CC BY
18УДК57.083.18:577.214.3:543.51
ПЦР С ЭЛЕКТРОСПРЕЙ-ИОНИЗАЦИОННОЙ МАСОСПЕКТРОМЕТРИЕЙ В ОБНАРУЖЕНИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ГЕМОКУЛЬТУРАХ
Васильева Н.В. (директор института), ^олищук А.Г. (зав. лаб.)*, Руднева М.В. (м.н.с.), ^акс A.A. (н.с.), ^урпицкая O.A. (зав. лаб.), 23айцева М.М. (студент)
1 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова; 2Санкт-Петербургский государственный политехнический университет (отделение медицинской физики и биоинженерии), Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2013
Цель данного исследования - оценка эффективности PLEX-ID платформы, основанной на технологии полимеразной цепной реакции (PCR) с электроспрей-ионизационной время-пролетной (ESI-TOF) масс-спектрометрией (MC), для обнаружения, идентификации и выявления видового разнообразия патогенных микроорганизмов в образцах крови пациентов с подозрением на инфекцию кровотока. 168 гемокультур, полученные в течение трех месяцев, были исследованы с использованием PLEX-ID. Из них 74 были зарегистрированы в аппарате BacT/Alert 3D (ЫоМёпеих) как положительные и 94 - как отрицательные. При сравнении полученных результатов с результатами классической микробиологической идентификации выявили их совпадение в 90,8% и 76% случаев на уровне рода и вида соответственно. Более одного вида микроорганизма было обнаружено в 10 из 74 (13,5%) образцов с помощью PLEX-ID и в 4-х образцах (4%) - с помощью культу-рального метода. Время идентификации бактерий с использованием PLEX-ID платформы уменьшилось, как минимум, на 24 часа, а грибов рода Candida - на 48 ч.
Ключевые слова: гемокультура, пациенты с сепсисом, PLEX-ID, ПЦР с электроспрей-ионизационной время-пролетной масс-спектрометрией
PCR-ELECTROSPRAY IONIZATION MASS-SPECTROMETRY FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF PATHOGENIC MICROORGANISMS FROM BLOOD CULTURE
1 Vasilyeva N.V. (director of the institute), ^olischouk A.G. (head of the laboratory),1 Rudneva M.V. (junior scientific collaborator),1 Daks A.A. (scientific collaborator),1 Shurpickaya O.A. (head of the laboratory),2 Zajceva M.V. (student)
1 Kashkin Research Institute of Medical Mycology, North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov;2St. Petersburg State Polytechnical University (Department of medical physics and bioengineering), St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2013
The aim of this study was to evaluate the performance of the PLEX-ID platform based on PCR amplification coupled with electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry (PCR/ESI-TOF MS) for detection, identification, and determination of the distribution of pathogenic microorganisms in blood specimens obtained from patients with suspected bloodstream infections. A total of 154 whole blood cultures (74 positive and 80 negative determined by the BacT/Alert 3D instrument, bioMerieux) collected during 3 month period were evaluated using PLEX-ID and the results were compared with those obtained by microbiology culture. PLEX-ID and microbiology culture reached an agreement of 90,8% at the genus and 76% at the species levels in bacterial and candidal identification. Multiple organisms were detected in 10 out of 74 (13.5%) specimens by PLEX-ID, and in 4 (4%) by culture. Time required for bacteria and Candida species identification decreased at least for 24 h and for 48 h, respectively, when using PLEX-ID platform.
Key words: blood culture, PCR/ESI-TOF MS, PLEX-ID, septic patients
Контактное лицо: Полищук Анна Генриховна, Тел.: (812) 303-51-40
ВВЕДЕНИЕ
Необходимость внедрения новых технологий быстрой и точной диагностики инфекций кровотока человека - это веление времени. Идеальная технология диагностики должна обеспечивать быстрое начало направленной этиотропной терапии, для чего необходимо быстро и точно определить микроорганизм-возбудитель инфекции и оценить его устойчивость к антимикробным препаратам. В случае сепсиса у пациентов скорость диагностики - ключевой фактор, поскольку каждый час задержки эффективного лечения существенно снижает выживаемость больных [1].
Ныне культуральная диагностика является стандартом для обнаружения микроорганизмов в крови, однако существует ряд ограничений в ее применении. Видовая идентификация возбудителя бактериальной инфекции кровотока и определение его чувствительности к антибактериальным препаратам с помощью традиционных культуральных методов занимает до 3-5 суток. Для возбудителей микозов тот же анализ занимает 5-10 суток. Кроме того, культуральная диагностика не достаточно чувствительна. Результаты посева крови отрицательны более чем в 50% случаев, когда имеются клинические или/и лабораторные данные в пользу генерализованной инфекции [2]. Чувствительность культурального метода существенно снижается в случае, когда образцы крови забирают у пациента на фоне антимикробной терапии. И, наконец, с помощью классических бактериологических методов невозможно обнаружить многие потенциально опасные микроорганизмы (например, Rickettsia spp., Coxiella burnetii, Chlamydophila pneumoniae, Tropheryma whipplei) [3].
ПЦР с электроспрей-ионизационной время-пролетной (PCR-ESI-TOF) масс-спектрометрией (МС) - это новейшая молекулярная технология. Как следует из названия, она сочетает две молекулярные технологии - полимеразную цепную реакцию и электроспрей-ионизационную время-пролетную масс-спектрометрию. PCR-ESI-TOF МС технология обеспечивает возможность скрининга всех присутствующих в образце патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов и простейших) как предполагаемых, так и неизвестных без предварительного посева. Основной отличительной чертой PCR-ESI-TOF МС системы, с точки зрения технологического преимущества, является ее супермультиплексность, которая обеспечивается на стадии проведения ПЦР. Она достигается использованием праймеров к фрагментам генома, общим для представителей разных царств микроорганизмов, в сочетании с праймера-ми, специфичными для отдельных групп микроорганизмов, родоспецифичных праймеров и праймеров к участкам генома бактерий, определяющим их устойчивость к антибиотикам (обеспечивая тем самым возможность определения резистентности бактерий к данным антибиотикам). После амплификации со-
ответствующих геномных фрагментов на электроспрей-ионизационном масс-спектрометре производят автоматизированный масс-спектрометрический анализ продуктов амплификации, в ходе которого устанавливают молекулярные массы ПЦР ампли-кона и/или смеси ампликонов. Затем с помощью специального программного обеспечения прибор вычисляет нуклеотидный состав ампликона (количественное соотношение каждого нуклеотида). На основании сравнения полученных композиций ну-клеотидов с имеющимися в базе данных прибора нуклеотидными композициями, специфичными для известных видов микроорганизмов, анализируемые композиции нуклеотидов автоматически преобразуются в видовые названия микроорганизмов [4].
До 2011 года технологии PCR-ESI-TOF MC, в основном, применяли для расследования вспышек инфекционных заболеваний (например, при вспышках респираторных инфекций среди новобранцев американских вооруженных сил, находившихся в военных условиях) и генотипирования отдельных видов патогенных микроорганизмов [5, 6]. Совсем недавно опубликованы работы по характеристике генома микробов при различных локализациях у пациентов, включая пациентов лечебных стационаров [7-10].
В данном исследовании (впервые в России) использовали диагностическую платформу PLEX-ID (Abbott Molecular, США), основанную на PCR-ESI-TOF MC технологии. PLEX-ID была сертифицирована для клинического применения в Европейском Союзе (CE-mark) в апреле 2012 г.
Цель данного исследования - сравнение результатов PLEX-ID анализа и культуральных методов по точности и скорости идентификации бактерий и грибов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ
В работе использовали венозную кровь от:
1) пациентов стационаров с клиническими признаками инвазивных микозов;
2) пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) с клиническими признаками системной воспалительной реакции или с наличием клинических признаков тяжелой пневмонии, перитонита, эндокардита;
3) гематологических больных и реципиентов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) с нейропенией или иммуносупрессией, или клиническими признаками системной воспалительной реакции.
МЕТОДЫ
Забор клинического материала и получение ге-мокультур.
Взятие материала осуществляли согласно МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории».
5 мл крови помещали во флаконы с питательной
средой ВасТ-Alert (BioMérieux, Франция), флаконы, в которых не обнаруживали рост микроорганизмов в течение 7 суток, считали отрицательными.
Классические методы идентификации микроорганизмов.
Из положительных флаконов незамедлительно проводили высев на плотные питательные среды, и выделенные культуры микроорганизмов дифференцировали по совокупности свойств с помощью классических методов.
Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом {диски Beclon Dickinson, США) и на аппарате WalkAway-40 (Siemens).
Изучение микробиоты биообразцов с помощью ПЦР- ESI-TOFMC.
Экстракция ДНК микроорганизмов из гшокуль-тур,
ДНК выделяли из 1100 мкл гемокультуры но протоколу производителя. Лизис клеточного содержимого образцов проводили при помощи механического разрушения на гомогенизаторе Preceilys (Berlin Technologies, Франция) с использованием лавирующего буфера, содержащего магнитные частицы, от производителя (Abbott Molecular). Выделение и очистку ДНК производили на экстракторе Plex-SD SP (Abbott Molecular) по технологии магнитной сепарации.
Амплификация А НК
В исследовании применяли планшеты PLEX-ID платформы ВАС Spectrum ВС (Рис. 1)., ВАС Detection и Broad Fungal планшеты.
С помощью планшетов ВАС Spectrum ВС и ВАС Detection, имеющих 96-луночный формат, можно обнаруживать 3000 видов бактерий, 40 видов грибов
рода Candida, маркеры резистентности бактерий к антибиотикам: Staphylococcus spp. - к метицилли-ну (mecA), Enterococcus spp. - к ванкомицину А и В (vanA/B) и грамм-негативных бактерий - к карбапе-немам (крс). В каждой планшете можно производить анализ одновременно 6 клинических образцов, причем каждый образец наносят в 16 лунок, содержащих разные пары праймеров. Каждая лунка планшеты содержит 1ЩР смесь (от производителя), состоящую из праймеров (универсальные бактериальные, специфичные для отдельных групп бактерий и для грибов рода Candida), ДНК-цолимеразу, нуклсоти-ды, внутренний контроль (ДНК тыквы). Внутренний контроль помогает детектировать контаминацию 11ЦР и обеспечивает возможность полу количественного анализа ДНК в образцах. Универсальные прай-меры связываются с консервативными областями генома всех видов патогенных бактерий. Нуклео-тидные последовательности, фланкируемые универсальными праймерами, варьируют в зависимости от вида бактерии, что дает возможность осуществлять видовую идентификацию. Наличие дополнительных пар групп и родос пецифичных праймеров повышает точность идентификации. Очищенная ДНК каждого образца была перенесена в 16 лунок планшеты с помощью роботизированного пипсттора для раскапывания планшет (Plex-ID Fluid Handler, Abbott/Тесап). На основе планшеты Broad Fungal идентифицируют различные виды грибов» т.к. она содержит универсальные и родоспсцифичныс праймсры к фрагментам генома грибов и устроена аналогично, описанной выше. Амплификацию ДНК проводили на тср-моциклере Plex-ID ТС (Eppendorf, Германия) по программам циклирования от производителя.
Масс- спектрометра ческий анализ.
Клинические образцы (6 образцов /планшета)
i i
lííiONA
JJSIDNA Ftrmlculrt E
Stjpbyíococcui f EntttO&KteriK*»*
üjmmjpiolroi»( (nil С BtW<wmm«pro(tob*<trfi« H
14* м >44 М4 М4 m • • • • •
1« м* ш М4 Ml 14« Ж Ж © Ж я Ж
Ml Ml Ml Ml Ml Ml им IÍW )7М >7М ут mi)
м» W» 14* (44 М4 I4t • ф © А
шо # DM им DM А А Ф Ф
3249 ш 1W м г»| м 114« 1М 114» )Я 1144 )М $ А # ш Ф •
»4« 1144 >144 »44 1Ш ф • • • • •
пи »»» пи МП mi 1HI в ««п «да А 441Т «да
mrtA
ranA KPCESSL
Cjndidj KfcnlifttjliortJ
HXKiltkm
Pumpkin DfJA EMrMlion Comiot
Рис. 1. ВАС spectrum 8C планшета. Каждый образец наносят в 16 ячеек. Четыре ячейки содержат универсальные бактериальные праймеры (к участкам 16S и 23S рибосомальной ДНК бактерий), 4 ячейки - праймеры для отдельных групп и родов бактерий, 3 ячейки - праймеры к участкам генома бактерий, определяющим устойчивость к антибиотикам, 4 - праймеры к участкам ДНК грибов рода Candida, 1 - к участкам ДНК тыквы {для контроля эффективности экстракции ДНК). Цифры в кружочках - названия пар праймеров (так, например, для 16S рДНК используют 3 пары праймеров, - 346,348,361, для
амплификации трех различных участков)
Послесталии амплификации, закрытые герметично планшётыперенйймлив ЕЯ-ТО Рмасс-спектрометр для дальнейшего масс-спектр о метр и чес кого анализа а мнлифициро ванных последовательностей. На первом этапе в маее-спектрометре проводили обессо-ливание 11ЦР-продуктов, затем - анализ очищенной ДНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика полученного материала.
Материал был получен от 156 пациентов (209 образцов крови, 4 — диализата из брюшной полости, 1 -гноя из раны, 1 - ли к вора) в течение мая - ноября 2012 года из отделений интенсивной терапии и реанимации СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 15-ти клиник Санкт-! Петербурга и 1 клиники Москвы (табл. 1),
Таблица 1.
Медицинские учреждения, из которых поступил
клинический материал
Клиника Кол-во пациентов
Санкт-Петербург
СЗГМУ им. И.И.Мечникова 64
Институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. РМ. Горбачевой 20
СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова 19
Городская клиническая больница №31 7
Городская Мариинская больница 6
Городская психиатрическая больница № 3 им. И. И. Скворцов а-Степ а нов а 6
Ленинградская Областная Клиническая больница 3
Городская Покровская больница 2
Городская больница Снятой преподобномученицы Елизаветы 2
Микологическая клиника НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашки на 2
Детская городская больница №1 2
Российский нейрохирургический НИИ им. проф. АЛ. Поленова 1
Городская многопрофильная больница №2
Городская туберкулезная больница 1
Другие 5
Москва
НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского 15
Всего 156
Из учреждений Санкт-1 (етербурга большинство образцов были получены от пациентов С онкологическими заболеваниями (27%), гнойно-некротическими процессами в костях и суставах (26%) и острой почечной недостаточностью на фоне сахарного диабета 1 типа (17%) (Рис. 2).
GyptifT Острая почечная
недостаточность
Рис. 2. Клинические диагнозы пациентов, включенных в исследование
* - пациенты с неустановленным диагнозом или с несколькими диагнозами
Сравнительная характеристика ПЦР-EST TOFMC и культуральнык методов идентификации микроорганизмов.
С помощью PI.EX-ID системы было проанализировано 154 образца крови, из которых 74 были положительными и 80 — отрицательными в системе ге-МОкультивирования Bat'i-Alert. Все положительные в системе BacT-Alert образцы были также положительны при посеве.
Для 138 образцов крови результаты PCR-ESI-TOF МС были сравнены с результатами определения вида нри помощи посева на питательные среды. Для положительных образцов крови результаты идентификации микроорганизмов PCR-ESI-TOF МС и кул ьтурал ьным методом не совпали по виду обнаруженных микроорганизмов в 24% случаев, а по роду - в 9,2% (табл.2).
Таблица 2.
Случаи несовпадений идентификации микроорганизмов при использовании технологии РСР-Е51-ТОР МС и кул ьтурал ьного метода
№ Образец ПИР- E51-T0F МС Посев
1 кровь Corynebacterium coyleae Рост есть [затруднения с идентификацией м/о)
2 кровь Candida qlabrata Роста нет
3 кровь С. parapsilosis Роста нет
4 кровь Staphylococcus capitis, S. saccharolvticm S. epidermis
5 кровь S. haemolytiws Staphylococcus spp.
б кровь 5. haemolyticus Staphylococcus spp.
7 кровь S. hominis, Aerococcus viridans Staphylococcus щ.
В кровь i. epidermidis Staphylococcus spp.
9 кровь Micrococcus lylae, M. luteus Micrococcus spp.
10 кровь M. luteus Micrococcus spp.
11 кровь Acinetobacter cakoaceticus A. qenomospecies
12 той Bacillus subtitis Bacillus spp.
13 диализат из брюшной полости Trichospowninkin Рост есть [затруднения с идентификацией м/о)
14 кровь S,hominis, Aerococcus viridans Staphylococcus ърр.
15 кровь S. aureus mecA положительный (MRSA), Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus, Burklwlderia cepacia
16 кровь Коагулазонегативный Staphylococcus, [nterococcus faecalis i. epidermis, [nterococcus spp.
17 кровь Propionibacterium aaies Анаэробные кокки
18 кровь С. parapsilosis С famata
Причины несовпадения были следующие: идентификация при посеве ограничивалась родовой принадлежностью микроорганизма (№ 5-10, 12, 14, 16), микроорганизм не вырастал при посеве (№ 2,3), микроорганизм вырастал при посеве, но его идентификация была затруднена (№ 1, 13), несовпадение в определении вида при использовании технологии РСК-ЕЯ1-ТОГ МС и кул ьтурал ьного метода (№ 4, 11, 15,18).
Подтвердить видовую идентификацию бактерий, полученной с помощью РСИ -ЕЯ-ТОР МС, можно используя две молекулярные технологии — ДНК сикве-нирование и МАЬШ-ТОР масс спектрометрию. В настоящем исследовании результаты идентификации
микроорганизмов в образцах №15 и № 18 с помощью МЛ1.01-Т0Ь' МС и РЬЕХ-Ш анализов совпали. Отмстим, что другими авторами показано также соответствие результатов идентификации бактерий/грибов с использованием РСК-Ш-ТОЬ' МС и МЛШ1-ТОР МС технологий [11].
Для того чтобы понять, какова вероятность появления положительных результатов при Р1,НХ-Ш анализе в случае, если гемокультура отрицательна в системе гемокультивирования Вас'1'-А1ег1, мы проанализировали 80 ВасТ-А1ег1 отрицательных гемо-культур. Оказалось, что все отрицательные в 13асТ-Л1еП системе образцы были также отрицательны при анализе с помощью РЬЕХ-ГО системы, что позволяет предположить одинаковую аналитическую чувствительность обеих систем и рекомендовать ВасТ-А1сг1 систему для обнаружения микроорганизмов в гемокультурах в рутинной практике. Данные образцы также были отрицательны и при исследовании куль-туральным методом. Таким образом, результаты всех трех методов детекции микроорганизмов из отрицательных в ВасТ-А1еп: системе гемокультур совпали.
Выявление смешанных инфекций.
В настоящем исследовании более чем один микроорганизм был выявлен в десяти из 74 образцов (13,5%) при использовании РЬЕХ-Ш системы и в трех образцах из 74 - при посеве (4%) (табл. 3),
Таблица 3.
Идентификация смеси микроорганизмов в образцах крови с использованием технологии PCR- ESI-TOF MC
№ образца ПЦР- ES1-T0FMC Посев
1 S. capitis, i. saccharolyticus i. epidermis
2 М. lyloe, М. luteus Micrococcus sp.
3,4 i. epidermidis, 1 luqdunensii I epidermidis
5 i. hominis, A. viridans Staphylococcus sp.
6 M. luteus, C. xerosis M. luteus
7 Pseudomonos putido, 5. haemolyticus P. put id a
£ 5. epidermidis, S. hominis С. parapsilosis 5. epidermidis S. hominis
9 S. aureus mecA положительный (MRSA), K, pneumoniae 5. aureus, Burkhoideria cepacia
10 Коагуяазокегативный Staphylococcus, E faecalis S. epidermis, Enterococcusty.
11ри использовании РLEX-ID в одном из этих трех образцов была обнаружена дополнительно Candida parapsilosis, в другом - E.faecalis, в двух оставшихся обоими методами были выявлены 2 микроорганизма, но принадлежавшие к разным видам. Таким образом, PLEX-1D анализ более эффективен, чем культу-ральный метод, для выявления смешанных культур в крови. Этот результат согласуется с результатами исследований других лабораторий, применявших PCR-ESI-TQF Mi!! для обнаружения микроорганизмов в гемокультурах [4, 9, 12J. С учетом того, что успешное выявление микроорганизмов при использовании метода культивирования напрямую зависит от состава питательной среды, нельзя исключить вероятность
того, что более низкая эффективность культураль-ного метода по выявлению смеси микроорганизмов связана с субоптимальными условиями культивирования. С другой стороны, большая эффективность выявления микроорганизмов может быть связана с более высокой вероятностью ложно-положительного результата при PLFX-ID анализе. Для получения определенного заключения по этому вопросу необходимо подтверждение полученных в PLEX-ID данных результатами еще одной технологии, когда напрямую, без этапа культивирования, удается идентифицировать все находящиеся в биообразце микроорганизмы. При этом также проводят PCR-ESI-TOF МС, но работают с набором всех ДНК, находящихся в образце. В настоящее время сиквснирование «нового поколения» широко используют для анализа генома микробных сообществ окружающей среды и самого человека.
Скорость идентификации.
При использовании PCR-ESI-TOF МС время видовой идентификации бактерий в гемокультурах сократилось, как минимум, на 12-24 часа, а грибов рода Candida, как минимум, на 24-48 часов.
Выявление резистентных к антибиотикам бактерий.
Выявление резистентности к антибиотикам в PLEX-ID анализаторе происходило одновременно с видовой идентификацией. С помощью использовавшейся в исследовании аналитической панели существовала возможность выявить устойчивые к мстициллину золотистые стафилококки - MetSncillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), к ванкоми-цину А и В - энтерококки, к карбапенемам - грам-негативные бактерии. При использовании PLEX-ID (как и культурального метода) были обнаружены 2 штамма MRSA. Резистентность бактерий была подтверждена диско-диффузионным методом. Других резистентных к ан тибиотикам изолятов бактерий не было выявлено.
Корректность определений чувствительности бактерий к антибиотикам с помощью PCR-ESI-TOF МС, согласно работам двух авторских коллективов, колеблется от 69% до 100% для MRSA [7, 13]. Другими авторами показано полное отсутствие соответствия между результатами определения чувствительности золотистого стафилококка к мстициллину и энтерококков к ванкомицину А и В при использовании PCR-ESI-TOF МС и традиционных методов определения чувствительности микроорганизмов [10]. В данном исследовании маркер резистентности к мстициллину (шесА) детектировали в группе коа-гулазонсгативных стафилококков, а маркеры резистентности к ванкомицину Л и В (van А/В) - у лакто-бацилл. I (одобная ситуация описана и в статье [14].
Спектр выявленных патогенных микроорганизмов.
Всего в положительных образцах гемокультур было выявлено 25 видов микроорганизмов, принадлежавших к шести группам патогенных бактерий (ко-
агулазонегативные стафилококки, грамположитель-ные каталазоотрицательные кокки, представители семейства Enterobacteriaceae, неспорообразующие анаэробные бактерии, неферментирующие грамо-трицательные бактерии, кислотоустойчивые актино-бактерии) и грибы 2 родов - Candida и Trichosporon.
Для сравнения наших данных о встречаемости микроорганизмов с результатами других авторов, также использовавших метод PCR-FSI-TOF MC для выявления микроорганизмов в гемокультур ах, приводим таблицу 4. В исследования Ecker (2010), Kaieta (2011) и Jordana-Lluch (2013) включены положительные образцы крови от пациентов с разнообразными диагнозами из клиник разного профиля, что соответствует дизайну нашего исследования.
Все выявленные нами микроорганизмы можно разделить по встречаемости на 3 условные группы. Большую группу (39,3%) в нашей выборке составили коагулаз о негативные стафилококки (К НС), в исследованиях других авторов доля этих микроорганизмов варьирует от 8 до 30%, Как показано ранее, КНС часто являются контаминантами гемокультур [ссылки в 15,16]. Группа 2составляет во всех исследованиях примерно равную долю в 45-50%, Однако встречаемость некоторых видов внутри группы значительно различается в сравниваемых исследованиях, 'Гак, например, доля Staphylococcus aureus в нашем исследовании 3,6%, тогда как В других исследованиях - 13-15%. Показано, что такие представители группы 2, как Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida sp„ Pseudomonas aeruginosa, в большинстве случаев являются истинными возбудителями бактериемий [17, 18]. Третью группу В нашем исследовании и в исследованиях других авторов составили виды с низкой встречаемостью. Среди этой группы отдельные виды (Bacillus spp., Propionibacterium acnes) редко вызывают бактериемию и не ¡считаются клинически значимыми [17].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В соответствии с целью данного исследования проведен сравнительный анализ результатов обнаружения/идентификации бактерий и Candida spp. культуральным методом и с использованием платформы PLEX-ID.
В результате исследования показано, что с помощью PLEX-ID можно существенно сократить время идентификации бактерий и Candida spp. в образцах крови, что будет способствовать своевременному назначению этиотропной терапии у пациентов с признаками сепсиса.
В исследовании установлено, что PLEX-ID платформа значи тельно эффективнее культурального метода в выявлении смешанных инфекций.
Это важное свойство PCR-ES3-TOF технологии позволит врачам эффективно выявля ть смешанные инфекции, а в совокупности с клинической картиной и лабораторными исследованиями определять клиническую значимость выявленных патогенов и на-
'Габлица 4.
Спектр патогенных микроорганизмов, выявленных в гемокультур ах больных с подозрением на сепсис при использовании РСЙ-Е5)-ТОР МС
Группы пациентов Название микроорганизма Процентное содержание
Данное исследование (2013) Ecker (2010) Caleta (2011) Jordana-Lluch (2013)
Группа 1 Коагулазонегативный Staphylococcus 39,3 30,5 7,8 14,1
Группа 2 Enterobacter cloacae complex 9,5 2,2 3,7 2
f. faecalis 4,8 4 5,3 8,9
Escherichia coli 4,8 10,2 3,7 20,5
К, pneumoniae 4,8 5,5 2,9
Micrococcus spp. 4,8 0,8 2,9 -
Candidas p. 4,8 2,3 2,9 -
S.aureus 3,6 13,3 15,6 14,1
C. albicans 3,6 1,8 16 1,2
Corynebacterium spp. 3,6 1 1,2 -
Pseudomonas aeruginosa 2,4 3 2,5 5
Acinetobacter baumannii 2,4 0,9 2 -
Общий % 49,1 45 44,3 51,7
Группа 3 E faedum 1,2 4,1 6,1 6,4
Bacillus spp. 1,2 0,9 1,2 1,3
Klebsiella oxytoca 1,2 0,9 1,2
Acinetobacter Iwoffii 1,2 0,2 0,4 -
T. inkin 1,2 -
A.viridans 1,2 - - -
Acinetobacter calcoaceticus 1,2 0,1 - -
Pseudomonas putida 12 0,2 - -
Rhodocoaus spp. 1,2 - -
Burkholderia cepacia/ cenocepada 1,2 - - -
Propionibacterium acnñ 1,2 - - -
Leuconostocm. 1,2 - - -
Общий % 14,4 6,4 8,9 7,7
Всего полож. гемокультур 74 138 244 78
значать адеква тную антимикробную терапию.
Что касается возможности применения PLEX-ID платформы для одновременного определения резистентности некоторых групп бактерий к антибиотикам, то необходимы дальнейшие исследования по данной проблеме.
Результатами нашего исследования подтверждена эффективность PCR-ESI-TOF Mi!! в изучении разнообразия микроорганизмов в биообразцах. Таким образом, PCR-ESI-TOF MC-технология представляется перспективной с точки зрения ее использования для быстрого анализа микроб йоты различных биообразцов в рутинной практике.
БЛАГОДАРНОСТИ
Мы благодарим сотрудников СЗГМУ им, И.14. Мечникова: ассистента кафедры медицинской микробиологии Пинегину О.Н. и ординатора кафедры медицинской микробиологии Степанова A.C. за помощь в коллекционировании и транспортировке образцов крови; сотрудников отделения лабораторной диагностики микологической клиники НИИ медицинской микологии им, H.H. Кашкина - лаборантов Киселеву A.A. и Цвсткову Г.В, и врача-бактериолога Ремневу H.H. за проведение идентификации бактерий и грибов культуральными методами; заведу-
ющсго кафедрой клинической микологии, аллергологии и иммунологии, профессора Климко H.H., профессора кафедры медицинской микробиологии Сидоренко C.B., профессора кафедры медицинской микробиологии Ьойцова Л.Г. и аспиранта кафедры медицинской микробиологии Рябинина И,Л, за консультативную помощь; а также всех врачей клинических отделений больниц за предоставление образцов крови для данного исследования.
Также благодарим наших московских коллег из НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского 1'од-кова М.Л. - заведующего отделом лабораторной диа-
гностики, Черненькую ТВ. - заведующую лабораторией клинической микробиологии и Баженова Л.И. — заведующего лабораторией клинической иммунологии и диагностики С11ИД за предоставление клинического материала и проведение идентификации бактерий культуральными методами.
Работа была выполнена в рамках государственного задания на 2012-2014 гг.
«Изучение эпидемиологии, микробиологический мониторинг внутрибольничных грибковых инфекций, актуальных госпитальных штаммов возбудителей внутрибольничных инфекций»,
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Kumar A., Roberts D., Wood К., fl al, Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock // Critical Care Medicine — 2006. — Voi. 34, №> 6. — P. 1589-1596.
2. Bellinger R., Levy M., Car let ]., etal. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock // Crit. Cate Med. - 2008. - Vol, 36. - P.296-327.
3. FenollarE, Raoult D, Molecular diagnosis of bloodstream infections caused by non-cultivable bacteria// Int.). Antimicrob. Agents, - 2007. - Vol. 30, Suppl. 1. - S7-S1S.
4. Ecker D.J., Sampalh R,, el at. New technology for rapid molecular diagnosis ol bloodstream infections II Expert líev. Mol. Diagn. - 2010. -№10(4). - P. 399-415.
5. F.cker 11, Sampalh R., fítyn I.., el al. Rapid identification anuí strain-typing of respiratory pathogens for epidemic surveillance// Proceeding of the NAS of the USA! - 2005. -Voi. 102. - P. 8012-8017.6. Walk D., Kaleta E., Wysocki V. PCR-electro spray ionization mass spectrometry. The potential to change infectious disease
diagnostics in clinical and public health laboratories // The J. of Molecular Diagnostics. - 20Í2, - Vol. 14, №4. - P. 295-304.
7. Brinkman C., Vergidis P., Uhl /. PCR-elect ros pray ionization mass spectrometry for direct detection of pathogens and antimicrobial resistance from heart valves in patients with infective endocarditis II J.of Clin. Microbiol. - 2013. - Vol. 51, №7. - P. 2040-2046.
8. Shin J., Ranken J., Sefers S. Detection, identification, and distribution of fungi in bronchoalveolar lavage specimens by use о I multilocus PCR coupled with electrospray ionization/mass spectrometry // J. of Clin. Microbiol. — 2013. — Vol. 51, №1. - P. 136-141.
9. l.affler T„, Cummins L., McClain C, et al. Enhanced diagnostic yields of bacteremia and candidemia in blood specimens by PCR/electrospray ionization mass spectrometry II). of Clin. Microbiol,, JCM Accepts, published online ahead of print on 21 August 2013.
10. Yun H., KreftR., Castillo M. Comparison oí PCR/electron spray ionization-time-of-flight-mass spectrometry versus traditional clinical microbiology tor active surveillance of organisms contaminating high-use surfaces in a burn intensive care unit, an orthopedic ward and healthcare workers // BMC Infectious Diseases. — 2012. — Vol. 12.
11. Kaleta E„ Clark A., Cherkaoui A. Comparative analysis of PCJR-electrospray ionization/mass spectrometry (MS) and MA1.DI-TOF/MS for Lhe identification ol bacteria and yeast from positive blood culture bottles // Clin¿ Chem. — 2011. -Vol. 57, №7. - P. 1057-1067.
12. Kaleta E.J., Clark A. E„ Johnson D.R.., et al. Use of PCR coupled with electrospray ionization mass spectrometry for rapid identification of bacterial and yeast bloodstream pathogens from blood culture bottles // ]. of Clin. Microbiol. - 2011. -Vol. 49, №4.-P. 345-353.
13. Jordana-Lluch E„ Carolan H„ Giménez M„ el al. Rapid diagnosis of bloodstream infections with PCR followed by mass spectrometry// PLoS One. - 2013. - Vol. 8, №4, published online on 23 April 2013.
14. Shavv A., Vento Т., Mende К., et al. Detection ol methici 11 in-resistant anil methieillin-suscepLibie Staphylococcus aureus colonization ol healthy military personnel by traditional culture, PCR, and mass spectrometry // Scand J. Infect. Dis., published online ahead of print on 19 August 2013 published online ahead of prinL on 21 August 2013.
15. Hall K, Lyman]. Updated review of blood culture contamination // Clin. Microbiol. Rev. - 2006. - Vol. 19, №1. - P. 788802,
16. Tsalik E., Jones D., et al. Multiplex PCR to diagnose bloodstream infections in patients admitted from the emergency department with sepsis //J. of Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, №1. - P. 26-33.
17. Weinstein M. lilood culture contamination: persisting problems and partial progress // J. of Clin. Microbiol. - 2003, - Vol. 41, №6. -P. 2275-2278.
IH. Baldwin C. D-, Howe G. Д, Sampalh R.., el al. Usefulness of multilocus polymerase chain reaction followed by electrospray ionization mass Spectrometry to identify a diverse panel ol bacterial isolates // Diagnostic Microbiol, and Infect. Dis. -2009. - Vol. 63. - P. 403-408.
Поступила в редакцию журнала 10.09.2013
Рецензент: Л.А. Кафтырева
