papaparaskevas J., Tassios P.T., Foustoukou M., Legakis N.J., Vatopoulus A. Prevalence and characterization of the mechanisms of macrolide, lincosamide and streptogramin resistance in viridans group streptococci. Int. J. Antimicrob. Agents. 2003. № 22. P. 626-629.
12. Seppala H., Skurnik M., Soini H., Roberts M.C., Huovinen P. A novel erythromycin resistance methylase gene (ermTR) in Streptococcus pyogenes. Antimicrob. Agents Chemother. 1998. № 42. P. 257-262.
