CC BY
159УДК578.5
DOI: 10.24411/0023-4885-2020-10608
РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА CARNIVORE AMDOPARVOVIRUS БЕЗ ЭКСТРАКЦИИ ДНК
Диагностика алеутской болезни норок
Е.С. Колесник1, Г.Ю. Косовский1, В.И.Глазко1'2
1Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева» 140143, Московская область, Раменский район, пос. Родники, ул. Трудовая, 6
e-mail: niipzk@mail.ru
2Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева
127550, Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49 e-mail:vigvalery@gmail.com
На базе ФГБНУ НИИПЗК разработан метод ранней диагностики алеутской болезни норок, не включающий этап экстрагирования ДНК и позволяющий выявлять вирус алеутской болезни в крови норок на разных стадиях заболевания. Разработанный метод отличается высокой точностью и позволяет выявлять наличие AMDV в цельной крови норок при низкой концентрации патогена в биопробах, в отличие от классического ПЦР-анализа. Эффективность метода подтверждается совпадением результатов оценки присутствия/отсутствия патогена в биопробах путем использования подобранных к различным участкам генома AMDV трех пар праймеров и совпадения полученных результатов у каждой особи, то есть трехкратной повторностью результатов тестирования. Эффективность работы праймеров доказана не только выполненной трехкратной повторностью, но и совпадением полученных результатов с данными об инфициро-ванности исследованных норок, полученными при использовании других методов, общепринятых для диагностики AMDV в Российской Федерации, а также с применением контрольных проб. Новый разработанный метод позволяет исключить ложноотрицательные результаты при латентном течении болезни, что дает возможность исключить зараженных норок, но без клинических признаков болезни, из поголовья.
Ключевые слова: алеутская болезнь норок, полимеразная цепная реакция, диагностика, вирус алеутской болезни норок.
Сокращения: АБН - алеутская болезнь норок; AMDV - вирус алеутской болезни норок; РИОЭФ -иммуноэлектроосмофорез; ИФА -иммуноферментный анализ; тпн - тысяч пар нуклеотидов.
На сегодняшний день серьезной угрозой здоровью норок является алеутская болезнь, вызываемая парвовирусом Carnivore amdoparvovi-rus рода Amdovirus. Алеутская болезнь первоначально наблюдалась в США в конце 1940-х годов у алеутской норки (разновидность серо-коричневого цвета, похожая по цвету на алеутских лисиц). Данное заболевание относится к плазмо-цитозам, поскольку при нем обнаруживается большое количество плазматических клеток в тканях или экссудатах [1]. Классическая форма данной болезни встречается у взрослых норок и характеризуется гипергаммаглобулинемией, вызывающей гломерулонефрит, приводящей к острой почечной недостаточности, артриту и снижению репродуктивной функции [2]. Острая
форма заболевания, как правило, характеризуется летальной интерстициальной пневмонией у щенков норок. Эффективного лечения и вакцины против алеутской болезни норок не существует.
Алеутская болезнь может протекать временно бессимптомно, но течение заболевания в основном определяется вирулентностью вирусного штамма. Известные штаммы имеют различную патогенность, от непатогенного штамма AMDV G, низко вирулентного штамма SL-3, выделенного в Германии, штамма Пуллмана, который является летальным для алеутской разновидности норки, и высоко смертельного штамма Юты. Алеутской болезни подвержены американская норка (Neovison vison), европейский хорек (Mustela putorius), европейская куница (Martes
Рисунок 1.Структура генома вируса AMDV Figure 1.Genomestructureof AMDV
martes), обыкновенная генета (Genetta genetta), енотовидная собака (Nyctereutes procyonoides) и скунс (Mephitis mephitis), которые могут являться переносчикамизаболевания [3].
Геном вируса состоит из одиночной цепи ДНК длиной до 4,8 тпн, содержащей информацию о трех неструктурных белках (NS1, NS2 и NS3) и двух структурных (VP1 и VP2) (рис.1). Неструктурные белки обслуживают экспрессию вирусного материала, в то время как структурные определяют антигенные свойства. Было показано, что ингибиторы каспаз у взрослых норок могут ограничить размножение вируса, поскольку каспазы участвуют в регуляции репликации NS1 вируса. Особое значение представляет собой белок VP2, содержащий участок с высоким полиморфизмом аминокислот, комбинация которых специфична для определенных штаммов. Высокий полиморфизм этого участка обусловлен его участием в формировании и локализацией в третичной структуре капсидных белков и позволяет дифференцировать штаммы.
Эпизоотологический контроль заболевания осуществляется на основании анализа эпизоо-тологических, клинических данных, результатов патологоанатомических и цитоморфологических анализов, результатов лабораторных исследований сыворотки крови зверей с помощью йодной пробы по методу Меллони и реакции иммуно-электроосмофореза (РИОЭФ), иммунофермент-ного анализа (ИФА). Животных с подтвержденным диагнозом выбраковывают.
Необходимо отметить, что на определенной стадии течения болезни уровень специфических антител к белкам вируса крайне низок, поэтому используемые в диагностике методы ИФА нередко дают ложноотрицательные результаты.
Тем не менее, наблюдается регулярное ре-инфицирование ферм, несмотря на значительные усилия по искоренению болезни. Происходит это
в силу устойчивости вирусных частиц к физическим и химическим агентам, быстрого распространения вируса насекомыми и человеком [4].
С помощью методов ПЦР, для проведения которых требуется этап выделения ДНК, невозможно выявить вирус при хроническом течении алеутской болезни норок, так как у таких животных репликация вируса не происходит и количество ДНК патогена в биопробах очень низко.
ПЦР, как правило, не используется в хозяйствах для обследования основного стада зверей в связи с высокой стоимостью анализа, которая частично обусловлена необходимостью выделения ДНК из крови животных. Методики выделения ДНК предполагают использование коммерческих наборов, не всегда отвечающих стандартам качества, что приводит к неполному устранению некоторых ингибиторов и, следовательно, к потере ДНК, при этом вероятность перекрестного заражения образцов повышается.
Метод ПЦР-диагностики алеутской болезни норок без выделения ДНК позволит предотвратить потерю вирусной ДНК, неизбежную на этапе экстрагирования, и обнаружить инфекцию на ранних стадиях заражения и при хроническом течении болезни, когда концентрация вируса в крови крайне мала.
Новизна исследований заключается в том, что впервые разработан ДНК-тест и экспериментально доказана его эффективность по выявлению норок, инфицированных ДНК-вирусом -возбудителем алеутской болезни. Впервые подобрана новая ДНК-полимераза, лишенная сайта связывания с альбумином, ингибирующим ее активность, что позволяет проводить полимераз-ную цепную реакцию на небольших геномах патогена без выделения матричной ДНК хозяина. Выделение ДНК патогена совместно с ДНК генома хозяина часто сопровождается потерей коротких геномов патогена и высокой частотой ложноотрицательных результатов.
Материалы и методы исследований
Исследования проведены в лаборатории ге-номики отдела биотехнологии ФГБНУ НИ-ИПЗК, объектом исследования является американская норка (Neovison vison). Забор образцов крови осуществлялся отсечением когтя в пробирки с ЭДТА в количестве 1-2 мл.
Подобрана рекомбинантная термостабильная ДНК-полимераза, позволяющая выполнять процедуру амплификации участков геномной ДНК патогена с небольшими геномами, без выделения матричной ДНК биообразца, увеличивающего вероятность потери коротких геномов у патогена.
Белки крови, такие как альбумин, являются ингибиторами ДНК-полимераз, в связи с чем подобрана рекомбинантная ДНК-полимераза, в районе N-конца которой содержится меньшее количество аминокислот, а глутаминовая кислота замещена лизином в кодоне 708, который обеспечивает устойчивость к нескольким типам ингибиторов ПЦР, и, соответственно, увеличение выхода целевой ДНК из образцов цельной крови, плазмы и сыворотки не менее чем на 25%.
Дизайн праймеров проводился с использованием программного обеспечения Primer BLAST. Таким образом, были выявлены две консервативные последовательности и одна последовательность участка неструктурного гена, которые являются наиболее информативными при анализе продукции спектров амплификации: RP2 (For-ward:TCTAGAAGCAACGCTTGGGGTGTATG, Reverse: GTTGTGTCACTCCACTGTCT), RP3 (Forward: TCTAGATTGGGCCTACCTCCTCTCTG, Reverse: ATACAGGACCAACGTTGTCT), NS(For-ward: TTGGTTGCTTTACTCC, Reverse: TCTACTTTTACATCACCAC). Исследованы 50 образцов крови американской норки из 3 хозяйств Российской Федерации. Каждая проба крови исследовалась трижды. Экстрагирование ДНК проводилось с использованием коммерческого набора «М-Сорб» согласно рекомендациям производителя. Амплификация ПЦР-смеси с выделенной ДНК проводили с использованием PFU-полиме-разы 5ед./мкл (Силекс) и ПЦР-смесью общим объемом 25мкл (Синтол). Программа амплификации включала этапы: первичная денатурации 95°С 2 мин (1 цикл), денатурация 94° С 15 сек (40 циклов), отжиг 55° С 15 сек, элонгация 72° С 2 мин.
Амплификация ПЦР смеси с цельной кровью с ПЦР-смесью общим объемом 25мкл (Син-тол) и рекомбинантной полимеразы: Цел. кровь
- 2,5мкл и Ро1.гес- 0,25мкл.
Программа амплификации включала этапы:1 цикл - первичная денатурации 95°С 5 мин, 40 циклов - денатурация 94°С 30 сек, отжиг 55°С 1мин, элонгация 68° С 30 сек, 1 цикл - финальная элонгация 68°С 2 мин.
В качестве отрицательного контроля в обоих экспериментах использовались ампли-коны, полученные в результате амплификации ПЦР-смеси:
- с ДНК или цельной кровью кролика;
- без добавления образца ДНК или цельной крови.
В качестве положительного контроля использовались образцы ДНК и цельной крови норок, впоследствии павших от алеутской болезни.
Фракционирование продуктов амплификации проводилось в 1,5% агарозном геле при постоянном напряжении 135В 100-120 минут с использованием системы фото-гель документации.
1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3
_
Î-
Рисунок 2. Электрофореграмма амплико-нов, полученных в результате ПЦР с ДНК из крови норок с применением PFU-полимеразы, где в номере дорожки первая цифра означает номер образца крови животного, а вторая - номер праймера (праймер №1 RP2, №2 -RP3, №3 - NS). Первые две дорожки - маркер молекулярных масс
Figure 2. Electropherogram of amplicons obtained as a result of PCR with DNA from mink blood using PFU polymerase, where the first digit denotes the animal blood sample number, and the second denotes the primer number (primer no. 1 RP2, no. 2 -RP3, no. 3 - NS). The first two lanes are molecular weight markers
Результаты исследований
ПЦР с использованием PFU-полимеразы с выделением ДНК из биопроб норок со всеми тремя парами праймеров к различным участкам генома патогена AMDV не привела к получению продуктов амплификации и, таким образом, свидетельствовала об отсутствии патогена в анализируемом материале (рис.2). В то же время, в биообразцах тех же норок при использовании методов прямой амплификации без выделения ДНК с применением рекомбинантной полиме-разы обнаруживались соответствующие фрагменты генома патогена одновременно в продуктах амплификации, полученных с использованием в ПЦР каждого из трех праймеров, которые отсутствовали в контрольных образцах (рис.3-4).
Из 50 норок, у которых были взяты биопробы, 10 животных ранее иными методами были идентифицированы как свободные от инфекции AMDV, 19 - как носители, 21 животное не тестировались. Образцы условно отрицательных норок по AMDV доставлены из одного хо-
зяйства, 15 условно положительных - из второго, и 21 образец неисследованных - из третьего.
По результатам анализа электрофореграмм продуктов амплификации ПЦР, проводимой без выделения суммарной ДНК с использованием трех пар праймеров к участкам генома патогена AMDV, получено подтверждение, что 10 условно отрицательных образцов не продуцируют продукты амплификации с использованием всех трех праймеров к геному патогена, в 19 условно положительных образцах подтверждается наличие продуктов амплификации, в 21 образцах крови ранее неисследованных норок также обнаруживаются продукты амплификации геномной ДНК AMDV при использовании в ПЦР всех трех пар праймеров (рис.3, 4).
Заключение
Таким образом, на базе ФГБНУ НИИПЗК разработан метод ранней диагностики алеутской болезни норок, не включающий этап экстрагирования ДНК и позволяющий выявлять вирус алеутской болезни в крови норок на раз-
Рисунок 3. Электрофореграмма ампликонов, полученных в результате ПЦР с рекомбинантной полимеразой без выделения ДНК. В образцах 1.1-4.3 в номере дорожки первая цифра означает номер образца крови животного. Образцы 01.1-01.3 - отрицательный контроль (кровь кролика), 02.1-02.3
- отрицательный контроль (без содержания образца крови в ПЦР-смеси). Вторая цифра в номере дорожки означает номер праймера (№1 - RP2, №2 -RP3, №3 -NS)
Figure 3. Electropherogram of amplicons obtained by PCR with recombinant polymerase without DNA isolation. In samples 1.1-4.3 in the lane number, the first digit is the animal's blood sample number. Samples 01.1-01.3 - negative control (rabbit blood), 02.1-02.3 - negative control (without the content of the blood sample in the PCR mixture). The second digit in the lane number means the primer number (# 1
- RP2, # 2 -RP3, # 3 - NS)
Рисунок 4. Электрофореграмма ампликонов, полученных в результате ПЦР с рекомбинантной полимеразой без выделения ДНК с использованием трех пар праймеров к участкам генома AMDV, в образцах норок условно свободных от инфекции. Первая дорожка - маркер молекулярных масс.
Figure 4. Electropherogram of amplicons obtained as a result of PCR with recombinant polymerase without DNA isolation using three pairs of primers to regions of the AMDV genome in mink samples conditionally free from infection. The first track is a molecular weight marker.
ных стадиях заболевания. Разработанный метод отличается высокой точностью и позволяет выявить наличие AMDV в цельной крови норок, в отличие от классического ПЦР-анализа, что подтверждается экспериментом, выполненным в трех повторностях, а также тем, что разработанный метод включает использование трех пар праймеров, что исключает ошибку ПЦР и возможность гомологии полученных в ходе реакции фрагментов ДНК с геномом норки. На сегодняшний день отсутствуют данные о российских разработках, позволяющих проводить ПЦР без выделения ДНК для диагностики инфицирования биообразцов патогенами с короткими геномами около 4,8 тысяч пар нуклеотидов. Новый разработанный метод при условии некоторых модификаций может быть использован для диагностики других ДНК-содержащих вирусов, в том числе, тех, которые обладают крайне малой длиной.
Список литературы:
1. Canuti M, Whitney HG, Lang AS. Amdoparvovi-ruses in small mammals: expanding our understanding of parvovirus diversity, distribution, and pathology. // Front Microbiol. 2015. V.6. Article 1119. P. 1-9.
2. Prieto A, Díaz-Cao JM, Fernández-Antonio R, Panadero R, López-Lorenzo G, Díaz P, Pérez-Creo A, Morrondo MP, Fernández G. Lesser housefly (Fannia canicularis) as possible mechanical vector for Aleutian mink disease virus. // Vet Microbiol. 2018. V. 221. P. 90-93.
3. Canuti M, Todd M, Monteiro P, Van Osch K, Weir R, Schwantje H, Britton AP, Lang AS. Ecology and Infection Dynamics of Multi-Host Amdopar-voviral and Protoparvoviral Carnivore Pathogens. Pathogens. 2020 Feb 15;9(2):124. doi: 10.3390/pathogens9020124. PMID: 32075256; PMCID: PMC7168296.
4. Zalewski A, Virtanen JME, Brzezinski M, Kolodziej-Sobocinska M, Jankow W, Sironen T. Aleutian mink disease: spatio-temporal variation of prevalence and influence on the feral American mink. TransboundEmerg Dis. 2020 Nov 16. doi: 10.1111/tbed.13928. Epub ahead of print. PMID: 33197283.
EARLY DIAGNOSTICS CARNIVORE AMDOPARVOVIRUS WITHOUT DNA EXTRACTION
Diagnosis of Aleutian mink disease without DNA extraction E.S.Kolesnik1, G.Yu. Kosovsky1, V.I. Glazko12
1Afanas'ev Research Institute of Fur-Bearing Animal Breeding and Rabbit Breeding.
Russia, 140143, Moscow province, Ramenskii region, pos. Rodniky, ul. Trudovaya, 6
e-mail:niipzk@mail.ru
2Timiryazev Russian State Agrarian University Russia Moscow Agrarian Academy,
49, ul. Timiryazevskaya, Moscow, 127550
e-mail: vigvalery@gmail.com
A method for early diagnosis of Aleutian disease in minks, without the stage of DNA extraction, has been developed, which makes it possible to diagnose the Aleutian disease virus in the blood of minks at different stages of the disease. This method is highly accurate and allows detecting the presence of AMDV in whole blood of minks at a low concentration of the pathogen, in contrast to classical PCR. The effectiveness of the method is confirmed by the coincidence of the results of assessing the presence / absence of the pathogen using three pairs of primers matched to different parts of the AMDV genome and the coincidence of the results obtained in each individual, that is, threefold repetition of the test results. The efficiency of the primers was proved by the coincidence of the results obtained with the data on the infection of the investigated minks obtained using other methods generally accepted for the diagnosis of AMDV in the Russian Federation. The new method makes it possible to exclude false negative results in the latent course of the disease, which makes it possible to cull infected minks, but without clinical signs of the disease, from the herd.
Key words:Aleutian mink disease, polymerase chain reaction, diagnostics, Aleutian mink disease virus.
Г.Ю. Косовский: SPIN-код: 3736-3480; AuthorlD: 353097; ORCID: 0000-0003-3808-3086; Research-erlD: ABG-7304-2020; ScopusID: 57196461206
Е.С. Колесник: SPIN-код: 3533-3806; AuthorlD: 1050062; ORCID: 0000-0002-2465-7184; ScopusID: 57219537696
В.И. Глазко: SPIN-код: 1556-3661; AuthorID: 297850; ORCID: 0000-0002-8566-8717; ResearcherID: Q-3017-2019, L-3116-2017; ScopusID: 7003981461
68 E.S.Kolesnik,G.Yu.Kosovsky, V.I.Glazko
