CC BY
0
ПУТЬ ТРАНСФОРМАЦИИ ЛАКТОЗЫ В ЭТАНОЛ ДРОЖЖАМИ КЬиУУЕЯОМУСЕ8 ЬАСТ18
Е.С. Лушникова, студент
Волгоградский государственный университет
(Россия, г. Волгоград)
DOI:10.24412/2500-1000-2024-4-4-20-23
Аннотация. В настоящем исследовании представлены результаты анализа ферментативного процесса переработки лактозы в этанол дрожжами Kluyveromyces lactis. Актуальность исследования обусловлена недостатком структурированных данных о полном каталитическом пути биотрансформации лактозы в этанол дрожжами K. lactis. В ходе исследования был проведен анализ структуры и свойств ферментов, участвующих в данном процессе. Выяснилось, что осуществляемый процесс проходит в 9 этапов с участием 9 ферментов. Исследование позволило составить наглядную таблицу каталитических реакций, участвующих в процессе переработки лактозы в этанол дрожжами K. lactis.
Ключевые слова: Kluyveromyces lactis, трансформация лактозы в этанол, молочная сыворотка, подсырная сыворотка, переработка лактозы.
На предприятиях, выпускающих творожную и сырную продукцию, ежедневно образуются тонны побочного продукта -сыворотки, содержащей большое количество лактозы. Значительная часть данного продукта утилизируется в окружающую среду, нанося ощутимый ущерб окружающей среде [1].
Трансформация лактозы в этанол помогает завершить цепочку переработки молока, принося дополнительную прибыль и частично решает проблему утилизации лактозосодержащего сырья [2]. В качестве катализаторов ферментации лактозы используют дрожжи Kluyveromyces lactis [3].
Цель исследования - анализ ферментативного пути трансформации лактозы в этанол дрожжами Kluyveromyces lactis.
Для проведения теоретического исследования биотрансформации лактозы в этанол дрожжевыми культурами K. lactis использовалась информация из открытых баз данных белков и ферментов (KEGGA, NCBI, SCOP, UniProt).
Для биотрансформации молочной сыворотки в этанол дрожжи Kluyveromyces lactis сначала осуществляют гидролиз лактозы в глюкозу и галактозу, затем метабо-лизируют глюкозу по окислительному пентозофосфатному пути. В результате ряда ферментативных превращений обра-
зуется ацетил-фосфат, восстановление которого в два этапа приводит к появлению молекулы этилового спирта [4].
В начале пути выработки биоэтанола из молочной сыворотки происходит гидролиз дисахарида лактозы ферментом из семейства Р-галактозидаз - лактазы. Лактаза представляет собой экзогликозидазу, которая гидролизует бета-1 -4-гликозидную связь, образованную между молекулами галактозы и глюкозы. Является четвертичной структурой, свёрнутой по классической для ферметов семества GH2 схеме. Состоит из 1025 аминокислот, в последовательности которых определяется в 5 доменов.
В результате, из молекулы лактозы образуется по одной молекуле галактозы и глюкозы за счёт расщепления Р-галактозидных связей. Далее, фермент гексокиназа катализирует фосфорилирова-ние D-глюкозы с использованием энергии АТФ, результатом которой является образование глокозо-6-фосфата. Гексокиназа относится к классу трансфераз и обладает способностью переносить неорганическую фосфатную группу с АТФ на субстрат. Длина последовательности состоит из 475 аминокислот.
Далее происходит окисление глюкозо-6-фосфата с помощью фермента из группы
оксидоредуктазы - глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы. G6PD представляет собой цитозольный фермент - первый фермент, катализирующий реакцию пенто-зофосфатного гликолиза, восстановливая НАДФ до НАДФН. Состоит из 515 аминокислот и обычно находится в виде димера двух идентичных мономеров.
Затем происходит реакция гидролиза 6-фосфоглюконо-5-лактона до 6-фосфоглюконата с помощью 6-фосфоглюконолактоназы посредством переноса протона на атом кислорода в кольце O5. 6PGL является цитозольным ферментом, относящемся к классу гидролазы. Третичная структура 6PGL состоит в виде а/р-гидролазной складки с остатками активного центра, сгруппированными на петлях а-спиралей. Состоит из 321 аминокислоты.
Следующим шагом в процессе является декарбоксилирующиее востановление 6-фосфоглюконата в рибулозо-5-фосфат в присутствии НАДФ ферментом 6-фосфоглюконатдегидрогеназа. 6PGD принадлежит к группе окислительных декар-боксилаз. Является гомодимером и содержит смешанный параллельный и антипараллельный 6-цепочечный бета-лист. 6PGD состоит из высококонсерватиной последовательности 492 аминокислот.
Следующий этап неокислительной фазы пентозофосфатного пути - это взаимное превращение между D-рибулозо^-фосфатом и D-ксилулозой-5-фосфатом с помощью фермента фосфопентозэпимера-зы, принадлежащей к семейству изомераз. Кроме того, в базе данных Structural
Classification of Proteins (SCOP) определено суперсемейство «связывания рибулозо-фосфата», членом которого является эта эпимераза. PPE существует в виде гомо-димера, который сворачивается в бочкообразную структуру р/а. PPE состоит из 327 аминокислот.
Затем происходит активация фосфоке-толазой реакции расщепления D-ксилулозо-5-фосфата на ацетил-фосфат. Фосфокетолаза может использовать 3 различных сахарофосфата в качестве субстратов и лишь один кофактор - дифосфат тиамина. Фермент имеет бочкообразную структуру TIM (а/р баррель).
Далее происходит двухэтапное восстановление ацетилфосфата до этилового спирта. С помощью фосфатацетилтранс-феразы ацетил-фосфат дефосфорилируется до уксусного альдегида. Фосфатацети-лтрансфераза принадлежащит к семейству ацилтрансфераз, передающим группы, отличные от аминоацильных групп. Пептидная последовательность из 714 аминокислот сворачивается в третичную структуру белка а+р.
Последним этапом происходит окисление ацетальдегида до этанола, катализируемое алкогольдегидрогеназой. ADH1 -фермент семейства оксидоредуктаз, катализирующих окисление первичных и вторичных спиртов до альдегидов и кетонов. ADH1 содержит цинк в своем каталитическом центре. Состоит из 350 аминокислот.
В таблице указана общая информация о протекающих в ходе процесса биотрансформации лактозы в этанол реакций.
Таблица. Процесс биотрансформации лактозы в этанол с указанием принимавших участие веществ и ферментов___
Субстраты Продукты Фермент Описание
Лактоза Глюкоза и галактоза Лактаза, EC 3.2.1.108 Гидролиз дисахарида лактозы на глюкозу и галактозу.
Глюкоза + ATP Глюкозо-6-фосфат + Н+ + АЭР Гексокиназа, EC 2.7.1.1 Реакция фосфорилирования глюкозы с использованием энергии АТФ.
Глюкозо-6-фосфат + NADP+ 6-фосфоглюконо-5-лактон + ЫЛОРИ + И+ Глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназа, EC 1.1.1.49 Гидрирование. Гидроксильная группа при первом атоме углерода глюкозо-6-фосфата превращается в карбонильную, образуя лактон, при этом гакже происходит восстановление NADPH.
6-Фосфо-глюконо-5-лактон + H2O 6-фосфоглюконат + Н+ 6-Фосфо-глюконо-лактоназа, EC 3.1.1.31 Гидролиз 6-Фосфоглюконо-5-лактона до 6-фосфоглюконата.
6-Фосфо-глюконат + NADP+ Э-рибулозо-5-фосфат 6-Фосфо-глюконат- 6РвБ катализирует и дегидрирование, сопровождающееся восстановлением NADP, и декарбоксилирование.
+ МАОРИ + Н+ + СО2 цегидрогеназа, EC 1.1.1.44
D-рибулозо-З-фосфат Э-ксилулозо-5-фосфат Фосфопентоз-эпимераза, EC 5.1.3.1 Превращение изомера Э-рибулозо-5-фосфата в Э-ксилулозо-5-фосфат.
D-ксилулозо- 5-фосфат + фосфат Ацетил-фосфат + Э- глицеральдегид-3 -фосфат + Н2О ФосфокетолазаЕС 4.1.2.9 Расщепление ксилулозо-5-фосфат до ацетил-фосфата.
Ацетил-фосфат Ацетальдегид Фосфатацетил-трансфераза, EC 2.3.1.4 Перенос ацетильной группы от ацетил-фосфат до ацетальдегида.
Ацетальдегид + NADH + H+ Этанол + МЛЭ+ Алкоголь-дегидрокиназа, EC 1.1.1.1 Восстановление ацетальдегида до этанола.
Описание структурной характеристики опорные данные для применения процесса ферментов Kluyveromyces lactis, участву- в молочной промышленности с целью поющих в биотрансформации лактозы в эта- лучения экономической выгоды и предот-нол позволит получить подробное пред- вращения ущерба окружающей среде. ставление о данном процессе, и создать
Библиографический список
1. Исина, Н.Ю. Финансовый механизм внедрения эколого-ориентированной технологии переработки молочной сыворотки / Н.Ю. Исина // Труды Костромской государственной сельскохозяйственной академии. - 2020. - № 90. - С. 111-119.
2. Fermentation of lactose to ethanol in cheese whey permeate and concentrated permeate by engineered Escherichia coli / Pasotti L., Zucca S., Casanova M., ect. // BMC Biotechnology. -2017. - №17. - С. 48.
3. Молекулярный полиморфизм генов Р-галактозидазы LAC4 у молочных и природных штаммов дрожжей Kluyveromyces / Л.В. Лютова, Г.И. Наумов, А.В. Шнырева и др. // Молекулярная биология. - 2021. - Т. 55, №1. - С. 75-85.
4. Микробиология: Учебник для студентов биологических специальностей вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева // - 4-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 464 с.
PATHWAY OF LACTOSE TO ETHANOL TRANSFORMATION BY THE YEAST
KLUYVEROMYCES LACTIS
Е.S. Lushnikova, Student Volgograd State University (Russia, Volgograd)
Abstract. This study presents the results of analyzing the enzymatic process of lactose conversion to ethanol by the yeast Kluyveromyces lactis. The relevance of the study is due to the lack of structured data on the complete catalytic pathway of lactose biotransformation into ethanol by K. lactis yeast. The study analyzed the structure and properties of enzymes involved in this process. It was found out that the realized process takes place in 9 stages with the participation of 9 enzymes. The study made it possible to draw up a visual table of catalytic reactions involved in the processing of lactose into ethanol by Kluyveromyces lactis yeast.
Keywords: Kluyveromyces lactis, transformation of lactose to ethanol, whey, cheese whey, lactose conversion.
