CC BY
37
© Р. И. Глушаков 1,
А. с. лисянская2, с. н. Прошин 3,
н. И. тапильская 1
1 Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия
2 Городской клинический онкологический диспансер г. Санкт-Петербурга
3 Северо-Западный государственный медицинский университет
им. И. И. Мечникова
Резюме. Изучен уровень экспрессии дисиалоганглиозидов GD1a и GD3 у пациенток c раком яичника и гипертиреозом. Оценена продолжительность безрецидивного периода заболевания в обследуемых группах. Уровни экспрессии в ткани опухоли определялись иммунногистохимическим методом. В ткани опухоли, полученной от пациенток, гипертиреозом, определялись более низкие уровни экспрессии дисиалоганглиозидов GD3 и GD1a. При анализе безрецидивного периода нами получены достоверные различия в зависимости от тиреоидного статуса пациенток.
Ключевые слова: рак яичника; ганглиозиды; гипертиреоз.
УДК: 618.11-007.6+ 612.44
РАК ЯИЧНИКА У ПАЦИЕНТОК С ИЗМЕНЕННЫМ ТИРЕОИДНЫМ СТАТУСОМ
введение
Злокачественные опухоли репродуктивной системы являются наиболее частыми в структуре онкологической заболеваемости женщин, их суммарная доля превышает 35 %. В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 12000 новых случаев злокачественных новообразований яичника (10,1 на 100 тыс.), таким образом, рак яичника занимает 7-е место в структуре общей онкологической заболеваемости и 3-е — среди гинекологических опухолей после рака тела и шейки матки. Показатели пятилетней относительной выживаемости больных раком яичника при распространенном процессе остаются достаточно низкими, согласно данным популяционных регистров, пятилетняя выживаемость варьирует от 12 до 42 % [1]. Так как данная опухоль характеризуется длительным бессимптомным течением и, как следствие, поздней диагностикой у большинства больных, то выживаемость пациенток с данной патологией также остается крайне низкой. Несмотря на то что более 70 % пациенток чувствительны к лекарственной противоопухолевой терапии [13], только на первом году после установления диагноза умирают 28 % больных. По сводным данным популяционных раковых регистров стран Европы, 1-летняя выживаемость больных РЯ составляет 63 %, 3-летняя — 41 %, 5-летняя — 35 %. Основными причинами смертности в ранние сроки после постановки диагноза является рефрак-терность к лечению больных с диссеминированным раком, а также осложнения от агрессивного противоопухолевого лечения.
Некоторые исследования, выполненные в 70-х годах прошлого столетия, продемонстрировали, что гипотиреоз в анамнезе является фактором риска возникновения злокачественных новообразований в гормонозависимых органах [5]. Однако более поздние эпидемиологические и клинические исследования, выполненных с целью определить степень риска развития гормональнозависимых опухолей у пациенток c различным тиреоидным статусом, свидетельствуют, что у пациенток с гипертиреозом в анамнезе в большем проценте случаев выявляется рак молочной железы [23] и рак яичника [11]. Индуцированный гипотиреоз легкой степени приводит к увеличению общей выживаемости у пациентов с мультиформной глиобла-стомой [5, 7], а гипотиреоидный статус ассоциирован с меньшей агрессивностью рака молочной железы [2]. Также индуцированный острый тиреоидит с исходом в гипотиреоз, который отмечается как побочный эффект некоторых современных таргетных противоопухолевых препаратов, приводит к увеличению как безрецидивной, так и общей выживаемости у пациентов по сравнению с эутиреоид-ной группой пациентов с различной онкологической патологией [4].
В настоящее время установлено in vitro, что избыточные концентрации тиреоидных гормонов, действуя через геномные и негеномные механизмы, обладают системным провоспалительным действием, а роль хронического воспаления в развитии злокачественных новообразований признается большинством авторов [14, 20]. Описано, что тиреоидные гормоны обнаруживают селективные имму-
номодулирующие эффекты. Данное действие проявляется в системном ингибирующем действии на иммунную систему: подавляя хемотаксис, фагоцитоз, синтез цитокинов и активных форм кислорода в моноцитах, макрофагах, лейкоцитах, наруральных киллерах и лимфоцитах. С другой стороны, в остальных тканях йодотиронины активируют синтез тканеспецифичных провоспа-лительных генов и активируют неоангиогенез [3]. Также тиреоидные гормоны увеличивают уровень а-изоформы рецептора к эстрогену (ER), не влияя на Р-изоформу [14], что имеет место при злокачественной трансформации [12]. Тироксин, действуя через интегриновый рецептор, активирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК), которая фосфорилирует Ser-Ш в ядерном ERа, где в отсутствии эстрогенов происходит усиление пролиферации клеток [21].
Отсутствие достаточной эффективности тар-гетной противоопухолевой терапии, направленной против субстрата белкового происхождения, заставляют обращаться к изучения опухолевых маркеров небелковой природы. К настоящему времени опубликовано значительное количество данных об опухолевых антигенах гликолипидной природы. При злокачественном росте наблюдается ряд отклонений в составе и содержании ган-глиозидов в ткани опухоли, что приводит к нарушению межклеточных контактов и изменению иммуногенных свойств трансформированных клеток. Рак яичника характеризуется экспрессией следующих ганглиозидов: GM3, GM2, GD2, O-AcGD2, GD1а и GM1b [15]. По данным РппеА! с соавторами, повышение экспрессии GM3, GM2 коррелирует со снижением инвазивного потенциала опухоли [16]. Общее снижение экспрессии ганглиозидов в опухолевой ткани рака яичника коррелирует с повышенной резистентностью к противоопухолевым средствам такса-нового ряда [17]. Представляет интерес, что низкая экспрессия ганглиозида GD1a в опухолевой ткани рака яичника имеет обратную корреляцию с гиперэкспрессией матриксной металлопротеи-назы 9 типа на уровне транскрипции. Клетки с повышенной экспрессией GD1a обладают более низким метастатическим потенциалом [6].
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью нашего исследования являлась оценка уровня экспрессии ганглиозидов GD1a и GD3 в злокачественно измененной ткани яичника и сравнение продолжительности безрецидивного периода (определенного как время от даты окончания комплексного лечения до даты регистрации местного
рецидива, отдаленных метастазов или смерти) в группе больных с гипертиреозом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Иммуногистохимическому исследованию была подвергнута опухолевая ткань, полученная от 23 пациенток со второй (13 %) и третьей (87 %) стадиями заболевания раком яичника (FIGO III), находившихся на лечении в Городском клиническом онкологическом диспансере г. Санкт-Петербурга с 2008 по 2010 гг. Распространенность опухолевого процесса оценивали в соответствии с шестым изданием Атласа TNM. Все пациентки получали первичное хирургическое лечение в объеме оптимальной циторедуктивной операции. При патоморфологическом исследовании операционного материла в 82,6 % случаях установлен серозный тип карциномы яичника, в 17,4 % случаях определена аденокарцинома эндометрио-идного типа. Низкая (GI), умеренная (GII) и высокая (GIII) степень злокачественности опухоли были установлены в 26,1 %, 47,8 % и 26,1 % случаев соответственно. После хирургического лечения все пациентки получили лекарственное лечение в количестве 6 циклов комбинированной химиотерапии по схеме «паклитаксел+карбоплатин». В конце лечения на основании данных цитологического исследования пунктата из полости малого таза, уровня опухоль-ассоциированного серологического маркера (СА-125), а также на основании рентгенологических и/или ультрасонографи-ческих и клинических данным всем пациенткам была выставлена ремиссия заболевания. Средний возраст больных составил 56,8 ± 6,1 лет (интервал от 46 до 69 лет). Больные были разделены на две группы. В основную группу вошли 11 пациенток с гипертиреоидным статусом и эутиреоидным статусом на фоне приема тиреостатиков, обусловленным диффузным токсическим зобом (ДТЗ) или узловым токсическим зобом (УТЗ), на момент лечения злокачественного новообразования. В контрольную группу вошли 12 пациенток с аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) или без заболеваний ЩЖ в анамнезе с эу- или гипотиреоидным статусом. На основании клинических данных и данных гистологического исследования группы были сопоставимы друг с другом.
Операционный материал, полученный при выполнении первичной циторедуктивной операции, фиксировался в нейтральном формалине и после стандартной гистологической проводки заливался в парафин. С каждого парафинового блока раковой опухоли яичника и молочной железы на микротоме Leica SM 2000R (Sliding
Microtome for Routine Applications) были получены срезы толщиной около 4 микронов. После депарафинизации и демаскировки антигенов по стандартной методике проводилось иммуно-гистохимическое окрашивание с использованием соответствующих моноклональных антител к ганглиозиду GD1a (Millipore, USA) и ганглиози-ду GD3 (Thermo Scientific Pierce Antibodies, USA). Экспозиция первых антител составляла 1 час при постоянной температуре 30 оС, поддерживаемой при помощи нагревательной платы (Гистопла-та) LEICA HI1220, затем стекла со срезами промывались в Трис-буфере в течение 10 мин. Для детекции связывания первых антител с искомыми антигенами (клетки опухоли) использовали набор VectaStain, который включает универсальные вторые биотинилированные антитела и конъюгат (авидин-биотин-пероксидаза хрена). Для визуализации иммуногистохимической реакции (по светло-коричневому окрашиванию) препараты проводили через рабочий раствор диаминобензидина в течение подходящего периода времени. После иммуногистохимической реакции срезы промывали в дистиллированной воде и подкрашивали в гематоксилине Майера в течение 1-2 мин с краткой экспозицией в аммиачной воде (в течение 10-15 с). Отмывали в воде в течение 10 мин, дегидратировали в 70 % и 96 % спиртах по 10 мин, осветляли в карбол-ксилоле в течение 5 мин и ксилоле в течение 5 мин. После чего срезы заключали в среду.
Подсчет клеток, в которых экспрессирова-лись ганглиозиды, проводился при увеличении х 250 не менее среди 2000 клеток в исследуемом образце. Затем высчитывался процент клеток, в которых экспрессировался данный антиген. Частоту клеток, позитивных в иммуногистохимической реакции с моноклональными антителами на экспрессию искомых гликосфинголипидов, выражали в процентах ( %). Оценивалось не менее 10 полей зрения (х 250). Статистическую обработку результатов проводили по t-критерию Стъюдента.
После окончания комплексного лечения состояние заболевания оценивалось по уровню онкомаркера СА-125 и данным ультразвукового и/или рентгенологического исследования. Увеличение ранее зарегистрированного уровня СА-125 более чем на 75 % и/или выше 35 Ед/мл, появление очагов в брюшной полости и малом тазу и/или специфической картины в легких считалось признаком прогрессии заболевания. Продолжительность безрецидивного периода заболевания (БРПЗ) определяли как время от даты окончания лечения до даты регистрации местного рециди-
ва, отдаленных метастазов или смерти в каждой группе больных. Продолжительность безрецидивного периода анализировалась при помощи метода Каплана-Майера и составления соответствующей кривой с определением ее медианы.
результаты и обсуждение
Пациенткам с признаком прогрессирования заболевания выполнялась пункция брюшной полости через задний свод влагалища с последующей морфологической оценкой полученного материала. При отрицательных результатах данных цитологического исследования пациенткам выполнялась диагностическая лапароскопия с целью подтверждения рецидива заболевания. Пациенткам с признаками метастатического плеврита выполнялась пункция плевральной полости с последующей морфологической оценкой полученного материала. Динамическое наблюдение прекращалось, как только у больных имело место морфологическое подтверждение рецидива заболевания. Пациенткам с рецидивом заболевания назначали химиотерапию второй линии. За пациентками, у которых рецидив заболевания был зарегистрирован во время исследования, последующее наблюдение не проводилось.
При определении уровня экспрессии ганглио-зидов мы получили достоверные различия в уровне экспрессии дисиалоганглиозидов GD3 и GD1a. Клетки, экспрессирующие дисиалоганглиозиды, при раке яичников представлены на рисунках 1 и 2. Экспрессия дисиалоганглиозида GD3 в опухолевой ткани рака яичника у пациенток основной группы оказалась достоверно ниже по сравнению с уровнем экспрессии этого маркера у пациенток контрольной группы — 2,3 ± 0,4 % и 7,2 ± 1,4 % соответственно (р < 0,05). Экспрессия дисиалоганглиозида GD1a в опухолевой ткани рака яичника у пациенток контрольной группы оказалась достоверно выше по сравнению с уровнем экспрессии этого маркера у пациенток с гиперти-реозом — 5,7 ± 1,1 % и 3,6 ± 0,6 % соответственно (р < 0,05). Уменьшение клеток с повышенной экспрессией дисиалоганглиозидов GD3 и GD1a является фактором, по-видимому, определяющим биологическую агрессивность опухоли. За время нашего наблюдения (18 месяцев) медиана времени до развития рецидива у пациенток основной группы составила 13,3 месяца. В контрольной группе медиана времени до развития рецидива за аналогичный период не достигнута. Таким образом, при анализе безрецидивного периода нами получены достоверные различия в зависимости от тиреоид-ного статуса пациенток. К моменту анализа дан-
Рис. 1. Экспрессия дисиалоганглиозида GD1а при раке яичника. Клетки, экспрессирующие дисиалоганглиозид, указаны стрелками. Иммуногистохимическое исследование, увеличение *900
Рис. 2. Экспрессия дисиалоганглиозида GD3 при раке яичника. Клетки, экспрессирующие дисиалоганглиозид, указаны стрелками. Иммуногистохимическое исследование, увеличение *900
ных мы не наблюдали случаев рецидива заболевания у 2 пациенток основной группы, получающих тиреостатики по поводу заболевания щитовидной железы. В последние годы усилия онкологов и морфологов направлены на выявление дополнительных маркеров биологической агрессивности опухолей и определение соматических заболеваний, отягощающих течение злокачественного процесса. Особенно важно именно на ранних этапах лечения определить те характеристики опухоли, которые могли бы указывать на ее биологическую агрессивность, и исходя из этого планировать метод лечения. Также важно выявить определенные соматические заболевания, которые влияют на течение опухолевого процесса и лечение которых способствует увеличению общей относительной выживаемости. Новые интересные данные касаются факта, что опухоли, характеризующиеся низким уровнем экспрессии определенных типов ассоциированных с опухолью антигенов углеводной природы (TACAs-tumor-associated carbohydrate antigens), демонстрируют больший метастатический потенциал и склонность к прогрессирова-нию, чем опухоли, обладающие более высоким уровнем TACAs, что отражается на выживаемости пациентов. Хорошо документированные примеры таких TACAs — это моносиалоганглиозиды GM3, GM2 и дисиалоганглиозиды GD2 и GD3 в опухолях эпителиального происхождения [22]. Биохимические и молекулярные механизмы, посредством которых вышеупомянутые изменения состава гликозидов увеличивают или снижают
метастатическии потенциал опухоли и инвазию, в полноИ мере неизвестны. Хотя многими авторами признается, что биологическая агрессивность опухолеИ, проявляющаяся в инвазивном росте и метастазировании, тесно связана с изменением адгезивных своИств опухолевых клеток. Имеются данные, что некоторые ганглиозиды функционируют как эпитопы E-селектина, вызывая взаимо-деИствие опухолевых клеток с эндотелиальными, некоторые опухолевые клетки взаимодеИствуют через связывание TACA с определенными белкам (кроме селектинов), или к определенным углеводным остаткам, экспрессирующимся на эндоте-лиальных клетках или других клетках-мишенях (углеводно-углеводное взаимодействие). Также ганглиозиды принимают участие в функциональ-ноИ модификации адгезизивных рецепторов (ин-тегрин, кадерин, CD44), обеспечивающих инвазию опухоли [19].
Повышенные уровни общего количества ган-глиозидов в плазме и в асцитическоИ жидкости отражают потерю или секрецию ганглиозидов с поверхности клеток рака яичников. Данный процесс является следствием нарушения биосинтеза ганглиозидов вследствие изменения гликосфин-голипидного обмена в клетках опухоли и изби-рательноИ секреции (шеддингом) ганглиозидов с поверхности опухолевых клеток. Секреция ган-глиозидов может играть важную роль в ингибиро-вании противоопухолевого иммунитета, которыИ обычно имеет место при распространенном раке яичников [8, 18].
оригинальные статьи
es
выводы
С учетом формирующейся стратегии гипертире-оз является не только фактором риска по возникновению гормонально зависимых опухолей, но и фактором, отягощающим течение рака яичника.
ЛИТЕРАТУРА
1. Чиссов В. И., Старинский В. В., Петрова Г. В. Состояние онкологической помощи населению России в 2010 году. - М., 2011. - 188 с.
2. Cristofanilli M., Yamamura Y, Kau S.-W. et al. Thyroid hormone and breast carcinoma. Primary hypothyroidism is associated with a reduced incidence of primary breast carcinoma // Cancer. - 2005. -Vol. 103. - P. 1122-1128.
3. De Vito P., Incerpi S., Pedersen J.Z. et al. Thyroid hormones as modulators of immune activities at the cellular level // Thyroid. - 2011. - Vol. 21 (8). -P. 879-890.
4. Garfield D. H, Wolter P., Schöffski P. et al. Documentation of Thyroid Function in Clinical Studies With Sunitinib: Why Does It Matter? // J. Clin. Oncol. -2008. - Vol. 26 (31). - P. 5131-5133.
5. Hercbergs A.A., Goyal L. K, Suh J. H, Lee S. et al. Pro-pylthiouracilinduced chemical hypothyroidism with highdose tamoxifen prolongs survival in recurrent high grade glioma: a phase I/II study // Anticancer Res. - 2003. - Vol. 23. - P. 617-26.
6. Hu D., Man Z, Wang P. Ganglioside GD1a negatively regulates matrix metalloproteinase-9 expression in mouse FBJ cell lines at the transcriptional level // Connect Tissue Res. - 2007. - Vol. 48 (4). - P. 198-205.
7. Linetsky E., Hercbergs A. A, Dotan S. et al. Time to tumor progression (TTP) and quality of life (QOL) following propylthiouracil induction of chemical hypothyroidism in failed malignant gliomas // Abstracts from the World Federation of Neuro-Oncology Second Quadrennial Meeting and the Sixth Meeting of the European Association for Neuro-Oncology. -Edinburgh, U. K., 2005. - 318 p.
8. McKallip R., LiR., Ladisch S. Tumor gangliosides inhibit the tumor-specific immune response // J. Immunol. 1999. - Vol. 163 (7). - P. 3718-26.
9. Mittra I., HaywardJ.L. Hypothalamic-pituitary-thy-roid axis in breast cancer // Lancet. - 1974. - 1. -P. 885-889.
10. Mousa S.A., O'Connor L, Davis F. B, Davis P.J. Proan-giogenesis action of the thyroid hormone analog 3,5-diiodothyropropionic acid (DITPA) is initiated at the cell surface and is integrin mediated // Endocrinology. - 2006. - Vol. 147 (4). - P. 1602-1607.
11. Ness R. B, Grisso J.A, Cottreau C. et al. Factors related to inflammation of the ovarian epithelium and
risk of ovarian cancer // Epidemiology. - 2000. -Vol. 11. - P. 111-17.
12. O'Donneíí A.J, Macleod K. G., Burns D.J. et al. Estrogen receptor-a mediates gene expression changes and growth response in ovarian cancer cells exposed to estrogen // Endocr ReLat Cancer. - 2005. - Vol. 12. -P. 851-866.
13. Ozols R. F, Bundy B. N., Greer B. E. et al. Phase III trial of carboplatin and paclitaxel compared with cispla-tin and paclitaxel in patients with optimally resected III stage, ovarian cancer: a Gynecologic Oncology Group study // J. Clin. Oncol. - 2003. - Vol. 21 (17). - P. 3194-200.
14. Rae M. T., Gubbay O., Kostogiannou A. et al. Thyroid hormone signaling in human ovarian surface epithelial cells // J. Clin. Endocrinol Metab. - 2007. - Vol. 92 (1). - P. 322-327.
15. Ravindranath M. H., Muthugounder S., Presser N. et al. Immunogenic gangliosides in human ovarian carcinoma // Biochem Biophys Res Commun. - 2007. -Vol. 353 (2). - P. 251-258.
16. Prinetti A, Aureli M., Illuzzi G. et al. GM3 synthase overexpression results in reduced cell motility and in caveolin-1 upregulation in human ovarian carcinoma cells // Glycobiology. - 2010. - Vol. 20 (1). - P. 62-77.
17. Prinetti A, Millimaggi D., D'Ascenzo S. et al. Lack of ce-ramide generation and altered sphingolipid composition are associated with drug resistance in human ovarian carcinoma cells // Biochem J. - 2006. -Vol. 395 (23). - P. 11-18.
18. Santin A. D., Ravindranath M. H., Bellone S. et al. Increased levels of gangliosides in the plasma and ascitic fluid of patients with advanced ovarian cancer // J. Obstet. Gynaec. - 2004. - Vol. 111 (6). -P. 613-618.
19. Saqr H. E., Pearl D. K., Yates A.J. A review and predictive models of ganglioside uptake by biological membranes // J Neurochem. - 1993. - Vol. 61 (2). -P. 395-411.
20. Shih C., Chen S., Yen C. et al. Thyroid hormone receptor-dependent transcriptional regulation of fi-brinogen and coagulation proteins // Endocrinology. 2004. - Vol. 145. - P. 2804-2814.
21. Tang H. Y., Lin H. Y., Zhang S. et al. Thyroid hormone causes mitogen-activated protein kinase-dependent phosphorylation of the nuclear estrogen receptor // Endocrinology. - 2004. - Vol. 145 (7). - P. 326572.
22. Tolomeo, M., Simoni, D. Drug resistance and apop-tosis in cancer treatment: development of new apoptosis-inducing agents active in drug resistant malignancies // Curr Med Chem Anti-Canc Agents. -2002. - Vol. 2 (3). - P. 387-401.
66
оригинальные статьи
23. Turken O., Narln Y., Demlrbas S. et al. Breast cancer in association with thyroid disorders // Breast Cancer Res., 2003. - Vol. 5. - P. 110-113.
EPITHELIAL OVARIAN CANCER AND ALTERED THYROID STATUS
Glushakov R. I., Lisyanskaya A. S., Proshin S. N., Tapilskaya N. I.
♦ Resume. The expression level of the gangliosides GD1a and GD3 in patients with advanced ovarian cancer and hyperthyroidism was studied. The disease-free survival rate in this group was compared. The expression levels were determined by immunohistochemistry. Immunohistochemistry detection revealed decreased expression of disialogangliosides GD3 and GD1a in patients with advanced ovarian cancer and hyperthyroidism. We have shown difference in disease-free survival depending on the thyroid status of patients..
♦ Key words: advanced ovarian cancer; gangliosides; hyper-thyroidism.
♦ Информация об авторах
Глушаков Руслан Иванович - аспирант. Кафедра онкологии ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития РФА. 194100, г. Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2. Е-таН: glushakovruslan@gmail.com.
Лисянская Алла Сергеевна - кандидат медицинских наук, заведующая. Онкогинекологическое отделение. Городской клинический онкологический диспансер. 197022, Санкт-Петербург, 2-я Березовая аллея, д. 3/5. Е-таН: glushakovruslan@gmail.com.
Прошин Сергей Николаевич - доктор медицинских наук. ГБОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И. И. Мечникова. 195067, Россия, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47. E-mail: psnjsn@rambler.ru.
GlushakovRuslan I. — postgraduate student. Department of oncology. Saint Petersburg State Pediatric Medical Academy. Litovskaja st., 2, Saint Petersburg 194100 E-mail: glushakovruslan@gmail.com.
Lisyanskaya Alla S. — PnD, Head of the Department of gynecology. Saint-Petersburg Municipal Clinical Oncology Center. alleya Berezovaya 3/5, Saint Petersburg 197022 E-mail: glushakovruslan@gmail.com.
Proshin Sergey N. — M.D. Northwestern State Medical University I. I. Mechnikov. PiskarevskijProspekt, 47, Saint-Peterburg, 195067.
E-mail: psnjsn@rambler.ru.
Тапильская Наталья Игоревна — д. м. н., профессор. Кафедра Tapilskaya Natalya I. — M.D., professor. Department of oncology.
онкологии ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития РФА. Saint Petersburg State Pediatric Medical Academy.
194100, г. Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2. Litovskaja st., 2, Saint Petersburg 194100
E-mail: tapnatalia@ya.ru. E-mail: tapnatalia@ya.ru.
