CC BY
53
УДК 575.322:611.814.1)-092.9
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ NO-ПОЗИТИВНЫХ НЕЙРОНОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ У ПОЙКИЛОТЕРМНЫХ ОРГАНИЗМОВ
В.И. Дунай, к.б.н.
Кафедра психофизиологии гуманитарного факультета УО «Белорусский государственный университет»
Целью данной работы явилось изучение распределения НАДФН-d/CNO-nosumueH^ix нервных клеток в головном мозге у рыб и земноводных, как представителей пойкилотермных организмов.
Установлено, что все изучаемые структуры головного мозга карпа и лягушки содержат НАДФН-д/СNO-позu-тивные нервные клетки. В продолговатом мозге у исследованных животных наблюдалось большее количество НАДФН-д/СNO-содержащuх нейронов по сравнению с другими изученными отделами мозга. Также установлено увеличение количества НАДФН-д/СNO-содержащuх нейронов в продолговатом мозге земноводных по сравнению с рыбами.
Ключевые слова: онтогенез, NO-синтеза, гипоталамус.
The aim of this research was to study the distribution ofNADFH-d/CNO -positive nervous cells of the brain in fish and amphibians as representatives of poikilothermal animals.
It has been established that all the studied structures of the brain of carp and frog have NADFH-d/CNO-positive nervous cells. A large amount of NADFH-d/CNO-containing neurons was observed in the medulla oblongata of the investigated animals as compared with the other studied parts of the brain. The increase of the number of NADFH-d/CNO-containing neurons in the medulla oblongata of amphibians as compared with fish has also been determined.
Key words: onthogenesis, NO-synthasa, hypothalamus.
Оксид азота (N0) в последнее время привлекает пристальное внимание биологов и медиков. N0 образуется в результате окисления аминокислоты аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты цитруллина под влиянием фермента Ш-синтазы (СШ) [1].
В настоящее время доказано участие N0 в регуляции различных физиологических функций [2, 3]. Имеются предположения о том, что N0 может являться одним из важнейших факторов, участвующих в развитии структуры и функции центральной нервной системы, являясь молекулой, вызывающей гибель определенных клеточных структур, а также играя важную роль в механизмах роста нервных окончаний и формирования синапсов [4]. Установлено, что N0-синтезирующие нейроны широко распространены в ЦНС млекопитающих [5]. В нервной системе N0 имеет большое значение как в нормальных физиологических условиях, так и при различной патологии. Нейроны, содержащие N0-синтазу, находятся во многих отделах ЦНС и большинстве изученных периферических ганглиев нервной системы. Большое количество таких нервных клеток содержат мозжечок, гиппо-камп и ряд других структур головного мозга [5]. Значение N0 в ЦНС в нормальных условиях связывают с тремя процессами (так называемая N0-гипотеза): 1) участие в межнейронной связи в качестве своеобразного нейромедиатора, причем, основное значение, как полагают, N0 имеет в синап-тической пластичности, под которой понимают эффективность синаптической передачи; 2) регу-
ляция церебрального кровотока и 3) установление межнейронных синаптических взаимосвязей во время развития нервной системы [6].
Таким образом, литературные данные свидетельствуют о том, что NO, выделяемый CNO-по-зитивными нервными клетками, участвует в становлении структуры и функции нервной системы в онтогенезе, а также у взрослого организма принимает участие в центральной регуляции большинства физиологических функций. Однако, несмотря на это, филогенез и онтогенез центральной NO-ергической системы остаются неизученными.
Целью данной работы явилось изучение распределения НАДФН-д/СNO-позитивных нервных клеток в головном мозге у рыб и земноводных, как представителей пойкилотермных организмов, что является важным для понимания филогенетических закономерностей в развитии центральной NO-ергической системы.
Материалы и методы исследования
В экспериментальной части работы использованы 20 взрослых особей карпа чешуйчатого (Cyprinus carpió) - представитель надкласса рыбы и 20 взрослых особей лягушки озерной (Rana ridibunda) - представитель класса земноводные.
У карпа и лягушки после извлечения головного мозга выделяли изучаемую структуру (продолговатый мозг, средний мозг, промежуточный мозг и передний мозг).
Специальными исследованиями было убедительно доказано, что нейронная синтаза NO (CNO) является никотинамидаденинди-нуклеотидфосфат-
Журнал ГрГМУ 2008 № 2
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
диафоразой [7]. Во-первых, локализация в центральной и периферической нервной системе НАДФН-д-содержащих нейронов, окрашенных ги-стохимически, соответствует локализации нервных клеток, содержащих CNO, окрашенных с применением методов иммуногистохимии. Во-вторых, CNO и НАДФН-д обнаруживают сходные имму-нохимические и биохимические свойства. В-третьих, НАДФН-д активность выявляется de novo у клеток с трансформированной кДНК к CNO. Использование гистохимической реакции на НАДФН-д для идентификации CNO-содержащих нейронов возможно только при условии, что исследуемая ткань проходит фиксацию в параформальдегиде. Установлено [7], что при фиксации с использованием параформальдегида инактивируются все НАДФН-зависимые ферменты-окислители, за исключением CNO. Таким образом, при условии фиксации ткани в параформальдегиде, использование гистохимической реакции на НАДФН-д для идентификации NO-синтезирующих нервных клеток является адекватным методом и широко используется в настоящее время.
В работе использован метод идентификации НАДФН-д-содержащих нейронов, разработанный Scherer-Singler [8], в модификации Hope и Vincent
[9].
У животных целиком извлекали головной мозг. Отделяли изучаемые структуры и дополнительно их фиксировали, согласно рекомендации Matsumo-to [10], 90 минут в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере (0.1M, pH7.4). Участки мозга шесть раз по 30 минут отмывали на холоде с использованием 0,1 М раствора Трис-НС1 (pH 8,0) и инкубировали в 10% и 25% растворах сахарозы на Трис-НС1 (0,1M, pH8,0) в течение 1,5 и 12 часов, соответственно.
Объекты помещали на охлажденные металлические блоки, которые ставили в криостат (-25oC) на 20 минут для замораживания. Из замороженной ткани готовили серийные срезы толщиной 25 мкм, которые наклеивали на предметные стекла, предварительно подвергшиеся хром-желатиновой обработке, и высушивали.
Срезы отмывали от сахарозы в 0,1 М растворе Трис-НС1 (pH 8.0) в течение 5 мин. Гистохимическая процедура заключалась в инкубации срезов в растворе 0,1 М Трис-HCI (рН 8,0), содержащем НАДФН (1 мМ), нитросиний тетразолий (0.5 мМ), Тритон X-100 (0,3 %) и дикумарол (0,1мМ) на протяжении 1-2 ч. при 22оС и относительной влажности 95-100%. По окончании гистохимической реакции срезы промывали в растворе Трис-НС1 в течение 5 минут, обезвоживали в этаноле, заключали в канадский бальзам и накрывали покровными стеклами.
Специфичность гистохимической реакции проверялась инкубацией нескольких срезов в растворах, не содержащих нитросиний тетразолий или НАДФН, а также в растворе, содержащем НАДФ вместо НАДФН. Химическая основа реакции заключается в образовании преципитата формазана при восстановлении солей тетразолия НАДФН-диафоразой (СКО) в присутствии НАДФН. Таким образом, гистохимическая реакция не должна наблюдаться в случае отсутствия в инкубационной среде любого из основных компонентов (нитросиний тетразолий, НАДФН), а также в случае использования НАДФ вместо НАДФН.
Результаты
При микроскопическом изучении срезов мозга, окрашенных на НАДФН-д/СКО, установлено, что все изучаемые структуры головного мозга карпа содержат НАДФН-д/СКО - позитивные нейроны.
При изучении продолговатого мозга, окрашенного на НАДФН-д/СКО, установлено, что НАДФН-д/СКО-позитивные нервные клетки имеют небольшие размеры 6-12 мкм, плотность их расположения - 48-64 в мм-2.
В среднем мозге карпа наблюдается увеличение размеров нервных клеток, содержащих НАДФН-д/СКО до 10-16 мкм. Однако плотность их расположения невелика - 12-20 в мм-2.
НАДФН-д/СКО - позитивные нервные клетки в переднем и заднем отделах гипоталамуса имеют размеры 6-10 мкм, плотность их расположения -22-34 в мм-2 (рисунок 1).
Рисунок 1 - НАДФН-д - позитивные нервные клетки в переднем отделе гипоталамуса карпа. Микрофото (х40)
НАДФН-д/СКО-позитивные нервные клетки у карпа обнаружены в переднем мозге, нейроны сла-боокрашенные, мелких размеров (4-6 мкм), с невысокой плотностью расположения (2-6 в мм-2).
Головной мозг лягушки также содержит НАДФН-д/СКО-позитивные нейроны во всех изучаемых структурах.
Установлено, что НАДФН-д/СКО-позитивные нервные клетки продолговатого мозга у лягушки
имеют размеры 10-16 мкм, плотность их расположения - 74-82 в мм-2.
В среднем мозге лягушки наблюдаются НАДФН-д/СКО-содержащие нейроны, размером 814 мкм. Плотность их расположения 18-26 в мм-2.
Передние и задние отделы гипоталамуса лягушки содержат слабоокрашенные НАДФН-д/СКО-позитивные нейроны мелких размеров 6-10 мкм, плотность их расположения - 40-48 в мм-2 (рисунок 2).
Рисунок 2 - НАДФН-д - позитивные нервные клетки в переднем отделе гипоталамуса лягушки. Микрофото (х40)
При изучении срезов переднего мозга лягушки, окрашенных на НАДФН-д/СКО, установлено наличие в них НАДФН-д/СКО-позитивных нейронов, с размерами от 6 до 12 мкм. Плотность расположения от 4 до 12 в мм-2.
Таким образом, установлено, что все изучаемые структуры головного мозга карпа и лягушки содержат НАДФН-д/СКО-позитивные нервные клетки. В продолговатом мозге у исследованных животных наблюдалось большее количество НАДФН-д/СКО-содержащих нейронов по сравнению с другими изученными отделами мозга. Также установлено увеличение количества НАДФН-д/СКО-содержа-щих нейронов в продолговатом мозге земноводных по сравнению с рыбами.
Обсуждение результатов
Предпосылкой к постановке задач настоящего исследования служили развиваемые представления о том, что N0, синтезируемый нервными клетками, может участвовать в развитии структуры и функции ЦНС, являясь эффекторной молекулой, вызывающей гибель определенных клеточных структур, а также играя важную роль в механизмах роста нервных окончаний и формирования синапти-ческих контактов. Процесс эволюции сопровождается усложнением организации нервной системы.
Для понимания филогенеза центральной NO-ерги-ческой системы представляло интерес изучить распределение НАДФН-д/СNO-позитивных нервных клеток в головном мозге у рыб и земноводных, как организмов, сохранивших тесную связь с водной средой.
Установлено, что в продолговатом мозге у исследованных животных наблюдалось большее количество НАДФН-д/СNO-содержащих нейронов по сравнению с другими изученными отделами мозга. Также установлено увеличение количества НАДФН-д/СNO-содержащих нейронов в продолговатом мозге земноводных по сравнению с рыбами. Учитывая, что NO является одним из важнейших факторов, обеспечивающих развитие нервной системы, можно предположить, что увеличение количества НАДФН-д/СNO-содержащих нейронов в продолговатом мозге коррелирует с морфо-фун-кциональным усложнением продолговатого мозга земноводных по сравнению с рыбами, что также связано с изменениями в дыхательной и сердечнососудистой системах и, как следствием, с выходом на сушу предков современных земноводных.
Литература
1. Реутов, В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих / В.П. Реутов // Успехи биол. химии. - 1995. - Т. 35. - С. 189-228.
2. Amir, S. NG-Monomethyl-L-arginine co-injection attenuates the thermogenic and hyperthermic effects of E2 prostaglandin microinjection into the anterior hypothalamic preoptic area in rats / S. Amir, E. De Blasio, A. M. English // Brain Res. - 1991. - Vol. 556. - P. 157-160.
3. Dunai, V. I. Effect of the NO synthase inhibitor, L-NAME, on body temperature in birds in different periods of postnatal ontogenesis / V. I. Dunai, A. V. Gourine // Recent advances in thermal biology. Edited by V. N. Gourine. - Minsk.-1999. - P.18-19.
4. Gourine, A. V. Role of nitric oxide in lipopolysaccharide-induced fever in conscious rabbits / A. V. Gourine // J.Physiol. - 1994. - Vol. 475.
- P. 28.
5. Dawson, T. M. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues / T. M. Dawson, P. M. Hwang, S. H. Snyder // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1991. - Vol. 88, N.17. - P. 7797-7801.
6. Сосунов, А. А. Оксид азота как межклеточный посредник / А. А. Сосунов // Соросовский Образовательный Журнал. - 2000. - № 12. - С. 27-32.
7. Pasqualotto, B. A. Citrulline in the rat brain - immunohistochemistry and coexistence with NADPH-diapho-rase / B. A. Pasqualotto, B. T. Hope, S. R. Vincent // Neurosci. Lett. - 1991. - Vol. 128, N.2. - P. 155-160.
8. Demonstration of a unique population of neurons with NADPH-diaphorase histochemistry / U. Scherer-Singler [et al.] // J .Neurosci. Methods. - 1983. - Vol. 9, N. 3. - P. 229-234.
9. Hope, B. T. Histochemical characterization of neuronal NADPH-diaphorase / B. T. Hope, S.R. Vincent // J. Histochem. Cytochem. - 1989.
- Vol. 37. - P. 653-661.
10. Matsumoto, T. A correlation between soluble brain nitric oxide synthase and NADPH-diaphorase activity is nly seen after exposure of the tissue to fixative / T. Matsumoto, J. E. Kuk, U. Forstermann // Neurosci. Lett. - 1993. - Vol. 155, N.1. - P. 61-64.
Поступила 27.08.07
