CC BY
12
УДК 541.15
РАДИАЦИОННО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ 2,6-ДИ-ТРЕТБУТИЛ-4-МЕТИЛФЕНОЛА В ВОДНЫХ СУСПЕНЗИЯХ ЛИПОСОМ
Е.А. Антонова, Д.В. Парамонов
(лаборатория радиационной химии)
В работе приведены экспериментальные результаты по радиационно-химическому разложению ионола и выходу продуктов его деструкции в липидной мембране лецитиновых липо-сом в зависимости от качественного и количественного состава радикалов, образующихся в водной фазе.
Известно, что воздействие ионизирующего излучения на живые системы связано, главным образом, с косвенным действием излучения и осуществляется промежуточными продуктами радиолиза воды [1], содержание которой в биологических системах составляет 70-80%. Большой экспериментальный материал дает основание предполагать, что мембраны клетки являются важной мишенью действия излучения, а их поражение существенным образом сказывается на выживаемости клетки [2]. Однако конкретная роль тех или иных химически активных продуктов радиолиза воды (ионов, возбужденных молекул, активных радикалов) в механизме разрушения клеточных мембран остается неясной. Поскольку структура, хими-
ческий состав, толщина, проницаемость клеточных мембран для клеток разной природы и дифференцировки различны, для изучения реальных клеточных систем необходимо предварительно провести исследования на моделирующих их объектах.
С целью моделирования воздействия ионизирующего излучения на биологические мембраны и защиты последних от активных продуктов радиолиза воды были проведены исследования модельных систем, представляющих собой водные суспензии лецитиновых липосом. Интерес к липосомам с включенным в липидный бислой неселективным акцептором радикалов определяется еще и тем, что липосомы являются перспективными формами дос-
тавки в ткани и органы лекарственных препаратов, которые в свою очередь требуют предварительной стерилизующей обработки (а один из эффективных способов стерилизации - радиационный). В литературе обсуждается вопрос в основном о радиационной химии липидов, составляющих мембрану липосомы [3, 4], а по радиационному разрушению включенных в липидный бислой акцепторов, которые могут имитировать действие естественных антиоксидантов, публикаций значительно меньше [5]. Липосомальные частицы, приготовленные из фосфолипида - структурного элемента клеточной мембраны, содержали в липидном бислое нерастворимый в воде антиоксидант фенольного типа - 2,4-ди-да^еда-бутил-6-метилфенол (ионол), широко применяемый в промышленности, медицине и исследованиях.
Методика эксперимента
Для приготовления водных суспензий липосом к известной навеске сухого яичного лецитина (Ь-а-фосфати-дилхолина), содержащего ионол, добавляли дистиллированную воду и полученную гетерогенную систему озвучивали с помощью ультразвукового дезинтегратора «УЗДН-2Т» с частотой 22+1.65 кГц в кавитационном режиме в стеклянной ячейке на воздухе. Поглощенная мощность менялась от 1.8 до 2.4 Вт/см3. Перед озвучиванием и через каждую минуту озвучивания раствор охлаждали до 5-8оС. Суммарное время озвучивания составляло 12 мин.
Таким образом были приготовлены суспензии липо-сом (4.8 г лецитина в 1 л суспензии) с размером частиц Я = 5020 нм и содержанием 2.4.10-4 моль ионола в 1 г лецитина. Размер частиц контролировали по спектру мутности [6].
Суспензии липосом облучали на кобальтовой установке «РЦ-100М» с мощностью дозы, равной 110 Гр/мин (диапазон поглощенных доз варьировался в пределах до 6-7 кГр), в барботажном (кислородом воздуха или закисью азота) или в дезаэрированном режимах. Дезаэриро-вание проводили методом барботирования через объем суспензии (15-20 мл) азота в течение 20 мин.
Анализ антиоксиданта и продуктов его превращения проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ): хроматограф «Миллихром», колонка I = 64, й = 2 мм, заполненная силосорбом С18, элюент - смесь спирта и воды (87 и 13 об.%). Наличие спектро-фотометрического детектора и специального устройства позволяло записать ультрафиолетовый спектр вещества в момент прохождения его через кювету. Степень превращения ионола колебалась в пределах 60+20 % в зависимости от поглощенной суспензией дозы.
Экспериментальные результаты и обсуждение
Яичный лецитин - это амфифильное соединение, содержащее полярную гидрофильную и неполярную гидрофобную группировки. Гидрофильная группа, являясь цвиттерионом, имеет положительный заряд на атоме азота холинового остатка и отрицательный на кислороде фосфорной кислоты, образующей двузамещенный эфир. Неполярная гидрофобная часть представляет собой остатки жирных кислот (С16, С18) различной насыщенности. Молекулы лецитина в воде образуют гетерогенные структуры, выделяясь в отдельную фазу. При обработке данной системы ультразвуком происходит формирование концентрических бислойных везикул, в которых гидрофильные группы обращены в водную фазу, а остатки жирных кислот образуют самостоятельную гидрофобную область. Практически нерастворимый в воде ионол (его концентрация в насыщенном водном растворе при комнатной температуре, определенная с помощью ВЭЖХ, составляет ~210-5 моль/л) находится в гидрофобной части липосомы.
При облучении водных суспензий липосом, содержащих в 1 л суспензии 4.8 г лецитина и 0.26 г ионола, 99.5% у-излучения поглощается водной фазой и протекание радиационно-химических процессов в липосоме связано, главным образом, с косвенным действием ионизирующего излучения. Можно полагать, что наибольшее разрушение липосомы будут вызывать радикалы, образующиеся при радиолизе воды (Н' ОН, НО'2/О-2), и в меньшей степени - е-^. Реакционная способность сольватиро-ванных электронов относительно ионола мала [7], но с лецитином они могут реагировать с константой скорости порядка 107 - 108 л/моль.с. Так, холин, являющийся соТ а б л и ц а 1
Радиационно-химическое разложение ионола и выход его продуктов
Номер системы Качественный состав радикалов в дисперсной среде Радиационно-химический расход ионола, молек/100 эВ Радиационно-хи-мический выход радикалов в водной фазе [9], частиц/100 эВ °пр, молек/100 эВ
1 ОН 0.7+0.1 6-6.5 -
2 НО 2/О2- 0.9+0.2 6-6.5 0.4 0.1
3 ОН НО 2 1.3+0.3 3 и 3.5 0.5 0.1
4 ОН, Н и е aq 0.6+0.1 3, 0.5 и 3 -
ставной частью молекулы лецитина, реагирует с е с
7
константой скорости 8.10 л/моль.с [8].
Расход акцептора радикалов - ионола в процессе облучения свидетельствует о воздействии активных частиц радиолиза воды на гидрофобную и гидрофильную части липосомы и на сам ионол.
В работе были исследованы 4 дисперсные системы, в которых необходимый качественный и количественный состав радикальных частиц в дисперсной среде достигался варьированием насыщающего газа (таблица).
Во всех системах наблюдали уменьшение концентрации ионола во время облучения. Из зависимости изменения концентрации ионола от поглощенной дозы был определен радиационно-химический расход ионола путем экстраполяции к нулевой дозе. Зависимость расхода ионо-ла от поглощенной системой дозы была линейной в пределах ошибки эксперимента.
Первая дисперсная система (система 1) была приготовлена путем насыщения водного раствора липосом ^О. При воздействии ионизирующего излучения в дисперсионной среде протекают процессы с образованием следующих основных радиолитических частиц:
Н2О ® Н' , ОН, е
N0 ® ОН + ОН-
N
О2 ® О2 '
Н + О2 ® НО, ,
СН3СН2ОН + ОН'
о2 ® сн3сно + НО2
Н2О,
НО
Н+
О
трам, снятым на пике выхода вещества в процессе хрома-тографического разделения. УФ-спектр поглощения продукта превращения ионола в водных суспензиях, насыщенных кислородом, оказался идентичен спектру поглощения димера, образованного рекомбинацией фенок-сильного и циклогексадиенильного радикалов (I) (Атах1 2230; 282 нм [10]), а в водно-этанольных суспензиях -спектру продукта (II) (Я - 234 нм [11]).
ООН
С I )
I 1Т}
Радиационно-химический механизм разрушения ионо-ла и образования продуктов его превращения схематично можно представить следующим образом. В суспензиях, насыщенных ^О, и в дезаэрированных системах расход ионола связан с протеканием реакций
(1) (2)
Таким образом, радикал ОН в этой системе является единственной радикальной частицей, реагирующей с ли-посомой. Влиянием радикала Н в этой системе в первом приближении можно пренебречь, так как его выход составляет примерно 10% от выхода ОН .
С целью изучения взаимодействия радикала НО'2/О-2 с липосомами и с ионолом, включенным в липидный бис-лой, в воду добавляли 0.2 моль/л этанола и аэрировали суспензию во время облучения (система 2). В водно-эта-нольных суспензиях протекают следующие радиационно-химические процессы:
ОН'(Н') + ЬесН ® Н2О (Н2) + Ьес', Ье^ + РЮИ ® ЬесИ + РЬО\ ОН(Н) + РЮИ ® И20 (И2) + РЬО. Ьес' + Ьес' ® Продукт, Ьес' + РЬО* ® Продукт .
(7)
(8) (8а)
(9) (10)
(3)
(4)
(5)
(6)
22
В аэрированных водных суспензиях растворенный кислород (2.7.10^моль/л), акцептируя все радикалы Н' и е-ац, трансформирует их в НО'2/О-2 [9], которые одновременно с ОН воздействуют на липосому (система 3).
Продукты превращения ионола были обнаружены во второй и третьей дисперсных системах. Их идентификацию проводили по временам удерживания и по УФ-спек-
Вопрос о том, может ли ионол разрушаться непосредственно ОН-радикалами, остается невыясненным, так как не совсем ясно, как располагаются молекулы ионола в липидном бислое и как их количество влияет на саму структуру бислоя. В дезаэрированных водных суспензиях основными радикальными частицами, разрушающими ли-посому, являются Н и ОН . Однако, как видно из таблицы (система 4), при выходе радикальных частиц 3.5 радикалов/100 эВ радиационно-химический расход ионола практически тот же, что и в системе 1, хотя выход радикалов Н и ОН в два раза меньше. Такой эффект можно объяснить взаимодействием е- с холиновой группой лецитина (11) с образованием метильного радикала [12], который в свою очередь по реакции (12) разрушает ионол (К = 4.103 л/моль.с) [13].
Я-К+ (СИ3)3 + еац ® Я-К(СИ3)7 + СН'3
РЮИ + СН3 ® РЮ' + СИ4.
(11)
(12)
В суспензиях, содержащих только О2 или этанол и О2, феноксильные радикалы могут гибнуть или в реакциях димеризации (16), или в реакциях, приводящих к образованию продукта (II) (17).
Lec' + О2 ® LecOO' , (13)
LecOO" + PhOH ® LecOOH + PhO, (14)
LecOO + PhO ® Продукт , (15)
PhO' + PhO' ® Димер (I) , (16)
PhO' ® Продукт (II). (17)
Продукты рекомбинации фенокс ильного радикала с Ьес'- и ЬесОО'-радикалами в данных условиях анализа регистрировать невозможно, однако на основании литературных данных по радиационно-химическим превращениям ионола в углеводородных средах [14] их образование можно предположить. Анализируя экспериментальные результаты по зависимости радиационно-химического разложения ионола и выхода продуктов его превращения от качественного и количественного состава радиолитичес-
ких частиц водной фазы, можно заметить, что системы 1 и 4 кардинально отличаются от систем 2 и 3. Так, при воздействии Н'- и ОН'-радикалов предположительными продуктами могут быть соединения, являющиеся результатом рекомбинации феноксильного и лецитинового радикалов. Изменяя условия эксперимента таким образом, что в системе появляется радикал НО'2/О-2 , мы изменяем и качественный состав продуктов превращения ионола. В данном случае происходит преимущественная рекомбинация феноксильных радикалов либо друг с другом, либо трансформация феноксильных радикалов в продукт (II).
Представляет интерес тот факт, что все феноксильные радикалы, образующиеся в системе 3, гибнут в основном в реакциях рекомбинации друг с другом. Выход ди-мера (I) примерно в два раза ниже расхода ионола.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований ( код проекта 95-03-09162).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Khare S., Jayakumar A. et al. // Rad. Res. 1982. 90. P. 233.
2. Коломийцева И.К. Радиационная биохимия мембранных
липидов. Сер. Теоретическая и прикладная биофизика. М., 1989. С. 181.
3. Stark R.K. // Biochim.Biophys. Acta. 1991. 1071. P. 103.
4. Erriu G, Ladu M, Meleddu G. // Biophys. J. 1981. 35. P. 799.
5. Kale R.K., Sitasawad S.L. // Ind. J. Exper. Biol. 1991. 29.
P. 778.
6. Генкин M.B., Уланов Б.П. и др. // ЖФХ. 1987. 61. С. 220.
7. Brede O., Ilermann R., Mehnert R. // Radiat. Phys. Chem. 1986.
28. P. 507.
8. Buxton G.V. // J. Phys. Chem. Ref. Data. 1988. 17. P. 513.
9. Пикаев A.K. Современная радиационная химия. M., 1986.
С. 203.
10. Mueller E, Ley K., Schlechte G. // Chem. Ber. 1957. 90. P. 2660.
11. Антонова E.A., Жиркова O.A. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1993. 34. С. 213.
12. Егоров Г.Ф. Радиационная химия экстракционных систем. М., 1986. С. 208
13. Антонова Е.А. // Химия высоких энергий. 1996. 30. C. 58.
14. Антонова Е.А., Трощилова Т.Ф. // Вести Моск. ун-та. Сер.2. Химия. 1993. 34. С. 157.
Поступила в редакцию 16.12.97
