CC BY
28©М.В. Пучинская, 2016 Вопросы онкологии, 2016. Том 62, № 1
УДК 616-006;61:575;611:013.8
М. В. Пучинская
Раковые стволовые клетки как возможный источник возникновения и прогрессирования опухолей
уО «Белорусский государственный медицинский университет», Минск, республика Беларусь
Приводятся основные сведения о раковых стволовых клетках (РСК) - субпопуляции опухолевых клеток, обладающих свойствами стволовых (прежде всего самоподдержанием и способностью дифференцировки в клетки с различным фенотипом) и являющихся возможным источником возникновения, прогрессирования и метастазирования опухолей. Обсуждаются свойства РСК, их источники, взаимоотношения с микроокружением, основные сигнальные пути и регуляторные факторы, определяющие их поведение, а также некоторые противоречия во взглядах на раковые стволовые клетки.
Ключевые слова: стволовые клетки, раковые стволовые клетки, самоподдержание, ниша, ксенотрансплантация
В развитых странах мира злокачественные новообразования являются одной из ведущих причин смерти взрослого населения. Несмотря на многочисленные исследования биологии опухолей, причины и механизмы их развития еще далеки от понимания. Вероятно, нужны новые гипотезы и теории опухолевого роста, способные впоследствии изменить подходы к лечению. Одной из них является активно развивающаяся в настоящее время теория раковых стволовых клеток (РСК). Исследование происхождения РСК, их роли в канцерогенезе, значения в диагностике и как потенциальной мишени для терапевтических воздействий является одним из основных направлений в современной фундаментальной и клинической онкологии.
История представлений о лейкозных и раковых стволовых клетках
Истоки теории РСК можно найти еще в работах патологов 19-го века, которые заметили сходство опухолей и эмбриональных тканей и предположили их происхождение из клеток, подобных эмбриональным [8,47]. Позже Cohnheim и Durante сформулировали теорию возникновения опухолей из эмбриональных зачатков [47]. В 1963 г. W. R. Bruce et al. отметили, что лишь небольшое число клеток лимфомы могут дать начало опухоли в селезенке мышей [9]. В 1977 г.
A. W. Hamburger и S. E. Salmon наблюдали небольшую группу клеток с характеристиками стволовых в некоторых опухолях [18]. В тера-токарциноме, мелкоклеточном раке легкого, раке молочной железы была показана возможность функционирования генетических программ, ответственных за нормальную организацию тканей при развитии [33]. Тем не менее, начало изучения собственно стволовых клеток опухолей связывают с описанием D.Bonnet и J. E. Dick в 1997 г. лейкозных стволовых клеток при остром миелоидном лейкозе [4]. Позже опухоль-ини-циирующие клетки были открыты в солидных опухолях, в том числе в раке молочной железы, головного мозга, кишечника, желудка, печени, поджелудочной железы, простаты, почки, мочевого пузыря, легкого, яичников, эндометрия, головы и шеи, кожи, щитовидной железы, мелано-ме, мезенхимальных опухолях [5,9,16,20,40,54].
На конференции Американской Ассоциации исследования рака (AACR), посвященной РСК, в 2006 г. было дано следующее определение: РСК - это клетка в пределах опухоли, обладающая способностью к самоподдержанию и формированию гетерогенных линий опухолевых клеток, составляющих опухоль [11].
В зарубежной литературе кроме термина РСК (cancer stem cells) используются также термины «раковые клетки, подобные стволовым» (cancer stem-like cells), что подчеркивает их возможные отличия от нормальных тканевых стволовых клеток (СК), «клетки, инициирующие опухоль» (tumor-initiating cells) и «клетки, поддерживающие опухоль» (tumor-propagating cells), что подчеркивает их способность формировать опухоль и поддерживать ее рост. Хотя некоторые авторы отмечают различия этих терминов (к примеру, точно не доказано, что РСК обладают всеми свойствами нормальных СК, поэтому рекомендуется избегать этого термина [25,48]) или преимущества одного из них перед другими, часто они используются как синонимы.
сходство рсК и нормальных стволовых клеток
СК существуют в человеческом организме и в норме. В ранние сроки развития они обеспечи-
вают формирование органов и тканей эмбриона (эмбриональные СК), во взрослом организме -поддержание нормального клеточного состава тканей и репарацию при повреждении (соматические СК, существующие в большинстве органов) [53]. РСК имеют многие характеристики, сходные с таковыми нормальных тканевых СК, в том числе способность к самоподдержанию и дифференцировке в клетки с различным фенотипом, отсутствие маркеров дифференцировки, повышенный пролиферативный потенциал in vivo и in vitro, существование в особом микроокружении («нише»), в хорошо питаемых и защищенных участках тканей, редкое вхождение в клеточный цикл и длительное сохранение в эксперименте специальных меток [42]. Частично совпадают маркеры СК опухолей и нормальных тканей (при лейкозах [4], раке молочной железы, опухолях мозга, раке предстательной железы), молекулярные механизмы и условия микроокружения, регулирующие их поведение [13,53]. В некоторых органах опухоли чаще развиваются в зоне локализации СК, к примеру, эпителиальная карцинома роговицы в зоне лимба [42]. Ряд генов, используемых в эксперименте для репро-граммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные стволовые (iPS) клетки (Nanog, Sox2, Oct4), являются онкогенами или связаны с трансформацией клеток [14]. Имеются, однако, и различия между нормальными СК и РСК. Так, истинная мультипотентность рСК и способность их к асимметричному делению в большинстве опухолей требуют доказательства [48]. Поиск характеристик, отличающих РСК от нормальных СК, критичен для разработки эффективной направленной на РСК (анти-РСК) терапии.
Признаки и свойства РСК
Клетки опухоли гетерогенны и значительно отличаются друг от друга по своей морфологии, иммунофенотипу и функциональным характеристикам, однако механизмы формирования опухолевой гетерогенности могут быть различны. Ранее основным представлением о возникновении опухоли была так называемая модель клональной эволюции, полагавшая, что все опухолевые клетки участвуют в поддержании опухоли, а их гетерогенность является результатом генетических и эпигенетических нарушений, возникающих в процессе ее развития [9]. При этом считалось, что опухоль возникает из дифференцированных клеток в результате возникновения в них мутаций. Теория РСК, напротив, предполагает, что основную роль в возникновении, поддержании и метастазировании опухолей играет небольшая популяция РСК, имеющих много общего с нормальными СК, а сама опухоль является ие-
рархично организованной структурой наподобие нормальных тканей, причем б0льшая часть клеток опухоли не способна к ее поддержанию, а является результатом разнонаправленной диффе-ренцировки клеток, происходящих из РСК. Она позволяет объяснить клональное происхождение и гетерогенность опухолей, пластичность опухолевых клеток, влияние стромального микроокружения на поведение опухолей [42].
одним из аргументов в пользу существования рСК служит длительный период между инициацией и промоцией ряда опухолей [47]. Не исключается возможность комбинации двух теорий, например, что рСК могут изменяться с течением времени вследствие накопления генетических изменений и давать начало различным субклонам, ответственным за развитие первичной опухоли и ее последующих рецидивов и метастазов [9, 16]. В ряде работ показано наличие генетического разнообразия между рСК в одной опухоли, эволюционная связь таких РСК и возможность развития рецидива из ранее существовавших субклонов РСК [33]. Иногда выделяют преРСК как раннюю стадию развития РСК, что также подтверждает возможность их клональной эволюции [19]. Кроме того, понятие сети РСК пытается объединить теории РСК и ракового поля [6].
Ряд авторов полагают, что только РСК могут эффективно формировать отдаленные метастазы (метастатические РСК (мРСК)), так как они способны инициировать и поддерживать рост нового очага и его гетерогенность, а большая пластичность и генетическая нестабильность помогают выживать в новых условиях [36, 37]. они могут сохранять покоящееся состояние в метастатическом очаге, подобно нормальным СК, до поступления активирующих сигналов; в них возможны изменения генотипа, влияющие на чувствительность к терапии по сравнению с первичной опухолью [37]. В пользу существования мРСК свидетельствуют регуляция миграции нормальных СК и метастазирования сходными молекулами и сигнальными путями [37], наличие фенотипа РСК у диссеминированных в костном мозге и циркулирующих опухолевых клеток у пациентов с раком молочной железы [20, 27], прогностическое значение экспрессии маркеров РСК в отношении появления метастазов [18]. Остается неясным, способны ли все РСК в одинаковой степени давать метастазы разных локализаций [37].
РСК присутствуют не только в опухолях in vivo, но и в клеточных линиях опухолей различной локализации. При этом в них нет контаминации нормальными тканевыми СК, которые могут быть в опухоли [30]. Отмечается, что РСК в культурах клеток, в отличие от опухоли, долж-
Таблица 1.
Основные свойства РСК и исследования, проводимые для определения РСК
Свойства рСК Метод определения Краткая характеристика метода
Самоподдержание Формирование сфер (маммо-, проста-, нейро-, саркосфер) Посев клеток в жидкую среду и их деление с образованием сферических колоний клеток
Формирование вторичных сфер Первичные сферы диссоциируют до отдельных клеток и из них выращивают новые сферы
Плюрипотентность дифференцировка во все типы клеток опухоли In vitro или in vivo выращивается культура клеток из рСК или клеток сфер, морфологически или с помощью антител доказывается существование в ней клеток различного иммунофено-типа (люминальный/базальный/миоэпителиальный и т.д.), в т.ч. отличных или противоположных фенотипу исходных рСК
дифференцировка во вторичные структуры Формирование гистоархи-тектоники, характерной для ткани или опухоли Посев клеток на Матригель или ксенотранслантация мышам с образованием структур, характерных для органа (ветвление протоков, формирование ацинусов и т.д.), в т.ч. с последующей иммуноморфологией и подтверждением существования разных типов клеток
Туморогенность рост в мягком агаре Посев клеток в мягкий агар и их рост при слабой связи с матрицей (суррогатный in vitro маркер туморигенности)
Способность дать рост новой опухоли in vivo Ксенотрансплантация рСК иммуно-дефицитным мышам Введение рСК в организм иммунодефицитных мышей с последующим развитием у них опухолей, морфологически сходных с изначальной (при получении рСК из первичных культур)
неограниченный пролифе-ративный потенциал длительное серийное культивирование Повторяющиеся пассажи клеток отдельных колоний, полученных из рСК
Экспрессия маркеров СК иммуногистохимия, иммуноф-люоресцен-ция, блоттинг, ПЦр определение экспрессии генов, рнК или белков, характерных для нормальных СК
наличие мутаций и других нарушений, характерных для опухоли определение мутаций, реаранжировок генов, эпигенетических изменений, характерных для клеток данной опухоли
относительно небольшое и стабильное число в опухоли Эксперименты с ограниченным разведением и серийной трансплантацией Введение мышам рСК в уменьшающихся концентрациях, определение минимальной, способной дать опухоль, с вычислением содержания рСК
редкое вхождение в клеточный цикл и редкое деление накопление BrdU Бромодеоксиуридин накапливается в ядрах клеток, концентрация его уменьшается при их делении; в рСК отмечено высокое содержание BrdU, что свидетельствует об их редком делении
Повышенная устойчивость к стандартной противоопухолевой терапии Прямое определение устойчивости клеток определение доз препаратов или облучения, приводящих к гибели клеток
оценка экспрессии белков, выводящих токсические вещества из клетки иммуноморфологическая оценка экспрессии АВС-транспортеров; образование «побочной популяции» при введении флюорохрома Hoechst 33342 с низким его уровнем
необходимость особого микроокружения (ниши) определение преимущественной локализации рСК in vivo Визуализация нахождения рСК в периваскулярных или гипокси-ческих нишах
ны достаточно часто делиться для поддержания клеточной массы, то есть для них не характерно редкое вхождение в клеточный цикл.
Во многих работах по выделению РСК из опухолей или оценке отдельных молекул как маркеров РСК используется довольно стереотипный набор исследований, позволяющий охарактеризовать основные свойства РСК (табл. 1).
При этом подчеркивается, что даже комплекс описанных методов позволяет лишь обогатить некоторую клеточную популяцию РСК, но не выделить их в чистом виде. Даже в популяциях не-РСК после сортировки встречаются немногочисленные клетки со свойствами РСК [24]. Чистая культура РСК до настоящего времени не получена, что затрудняет изучение их свойств.
Возможные механизмы образования РСК
Существует два основных представления о происхождении РСК. Согласно первому, они являются потомками нормальных СК, в которых появляются мутации и другие изменения, способствующие их превращению в раковые,
то есть предполагается, что мутации, ведущие к возникновению опухоли, возникают не в дифференцированных клетках, а в стволовых. Такая гипотеза высказывалась еще в одной из наиболее ранних работ по лейкозным СК [4]. В пользу этого свидетельствует то, что в ряде органов, например, в кишечнике, дифференцированные клетки в норме живут очень недолго и, соответственно, даже при возникновении в них потенциально канцерогенных мутаций они не успеют превратиться в опухоль. В то же время, СК существуют длительно, подвергаясь воздействию многочисленных неблагоприятных факторов, что способствует возникновению и накоплению генетических изменений; впоследствии это приводит к малигнизации, нарушению механизмов регуляции деления, и такие клетки дают начало опухоли [42]. Мутация в СК может нарушить нормальную дифференцировку с торможением ее на различных уровнях, что ведет к появлению гетерогенной популяции опухолевых клеток [50], или изменить взаимоотношения СК с нишей, что делает их нечувствительными к тормозящим пролиферацию сигналам [38]. Так, экспрессия
онкогенов в СК/клетках-предшественницах молочной железы приводила к развитию рака [37]. В поддержании свойств СК участвует большое число генетических программ и маловероятно, что одна мутация в более дифференцированной клетке сможет их все активировать [37]. Подтверждает это представление также сходство маркеров нормальных и раковых СК [37]. Против него говорят показанная экспериментально возможность образования опухоли у мышей при мутациях в дифференцированных клетках, а также наличие клональных реаранжировок генов в Т- и В-клеточных опухолях, происходящих на поздних стадиях созревания клеток [50]. Кроме того, число СК в ткани невелико, и вероятность повреждения именно их генома невысока [37]. Хотя возможность развития опухоли из трансформированных нормальных СК была показана экспериментально, происхождение из СК вовсе не обязательно для наличия свойств РСК [16].
Промежуточные амплифицирующиеся клетки или клетки-предшественницы, сохраняющие некоторую степень самоподдержания, также рассматриваются как возможный источник рСК, поскольку число их в ткани существенно превышает число СК [37,38]. Возможность приобретения ими свойств рСК экспериментально показана в лейкозах и опухолях мозга [37]. При этом РСК экспрессируют маркеры, свойственные предшественницам, а не нормальным СК, что делает их более удобными мишенями для анти-рСК терапии [15]. Высказываются также предположения о возможности образования РСК из мезенхимальных СК [2,22]; к примеру, мезенхимальные СК костного мозга инициировали развитие рака желудка после хронической хеликобактерной инфекции [37].
Другим, более классическим, является представление о происхождении опухолей из зрелых дифференцированных клеток, в которых имеются мутации, изменяющие их нормальное функционирование, в том числе деление и выживаемость. и. R. Rapp et а1. выдвинули гипотезу, согласно которой определенные комбинации онкогенов индуцируют пластичность опухолевых клеток [45], однако, в связи с нарушением большого числа сигнальных путей, они приобретают новые, несвойственные им в норме характеристики, в том числе свойства СК, и таким образом часть из них становится рСК с последующей возможностью самоподдержания опухоли и ее прогрессирования и метастазирования.
Одним из возможных механизмов приобретения опухолевыми клетками характеристик рСК часто называют процесс эпителиально-мезен-химального перехода (ЭМП), при котором эпителиальные клетки приобретают ряд свойств и признаков мезенхимальных. При этом изменя-
ется экспрессия большого числа генов, в том числе участвующих в поддержании стволово-сти. Однако, не совсем понятно, чем определяется индукция стволовости лишь в части клеток первичной опухоли. Определенную роль может играть опухолевое микроокружение. Не исключается одновременное существование в опухоли РСК, произошедших как из нормальных СК, так и из дифференцированных опухолевых клеток с различной регуляцией и чувствительностью к терапии [8], или образование разными путями РСК со сходными свойствами [37]. Поскольку рСК могут происходить в результате дедиф-ференцировки из клеток-предшественниц или дифференцированных клеток, то их, таким образом, следует считать не отдельной субпопуляцией клеток, а их динамическим состоянием [43]. Например, наличие различных обратимых фенотипов со сходным туморигенным потенциалом было показано в меланоме [16]. Кроме того, предполагается возможность появления РСК при слиянии СК и других клеток [37].
РСК и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМп)
В последние годы появляется все больше работ, оценивающих связь РСК с ЭМП. Идеи, выдвигаемые в них, варьируют от отдельных признаков сходства до полной идентичности клеток в состоянии ЭМП и РСК [17,32]. Действительно, во многих экспериментальных исследованиях с клетками различных опухолей показано, что клетки в состоянии ЭМП, определяемом по снижению экспрессии Е-кадгерина и наличию экспрессии мезенхимальных маркеров (N-кадгерина, виментина, фибронектина), приобретают также свойства РСК [44]. В то же время, клетки, обладающие свойствами РСК, имеют морфологические признаки ЭМП (вытянутая форма, соответствующее изменение экспрессии генов). ЭМП приводит к образованию клеток с характеристиками РСК в раке молочной [12] и поджелудочной железы, колоректальном раке [18], плоскоклеточном раке головы и шеи [34], раке предстательной железы [31].
S. A. Mani et al. показали, что индукция ЭМП даже в неопухолевых клетках эпителия молочной железы (посредством постоянной экспрессии Snail или Twist или воздействия TGFP1) значительно увеличивало количество клеток с фенотипом СК молочной железы, а также клеток, способных к образованию маммосфер и опухолей у мышей, причем количество сфе-роформирующих клеток в серийных пассажах оставалось стабильным (примерно 4-6%). Наоборот, клетки со свойствами стволовых, выделенные из нормальной ткани молочной железы
мышей и человека и из рака молочной железы, имели мезенхимоподобный фенотип и экспрессию генов, соответствующую ЭМП. Было отмечено, что, по крайней мере в используемой модели, для длительного поддержания в клетках признаков стволовости нужна была постоянная стимуляция ЭМП [40].
В плоскоклеточном раке S. Geng et al. показали, что клетки с высокой экспрессией маркера РСК CD44 и участвующего в ЭМП посредством взаимодействия с кадгеринами белка CD29 имеют большую способность к пролиферации и отличающиеся от нормы уровни экспрессии большого числа генов, связанных с ЭМП, клеточным циклом, злокачественной трансформацией, мета-стазированием, устойчивостью к терапии. Оба маркера преимущественно экспрессировались в инвазивном фронте рака. Авторы пришли к выводу, что такая комбинация маркеров идентифицирует клетки, имеющие признаки ЭМП и рСК, что свидетельствует в пользу тесной связи этих процессов [21]. Однако следует отметить, что T. Terrassa et al., напротив, наблюдали подавление свойств РСК при индукции ЭМП [7].
ЭМП считается одним из начальных этапов метастазирования опухоли, а СК в норме активно участвуют в заживлении ран, причем, существуют определенные параллели между этими процессами (выход клеток в кровеносное русло, миграция и рост в новом месте). Чтобы сформировать макрометастаз в отдаленном органе, опухолевые клетки должны приобрести некоторую способность к самоподдержанию, поэтому возможно, что среди всех клеток в состоянии ЭМП лишь часть со свойствами РСК может дать метастазы [17]. Показано, что в циркулирующих опухолевых клетках экспрессируются маркеры и ЭМП, и РСК [8,27]. Ряд транскрипционных факторов (Notch, Hedgehog) играют важную роль как в процессе ЭМП, так и в приобретении свойств РСК [3,35], а некоторые транскрипционные факторы, регулирующие ЭМП (ZEB, Snail, Slug, Twist), при определенных условиях могут придавать клеткам свойства РСК [10]. Наиболее явным связующим звеном между ЭМП и РСК считается путь Wnt [18]. В обоих случаях известна также регуляторная роль микроРнК [2,23], к примеру, особое значение в индукции ЭМП и РСК-подобного фенотипа в клетках рака предстательной железы играют miR-200 и let-7 [31]. Ингибиторы сигнальных путей, необходимых для РСК и ЭМП, считаются потенциальными мишенями для разработки новых препаратов [8].
рск и их ниша
нормальные СК существуют в пределах особой ниши, состоящей из определенным образом
организованных и взаимодействующих мезенхи-мальных и эпителиальных клеток, прямо и косвенно участвующих в регуляции поведения СК. В частности, они обеспечивают баланс между двумя основными свойствами СК - самообновлением и дифференцировкой - как посредством межклеточных взаимодействий, так и с помощью секретируемых факторов. Судьба дочерних клеток, образующихся при делении СК, может определяться тем, выйдет ли клетка из ниши с последующей дифференцировкой или останется в ней в покоящемся состоянии за счет сигналов, тормозящих пролиферацию и рост [38]. Таким образом, «заякоривание» СК в нише необходимо для содержания их вблизи факторов, способствующих самоподдержанию, и вдали от факторов, стимулирующих дифференцировку. Нарушение взаимоотношений СК и ниши может привести к неконтролируемой пролиферации и канцерогенезу [38]. Ряд факторов, участвующих во взаимодействии СК с нишей (Wnt/p-катенин, остеопонтин, интегрины) или необходимых для миграции СК (рецептор ламинина, SDF1 и CXCR4, MMP-9, кальций-чувствительный рецептор, интегрины), участвуют также в инвазии метастазировании [37,38].
РСК также активно взаимодействуют с элементами микроокружения и, как полагают, существуют в пределах особых ниш. Опухолевое микроокружение активно участвует в канцерогенезе, в том числе посредством факторов (к примеру, антагонистов ВМР), продуцируемых нишей нормальной СК, что поддерживает опухолевые клетки в менее дифференцированном состоянии. В опухолях СК становятся независимыми от ниши в отношении пролиферативных сигналов, либо ниша начинает подавать избыточные сигналы к пролиферации [38]. Она влияет на экспрессию генов в РСК, хотя возможно, что они гораздо менее зависимы от ниши, чем нормальные СК.
РСК опухолей мозга находятся в сосудистой нише. Периваскулярное расположение РСК, подтверждаемое экспериментально при прижизненной микроскопии [16], делает их более устойчивыми к лучевой терапии, а секретиру-емый эндотелиальными клетками NO ведет к активации Notch и повышению способности РСК к самоподдержанию. Другой частой зоной локализации РСК, способствующей их самоподдержанию, является гипоксическое микроокружение, причем ряд регуляторов стволо-вости (Oct4, Notch, c-myc) являются прямыми или непрямыми мишенями HIF - основного чувствительного к гипоксии сигнального пути [20]. В зависимости от микроокружения РСК подвергаются симметричному или асимметричному делению [16]. Ряд авторов полагают, что в
соответствующем микроокружении практически любая клетка может приобретать свойства РСК [48], а элементы микроокружения (в частности, эндотелиальные клетки) могут происходить из РСК [16]. Понимание значения микроокружения для рСК необходимо для адекватной разработки экспериментальных систем ex vivo, учитывающих факторы микроокружением [16].
В последние годы работы ряда авторов показывают, что отношения СК и их ниши могут быть более сложными. Так, для кроветворных СК предполагается наличие 2-х различных по свойствам ниш, между которыми они могут динамически «переключаться»: выстланной эн-дотелиальными клетками «сосудистой» ниши в костном мозге и селезенке, обеспечивающей пролиферацию и дифференцировку СК, и выстланной остеобластами «молчащей» ниши на границе кости и кроветворной ткани, поддерживающей их в покоящемся состоянии. Существование подобных ниш для РСК не доказано, однако если предположить их наличие, то отличие опухоли от нормальной ткани можно объяснить различием во времени, проводимом клетками в разных нишах или их доступностью [38,48].
Микроокружение влияет на результаты ксе-нотрансплантации опухолевых клеток - основного метода выявления РСК. При введении РСК рака предстательной железы подкожно и непосредственно в простату наблюдались различные паттерны роста опухоли. В экспериментах с меланомой добавление Матригеля к трансплантируемым клеткам снижало их количество, необходимое для возникновения опухоли, а дополнительное выключение функции натуральных киллеров в мышах делало способность к инициации опухоли практически не связанной с фенотипом клеток [16]. Стволовость РСК глиомы подавлялась СК пуповинной крови путем снижения экспрессии Twistl и Sox2 [16]. В опытах с различными опухолями добавление к суспензии клеток, очищенных по признаку экспрессии маркеров РСК, других клеток или Матригеля существенно влияло на их ксенотранс-планстабельность, делая наличие свойств РСК не единственной детерминантой успешного развития опухоли [29].
Косвенно о наличии ниши РСК свидетельствуют работы о существовании преметастати-ческих ниш - особого микроокружения, индуцируемого клетками первичной опухоли в местах появления отдаленных метастазов посредством растворимых факторов. Формирование ниши при этом считается необходимым для успешной колонизации опухолевыми клетками отдаленных органов. так, гемопоэтические клетки-предшественницы костного мозга, экспрессирующие VEGFR1, направляются к местам формирования
метастазов факторами, секретируемыми клетками первичной опухоли, раньше, чем там появляются метастатические клетки; нарушение этого механизма может предотвратить формирование метастазов. Метастатические РСК также модулируют локальное микроокружение органа-мишени [37]. Это делает ниши РСК перспективными терапевтическими мишенями для лечения опухолей, поскольку нарушение сигналов, исходящих из ниш, сможет привести к утрате РСК их основных свойств, в том числе способности к поддержанию опухоли. Некоторые успехи в этом направлении были достигнуты в лечении миелопролиферативных заболеваний.
J. B. Sneddon et al. [48] в своем обзоре предлагают следующие возможные варианты взаимодействий РСК и их ниши: 1) отсутствие специализированной ниши у РСК и их существование в пределах ниши нормальных СК; 2) наличие предсуществующей ниши, способствующей формирования РСК и опухоли; 3) способность РСК самим формировать необходимую нишу или 4) увеличивать количество активированных ниш; 5) независимость РСК от наличия ниши; 6) не исключается существование «ингибирующей» ниши, приводящей к смерти или дифференци-ровке РСК. Предполагается, что выявление особых маркеров клеток ниши РСК позволит более точно узнать их роль в биологии опухоли. Для уточнения роли отдельных молекул во взаимодействии РСК и их ниш нужны функциональные исследования.
на РСК оказывают влияние многие другие факторы. К примеру, в гормонально-зависимых органах показано влияние половых гормонов на функции РСК. В простате РСК не экспрес-сируют рецепторы андрогенов, однако имеют рецепторы эстрогенов а и в и могут быть мишенями воздействия эстрогенов и мимикрирующих их веществ уже в раннем периоде жизни, что может быть одним из механизмов повышения риска рака предстательной железы в случаях неонатального воздействия эстрогенов [26]. Гипоксия также определяет поведение РСК, основным «сенсором» ее является HIF2a. В глиобластоме он экспрессируется преимущественно на РСК, влияя на их выживаемость и формирование опухоли. Культивирование опухолевых клеток в условиях гипоксии повышало экспрессию в них маркеров РСК, инвазивность и клоногенность [16]. Гипоксия повышала экспрессию генов, связанных с ранними стадиями эмбрионального развития, в клетках нейробла-стомы и рака молочной железы [25]. Показано влияние на функции РСК ожирения и рецептора лептина [16]. Важным является открытие влияния генотипа на частоту РСК в опухоли и экспрессию ими различных маркеров. Так, наличие
мутации CDKN2A/B в В-клеточном остром лим-фобластном лейкозе увеличивало частоту РСК в 1000 раз, а в экспериментальных моделях рака легкого у мышей экспрессия РСК маркера Sca-1 зависела от способа индукции опухоли [33]. РСК могут эволюционировать с течением времени, накапливая новые мутации, в том числе увеличивающие долю РСК в опухоли. Дополнительным источником общей популяции РСК становятся РСК, произошедшие из не-РСК при возникновении в последних мутаций, придающих им свойства стволовости [33]. В регуляции свойств РСК участвуют также эпигенетические механизмы (деметилазы гистонов, репрессоры транскрипции и т. д.). Таким образом, стволо-вость как характеристика опухолевых клеток может быть результатом совместного действия на клетки генетического разнообразия, эпигенетических механизмов регуляции и опухолевого микроокружения [33].
сигнальные пути, вовлеченные в формирование рск
В регуляции образования, самоподдержания и дифференцировки РСК большую роль играют сигнальные пути, в норме активные в период эмбриогенеза и в нормальных СК. Наиболее изучены изменения в путях Wnt, Notch, Hedgehog, Nestin, Nanog, TGFß, ВМР [16,52]. В норме Wnt, Notch, Hedgehog способствуют самоподдержанию и пролиферации СК, взаимодействию их с нишей [38,48], а BMP и TGFß тормозят их пролиферацию [37], к примеру, поддерживая их в покоящемся состоянии в проксимальных отделах протоков простаты мыши [38,46]. Мутации в белках эти путей приводят к нарушению контроля пролиферации и дифференцировки СК и формированию опухоли [3,41], а торможение их позволяет уменьшить количество РСК и частоту неблагоприятных клинических исходов [9]. Так, ингибирование Notch4 может уменьшить количество РСК в раке молочной железы [9], РСК медуллобластомы также экспрессируют высокие уровни Notch и чувствительны к его ингибиторам [20]. Активация Hedgehog участвует в злокачественной трансформации эмбриональных клеток печени при гепатобластоме [39], нарушения этого пути обнаружены при раке поджелудочной и предстательной железы, кожи, опухолях мозга [35]. Разработка препаратов, направленных на элементы этих сигнальных путей, хотя и представляется перспективной, однако затруднена в связи с их взаимодействием со многими регуля-торными молекулами [49].
Кроме того, на РСК влияют многие сигнальные пути, рецепторы и молекулы, участвующие в различных аспектах канцерогенеза (PI3K/Akt,
РТЕ^ JAK/STAT, ОТ-кВ, Вс1-2, тТО^ Вть1) [9,37]. К примеру, введение НЕЯ2 в клетки молочной железы увеличивает их туморигенность и долю клеток, экспрессирующих маркеры рСК, а неоадъювантная таргетная анти-НЕИ2 терапия уменьшает число РСК в опухоли [15]. Потеря опухолевого супрессора PTEN отличает лейкоз-ные СК от нормальных [37]. Транскрипционный фактор NF-kB может активироваться в РСК и служить мишенью для селективного по сравнению с нормальными СК их уничтожения [15]. МикроРНК, будучи важными многофункциональными регуляторами внутриклеточных процессов, также участвуют в регуляции РСК, в том числе их связи с ЭМП [23,51].
некоторые противоречия и нерешенные вопросы
РСК как источники опухоли пока не получили всеобщего признания, так как по мнению некоторых авторов существование их окончательно не доказано [24]. Используемые экспериментальные модели и методы имеют ряд ограничений. Так, основным методом определения РСК являются функциональные исследования, в частности образование ксенографтных опухолей в иммунодефицитных мышах. Однако L. Vezzoni и G. Ра1^аш [50] справедливо отмечают, что условия роста опухолей в этом случае сильно отличаются от таковых в организме человека, особенно при гетеротопической трансплантации клеток, когда они не получают соответствующего микроокружения или иных поддерживающих факторов. имеющееся другое опухолевое микроокружение и иммунный статус животных (например, у них сохранен иммунитет, опосредованный NK-клетками [18]) могут существенно влиять на биологию опухолевых клеток, и совершенно не обязательно, что клетки, дающие ксенографтную опухоль, идентичны клеткам, поддерживающим рост опухоли в организме человека, так как, возможно, они просто обладают свойствами, способствующими трансплантации. При пересадке клеток спонтанных или индуцированных опухолей мышей синген-ным животным во многих случаях число клеток, способных к росту в новом организме, было достаточно велико, и они могли иметь фенотип дифференцированных клеток [1]. Это свидетельствует о том, что на результаты выявления РСК посредством ксенотрансплантации серьезно влияют условия эксперимента [33] и они могут зависеть от многих непосредственно не связанных с РСК факторов (введение совместно с опухолевыми клетками эндотелиальных клеток [1,28], иных стромальных элементов [33] или Матриге-ля, сильно облученных опухолевых клеток, ин-
гибирующее влияние не-РСК на РСК при их совместном введении [29], место инъекции, в том числе подкожное введение в различные участки тела, индукция воспалительного ответа [24] и др.). Возможно, ксенотрансплантация уменьшает долю клеток, способных воспроизводить опухоль [33,50].
Интересен вопрос о стабильности РСК во времени. Поскольку возможна их эволюция в процессе прогрессии опухоли с появлением более агрессивных субклонов, то клетки, выделенные из имеющейся опухоли и дающие рост при ксенотрансплантации, могут не быть родоначальницами опухоли у человека. течение заболевания у пациента может определяться появившимися позже более агрессивными дифференцированными клетками, не способными к ксенотрансплантации [1]. Также не ясно, тождественны ли РСК опухоли на ранней стадии таковым при возникновении рецидива или метастазов, так как генетические изменения в опухоли могут влиять на частоту РСК и их свойства [33].
В опухоли обычно присутствуют генетически различные субклоны, в том числе возникающие при ее эволюции. В них возможно содержание различной доли РСК, а выделение РСК на основе определенных маркеров в этом случае приведет лишь к косвенному разделению более и менее агрессивных субклонов. Кроме того, в некоторых субклонах РСК могут не экспресси-ровать эти маркеры и, следовательно, не будут выделены [33]. Для преодоления этого ограничения необходимо определение РСК в генетически идентичных клетках одного субклона. Остается актуальным вопрос о равноценности всех РСК в способности поддерживать рост опухоли и в ответе на терапию, так как генетические исследования отдельных клеток показали значительную вариабельность популяции РСК [33] и возможность их иерархической организации.
В ряде случаев клетки, не обладающие свойствами РСК, могут генерировать РСК. Полагают, что имеется динамическое равновесие между числом РСК и не-РСК в популяции. Это позволило предположить, что РСК являются не отдельным видом клеток в гетерогенной опухоли, а скорее состоянием клеток, в которое могут переходить не-РСК клетки при действии соответствующих стимулов [33]. В качестве последних могут выступать индукция ЭМП, факторы микроокружения (фактор роста гепатоцитов, пе-риваскулярный оксид азота). остается, однако, неясным, насколько актуален подобный переход in vivo, и все ли не-РСК могут с одинаковой вероятностью переходить в РСК [33].
Проблемой является несоответствие предполагаемого числа РСК в опухоли по данным разных исследований [29]. Так, учитывая, что
для ксенотрансплантации необходимо не менее 10 000 несортированных опухолевых клеток, частота РСК оценивается как примерно 0,01% клеток опухоли. В то же время, при изучении экспрессии маркеров РСК число позитивных клеток обычно составляет от нескольких десятых до нескольких десятков процентов, что не соответствует вышеприведенным оценкам и является следствием неспецифичности маркеров, позволяющих лишь «обогатить» популяцию РСК, но не выделить их в чистом виде [16,39].
Имеется неоднозначность даже в понимании РСК. В наиболее строгом смысле их считают аналогом нормальных СК соответствующей ткани, приобретших ряд мутаций, в том числе нарушающих нормальную дифференцировку. Согласно другой точке зрения, принятой на совещании AACR [11], РСК представляют небольшую часть клеток опухоли, ответственных за ее рост и поддержание, независимо от источников их происхождения; такое понимание РСК, как представляется, заслуживает поддержки.
Таким образом, теория РСК является привлекательной моделью, объясняющей многие вопросы биологии опухоли и позволяющей взглянуть на рак как на болезнь пролиферации и дифференцировки [20]. Однако несмотря на ее активную разработку и большое число исследований в этой области, все еще остаются нерешенные вопросы, касающиеся методов выявления РСК, их источников, взаимоотношений с микроокружением, маркеров РСК. Большинство данных о РСК получены в эксперименте, поэтому не совсем понятно, насколько они актуальны для пациентов. Необходима их верификация в клинических исследованиях и стандартизация исследований РСК в разных типах опухолей [20]. Однако, несомненно, что изучение РСК является весьма перспективным, а лучшее понимание роли РСК в канцерогенезе и возможностей воздействия на них позволит разработать новые подходы к терапии злокачественных новообразований.
литература
1. Adams J. M., Strasser A. Is Tumor Growth Sustained by Rare Cancer Stem Cells or Dominant Clones? // Cancer Res. - 2008. - Vol. 68. - N. 11. - P. 4018 - 4021.
2. Bao B., Ahmad A., Li Y et al. Targeting CSCs within the tumor microenvironment for cancer therapy: a potential role of mesenchymal stem cells // Expert Opin Ther Targets. - 2012. - Vol. 16. - N. 10. - P. 1041 - 1054.
3. Bolós V., Blanco M., Medina V. et al. Notch signalling in cancer stem cells // Clin Transl Oncol. - 2009. - Vol. 11. - N. 1. - P. 11 - 19.
4. Bonnet D., Dick J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive
hematopoietic cell // Nat Med. - 1997. - Vol. 3. - N. 7. - P. 730 - 737.
5. Bussolati B., Dekel B., Azzarone B., Camussi G. Human renal cancer stem cells // Cancer Lett. - 2013. - Vol. 338. - N. 1. - P. 141 - 146.
6. Cabanillas R, Llorente JL. The Stem Cell Network model: clinical implications in cancer // Eur Arch Otorhinolaryn-gol. - 2009. - Vol. 266. - N. 2. - P. 161-170.
7. Celia-Terrassa T., Meca-Cortes O., Mateo F. et al. Epithe-lial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells // J Clin Invest.
- 2012. - Vol. 122. - N. 5. - P. 1849-1868.
8. Chang J. T., Mani S. A. Sheep, Wolf, or Werewolf: Cancer stem Cells and the Epithelial-to-Mesenchymal Transition // Cancer Lett. . - 2013. - Vol. 341. - N. 1. - P. 16-23.
9. Chen K., Huang Y-H., Chen J-I. Understanding and targeting cancer stem cells: therapeutic implications and challenges // Acta Pharmacologica Sinica. - 2013. - Vol. 34. - P. 732-740.
10. Chui M. H. Insights into cancer metastasis from a clini-copathologic perspective: Epithelial-Mesenchymal Transition is not a necessary step // Int J Cancer. - 2013. - Vol. 132. - N. 7. - P. 1487-1495.
11. Clarke M. F., Dick J. E., Dirks P. B. et al. Cancer Stem Cells - Perspectives on Current Status and Future Directions: AACR Workshop on Cancer Stem Cells // Cancer Res. - 2006. - Vol. 66. - P. 9339-9344.
12. Creighton C. J., Chang J. C., Rosen J. M. Epithelial-Mes-enchymal Transition (EMT) in Tumor-Initiating Cells and Its Clinical Implications in Breast Cancer // J Mammary Gland Biol Neoplasia. - 2010. - Vol. 15. - P. 253-260.
13. Crowe D. L., Parsa B., Sinha U. K. Relationships between stem cells and cancer stem cells // Histol Histopathol. -2004. - Vol. 19. - P. 505-509.
14. Daley G. Q. Common themes of dedifferentiation in somatic cell reprogramming and cancer // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. - 2008. - Vol. 73. - P. 171-174.
15. Diehn M., Cho R. W., Clarke M. F. Therapeutic Implications of the Cancer Stem Cell Hypothesis // Semin Radiat Oncol. - 2009. - Vol. 19. - N. 2. - P. 78-86.
16. Fabian A., Vereb G., Szollosi J. The Hitchhikers Guide to Cancer Stem Cell Theory: Markers, Pathways and Therapy // Cytometry Part A. - 2013. - Vol. 83A. - P. 62-71.
17. Floor S., van Staveren W. C., Larsimont D. et al. Cancer cells in epithelial-to-mesenchymal transition and tumor-propagating-cancer stem cells: distinct, overlapping or same populations // Oncogene. - 2011. - Vol. 30. - N. 46. - P. 4609-4621.
18. Fulawka L., Donizy P., Halon A. Cancer stem cells - the current status of an old concept: literature review and clinical approaches // Biol Res.—2014. - Vol. 47. - P. 66-74.
19. Gao J. X. Cancer stem cells: the lessons from pre-can-cerous stem cells // J Cell Mol Med. - 2008. - Vol. 12.
- N. 1. - P. 67-96.
20. Garvalov B. K., Acker T. Cancer Stem Cells: a New Framework for the Design of Tumor Therapies // J Mol Med.
- 2011. - Vol. 89. - P. 95-107.
21. Geng S., Guo Y, Wang Q. et al. Cancer stem-like cells enriched with CD29 and CD44 markers exhibit molecular characteristics with epithelial-mesenchymal transition in squamous cell carcinoma // Arch Dermatol Res. - 2013.
- Vol. 305. - N. 1. - P. 35-47.
22. Guan J., Chen J. Mesenchymal stem cells in the tumor microenvironment (Review) // Biomedical reports. - 2013.
- Vol. 1. - P. 517 - 521.
23. Hao J., Zhang Y, Deng M. et al. MicroRNA control of epithelial-mesenchymal transition in cancer stem cells // Int J Cancer. - 2014 . - Vol. 135. - N. 5. - P. 1019-1027.
24. Hill R. P. Identifying Cancer Stem Cells in Solid Tumors: Case Not Proven // Cancer Res - 2006. - Vol. 66. - N. 4. - P. 1891-1896.
25. Hill R. P., Perris R. "Destemming" Cancer Stem Cells // J Natl Cancer Inst. - 2007. - Vol. 99. - P. 1435-1440.
26. Hu W-Y, Shi G-B., Hu D-P. et al. Actions of Estrogens and Endocrine Disrupting Chemicals on Human Prostate Stem/Progenitor Cells and Prostate Cancer Risk // Mol Cell Endocrinol. - 2012. - Vol 354. - N. 1-2.
- P. 63-73.
27. Kasimir-Bauer S., Hoffmann O., Wallwiener W. et al. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells // Breast Cancer Res. - 2012. - Vol. 14. - R15.
28. Kelly P. N., Dakic A., Adams J. M. et al. Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells // Science. - 2007. - Vol. 317. - P. 337.
29. Kern S. E., Shibata D. The Fuzzy Math of Solid Tumor Stem Cells: A Perspective // CancerRes. - 2007. - Vol. 67. - N. 19. - P. 8985-8988.
30. Kondo T. Stem cell-like cancer cells in cancer cell lines // Cancer Biomark. - 2007. - Vol. 3. - N. 4-5. - P. 245-250.
31. Kong D., Banerjee S., Ahmad A. et al. Epithelial to Mesenchymal Transition Is Mechanistically Linked with Stem Cell Signatures in Prostate Cancer Cells // PLoS oNE. -
2010. - Vol. 5. - N. 8. - P. e12445.
32. Kong D., Li Y, Wang Z., Sarkar F. H. Cancer Stem Cells and Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT)-Pheno-typic Cells: Are They Cousins or Twins? // Cancers. -
2011. - Vol. 3. - P. 716 - 729.
33. Kreso A., Dick J. E. Evolution of the Cancer Stem Cell Model // Cell Stem Cell. - 2014. - Vol. 14. - P. 275-291.
34. La Fleur L., Johansson A.-C., Roberg K. A CD44high/ EGFRlow Subpopulation within Head and Neck Cancer Cell Lines Shows an Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype and Resistance to Treatment / PLoS one. -
2012. - Vol. 7. - N. 9. - P. e44071.
35. Lauth M., Toftgard R. The Hedgehog pathway as a drug target in cancer therapy // Curr Opin Investig Drugs. -2007. - Vol. 8. - N. 6. - P. 457-461.
36. Leirös G. J., Balana M. E. Metastatic cancer stem cells: new molecular targets for cancer therapy // Curr Pharm Biotechnol. - 2011. - Vol. 12. - N. 11. - P. 1909-1922.
37. Li F., Tiede B., Massague J., Kang Y Beyond tumorigen-esis: cancer stem sells in metastasis // Cell Res. - 2007.
- Vol. 17. - P. 3 - 14.
38. 119. Li L., Neaves W. B. Normal Stem Cells and Cancer Stem Cells: The Niche Matters // Cancer Res. - 2006. -Vol. 66. - N. 9. - P. 4553-4557.
39. Lingala S., Cui Y-Y, Chen X. et al. Immunohistochemical Staining of Cancer Stem Cell Markers in Hepatocellular Carcinoma // Exp Mol Pathol. - 2010. - Vol. 89. - N. 1. - P. 27-35.
40. Mani S. A., Guo W., Liao M.-J. et al. The epithelial-mesen-chymal transition generates cells with properties of stem cells // Cell. - 2008. - Vol. 133. - N. 4. - P. 704-715.
41. Medina V., Calvo M. B., Díaz-Prado S., Espada J. Hedgehog signalling as a target in cancer stem cells // Clin Transl Oncol. - 2009. - Vol. 11. - N. 4. - P. 199-207.
42. Miller S. J., Lavker R. M., Sun T. T. Interpreting epithelial cancer biology in the context of stem cells: tumor properties and therapeutic implications // Biochim Biophys Acta. - 2005. - Vol. 1756. - N. 1. - P. 25-52.
43. Ni C., Huang J. Dynamic regulation of cancer stem cells and clinical challenges // Clin Transl Oncol. - 2013. - Vol. 15. - N. 4. - P. 253-258.
44. Polyak K., Weinberg R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits // Nat Rev Cancer. - 2009. - Vol. 9. - N. 4. - P. 265-273.
45. Rapp U. R., Ceteci F., Schreck R. Oncogene-induced plasticity and cancer stem cells // Cell Cycle. - 2008. -Vol. 7. - N. 1. - P. 45-51.
46. Salm S. N., Burger P. E., Coetzee S. et al. TGF-b maintains dormancy of prostatic stem cells in the proximal region of ducts // J Cell Biol. - 2005. - Vol. 170. - N. 1. - P. 81-90.
47. Sell S. Stem cell origin of cancer and differentiation therapy // Crit Rev Oncol Hematol. 2004. - Vol. 51. - N. 1. - P. 1-28.
48. Sneddon J. B., Werb Z. Location, Location, Location: The Cancer stem Cell Niche // Cell Stem Cell. - 2007. - Vol.
1. - P. 607-611.
49. Takebe N., Harris P. J., Warren R. Q., Ivy S. P. Targeting cancer stem cells by inhibiting Wnt, Notch, and Hedgehog pathways // Nat Rev Clin Oncol. - 2011. - Vol. 8. - N.
2. - P. 97-106.
50. Vezzoni L., Parmiani G. Limitations of the cancer stem cell theory // Cytotechnology. - 2008. - Vol. 58. - P. 3-9.
51. Xia H., Hui K. M. MicroRNAs involved in regulating epi-thelial-mesenchymal transition and cancer stem cells as molecular targets for cancer therapeutics // Cancer Gene Therapy. - 2012. - Vol. 19. - P. 723-730.
52. Zardawi S. J., O'Toole S. A., Sutherland R. L., Musgrove E. A. Dysregulation of Hedgehog, Wnt and Notch signal-
ling pathways in breast cancer // Histol Histopathol. -2009. - Vol. 24. - N. 3. - P. 385-398.
53. Zhang H., Wang Z. Z. Mechanisms that mediate stem cell self-renewal and differentiation // J Cell Biochem. - 2008. - Vol. 103. - N. 3. - P. 709-718.
54. Zhang P., Zuo H., Ozaki T. et al. Cancer stem cell hypothesis in thyroid cancer // Pathol Int. - 2006. - Vol. 56. - N. 9. - P. 485-489.
Потупила в редакцию 02.09. 2015 г.
M.V.Puchinskaya
Cancer stem cells as a possible source of tumor initiation and progression
Belarusian State Medical University Minsk, Republic of Belarus
Cancer stem cells may be a source of malignant tumors as well as their relapses after treatment and metastases. They share many features with normal tissue stem cells but also possess mutations and other genetic and epigenetic changes that make them tumorigenic and resistant to conventional cancer therapies. The source of cancer stem cells is discussed: they may originate from normal tissue stem cells as a result of their mutations or deregulation of signaling pathways or alternatively from differentiated tumor cells as a result of dedifferentiation during tumor development. Cancer stem cells reside in a special tumor microenvironment (niche) that regulates their functions. A number of signaling pathways and molecules participate in regulating cancer stem cells features. And although there are some inconsistencies concerning cancer stem cells, their existence may change our view on cancer progression and help to develop new strategies of cancer treatment.
Key words: stem cells, cancer stem cells, self-maintenance, niche, xenotransplantation
