CC BY
307
УДК 619:616.98:579.873.21-07
ПЦР при диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота
А.Х. Найманов, доктор ветеринарных наук, В.М. Калмыков, аспирант
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии
им. Я.Р. Коваленко» (Москва)
Ключевые слова: крупный рогатый скот, паратуберкулез, ПЦР
Сокращения: ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ЖКТ — желудочно-кишечный тракт, ИФА — иммуноферментный анализ, КРС — крупный рогатый скот, МЭБ — Международное Эпизоотическое Бюро, ПЦР — полимеразная цепная реакция, РСК — реакция связывания комплемента, МАР — Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
Введение
Паратуберкулез (паратуберкулезный энтерит, болезнь Jonne) — хроническая инфекционная болезнь животных, характеризующаяся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов, сопровождающаяся расстройством ЖКТ, прогрессирующим истощением до летального исхода.
Болезнь чаще регистрируют у жвачных животных; из домашних жвачных, главным образом, у КРС молочного направления, овец, коз и верблюдов. Выделение возбудителя из организма зараженных животных происходит, в основном, с фекалиями, реже с мочой и молоком.
Возбудителя болезни впервые выделили Н.А. Johne и L. Frothingham в 1895 г из подвздошной кишки коровы, больной паратуберкулезом. В 1912 г. T.W. Twort, G.Z. Ingram изолировали возбудителя паратуберкулеза и назвали его Mycobacterium enteritidis chronicae bovis. В дальнейшем возбудитель болезни квалифицирован как Mycobacterium paratuberculosis, а затем как Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. МАР на 99 % генетически родственны с Mycobacterium avium, но отличаются микобактин-зависимостью, т. е. растут на питательных средах, содержащих фактор роста (микобактин). В последние годы возбудитель паратуберкулеза отнесен к комплексу Mycobacterium avium-intracellulare.
Паратуберкулез КРС широко распространен в мире. По данным МЭБ, в начале XXI в. заболевание регистрировали в 60 странах мира [1]. На 01.01.12 г. в Российской Федерации зарегистрировано 4 неблагополучных пункта по паратуберкулезу КРС: в Брянской (1), Сахалинской (2) областях и Удмуртской республике (1). Экономический ущерб от болезни обусловлен значительным снижением продуктивности животных: потерей молочной продуктивности, истощением, бесплодием и, как следствие, выбраковкой больного поголовья.
Паратуберкулез был и остается одной из сложно контролируемых и диагностируемых инфекций, т. к. инкубационный период длится от 6 мес до 15 лет. При этом носители микобактерий могут не иметь клинических признаков болезни, но, периодически выде-
ляя возбудителя во внешнюю среду, заражать восприимчивых животных. Некоторые авторы проблему паратуберкулеза сравнивают с верхушкой айсберга — так называемый «айсберг-эффект», когда на один клинический случай приходится 15...20 инфицированных животных, у которых болезнь протекает в латентной форме. «Скрытость» инфекции, низкие специфичность и чувствительность методов диагностики, сложность выделения и культивирования микобактерий паратуберкулеза и отсутствие возможности воспроизведения болезни на лабораторных животных — вот основные причины, затрудняющие постановку диагноза этого давно известного, но недостаточно изученного хронического заболевания.
Достижения в области молекулярной генетики привели к разработке новых подходов к обнаружению возбудителя в диагностическом материале. На протяжении последних лет широко используют молекулярные технологии для генотипирования и дифференциации возбудителей на уровне ДНК, в частности, ПЦР.
В зарубежной литературе имеются сообщения об успешном испытании ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС [2]. Чувствительность и специфичность ПЦР определяли исследованием фекалий и сывороток крови молочных коров штата Индиана (США). Результаты ПЦР сравнивали с результатами культурального метода на жидких и твердых питательных средах и ИФА. Авторы оценили ПЦР как более точный и экспрессивный метод идентификации МАР, рекомендуют его применять при установлении статуса стад в отношении паратуберкулеза и включить в программу борьбы с этой инфекцией.
В доступной отечественной литературе сведений о применении ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС мы не обнаружили. Поэтому, учитывая недостаточную изученность некоторых важных вопросов диагностики, длительность, трудоемкость и сравнительно низкую эффективность классических методов прижизненной и лабораторной диагностики, изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС является вполне своевременным и актуальным.
Цель исследования
Определить возможность применения ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС.
Материалы и методы
Исследования по диагностике паратуберкулеза КРС проводили в соответствии с «Наставленим по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 05.01.2001 г., № 13-5-02/0050.
ПЦР при диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота
Для ПЦР-исследования проб фекалий от коров использовали тест-системы «ПАРАТУБ» и «АВИУМ» (ФБУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора).
Результаты
Базой для исследования послужило хозяйство, где были выявлены животные, подозреваемые в заражении паратуберкулезом. На 01.01.11 г. в хозяйстве численность поголовья КРС составляла 2224, из них 840 коров. В 2010 г. были выявлены коровы с длительной диареей и, как следствием этого, незначительным истощением и потерей молочной продуктивности.
В соответствии с представленными актами диагностических исследований, проведенных местной ветеринарной службой, и экспертиз лабораторных исследований, в декабре 2010 г. межрайонной ветеринарной лабораторией при бактериологическом исследовании проб фекалий от 5 первотелок в двух пробах обнаружен возбудитель паратуберкулеза. В целях уточнения диагноза проведен комиссионный диагностический убой двух коров, у которых результаты бактериоскопии указали на паратуберкулез. При па-толого-анатомическом исследовании не обнаружено изменений, характерных для паратуберкулеза. От убитых коров выделена культура возбудителя паратуберкулеза.
В марте 2011 г. проведен комиссионный осмотр 404 голов КРС. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не обнаружено. В апреле исследовано 408 проб сыворотки крови КРС методом РСК. Выявлено 5 животных с положительным и одна корова с сомнительным результатом РСК. В апреле 2011 г. все шесть животных были исследованы аллергической внутрикожной пробой с использованием ППД-тубер-кулина для птиц. Реагирующих животных не выявлено. В тот же период сыворотка крови от этих животных повторно была исследована в РСК. При повторном исследовании было получено только три положительных результата.
По результатам исследований проведен диагностический убой одной коровы с положительными результатами РСК. При патолого-анатомическом исследовании не обнаружено изменений, характерных для паратуберкулеза. При бактериологическом исследовании патматериала от убитой коровы возбудитель паратуберкулеза не выделен. Однако, при бактерио-скопическом исследовании патматериала обнаружены кислото- спиртоустойчивые палочки, расположенные палисадом, кучками и давшие основание предполагать наличие возбудителя паратуберкулеза.
В мае 2011 г. проведен комиссионный клинический осмотр всего поголовья КРС хозяйства. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не обнаружено.
В связи с сомнениями и сложностью установления диагноза на паратуберкулез, дальнейшие исследования проводили комиссионно, совместно с сотрудниками лаборатории микобактериозов ВИЭВ.
В августе 2011 г. в комплексе, где выявлялись подозрительные в заражении паратуберкулезом животные, проведены комиссионный клинический осмотр поголовья животных и учет аллергических реакций на внутрикожное введение ППД-туберкулина для птиц. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не выявлено. При учете аллергических реакций через 72 ч после введения туберкулина для птиц реагирующих животных также не выявлено.
От животных этого комплекса были отобраны 32 пробы фекалий для ПЦР-исследования в ВИЭВ на наличие возбудителя паратуберкулеза. При исследовании ДНК МАР и ДНК M. avium не выделено.
Кроме того, при посещении диагностического центра и беседе с сотрудниками установлено, что при бактериологическом исследовании патматериала от убитых (подозрительных в заражении паратуберкулезом) животных посевы проводили на обычные питательные среды, используемые для диагностики туберкулеза, без добавления фактора роста (экстракта из M. phlei). В связи с тем, что возбудитель паратуберкулеза в первых генерациях растет и размножается на питательных средах только в присутствии фактора роста, для идентификации выделенных культур микобактерий необходимо было эти культуры посеять на питательные среды с фактором роста и без него. К сожалению, это важное условие идентификации культур микобактерий и диагностики паратуберкулеза не было выполнено. Поэтому выделенные культуры нетуберкулезных (атипичных) микобактерий были ошибочно охарактеризованы как M. paratuberculosis.
Следует указать, что в соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных» от 2001 г., диагноз на паратуберкулез считается установленным: при наличии у животного характерных клинических признаков болезни и получения одновременно положительного результата бактериоскопического или гистологического исследования биоматериала от этих животных; при обнаружении характерных патолого-анатомических изменений в кишечнике и мезентериальных лимфатических узлах животных с гистологическим или бак-териоскопическим подтверждением болезни, независимо от наличия или отсутствия клинических признаков заболевания.
Анализ всей ранее проведенной диагностической работы, а также комиссионных диагностических исследований показывает отсутствие в стаде животных с характерными клиническими признаками паратуберкулеза, а также характерных патолого-анато-мических изменений в кишечнике и мезентериальных лимфатических узлах с гистологическим или бактериоскопическим подтверждением. Кроме того, ранее выделенные кислото-спиртоустойчивые микобактерии и культуры микобактерий не идентифицированы как M. paratuberculosis, а из фекалий подозреваемых в заболевании паратуберкулезом животных ПЦР-исследованием не выделено ДНК МАР и ДНК M. avium.
РВЖ • СХЖ • № 3/2012
В.М. Калмыков, А.Х. Найманов
Выводы
В связи со сложностью диагностики паратуберкулеза, диагностические исследования необходимо проводить в соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулеза» в комплексе с современными дополнительными методами исследований. Обнаружение в патматериале или фекалиях кислото-спирто-устойчивых палочек указывает на наличие микобактерий, но не является основанием для установления диагноза на паратуберкулез. При бактериологическом исследовании патматериала на паратуберкулез необходимо использовать специальные питательные сре-
Библиография
1. Шуляк Б.Ф. 110 лет со дня открытия возбудителя паратуберкулеза // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные, 2005; 9: 238—239.
ды с добавлением фактора роста (микобактин). В комплексе диагностических исследований ПЦР-анализ фекалий коров, подозреваемых в заражении паратуберкулезом, представляет собой эффективный дополнительный тест для подтверждения или исключения заражения животных М. рагаЬиЪегси1о818.
Практическое предложение
В комплекс методов диагностики паратуберкулеза КРС необходимо включить ПЦР-анализ фекалий животных, подозреваемых в заражении паратуберкулезом, для выявления ДНК МАР.
2. Alinovi C.A., Ward M.P., Lin Tsang Long, Moore G.E., Wu Ching Ching. Real-time PCR, compared to liquid and solid culture media and ELISA, for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis // Veterinary Microbiology, 2009; 136 (1/2): 177—179.
Summary
A.H. Naymanov, V.M. Kalmykov. PCR in the Diagnosis of Paratuberculosis in Cattle. The complex diagnostic paratuberculosis in cattle feces should conduct a study using PCR to detect DNA of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis with suspected paratuberculosis infection of animals.
УДК: 619:616.98:579.843.95:636.2
Пастереллез крупного рогатого скота на молочных комплексах: частота выделения и характеристика культур
Т.И. Глотова, доктор биологических наук, А.Г. Глотов, доктор ветеринарных наук, Т.Е. Терентьева, аспирант, О.В. Кунгурцева, кандидат биологических наук, К.В. Войтова, кандидат ветеринарных наук ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» Россельхозакадемии (Новосибирск)
Ключевые слова: пастереллез, патогенность, респираторные болезни, чувствительность, МаппЬе!т!а Ъаето1уиса, РаэЬеигеИа тикоайа,
Сокращения: ИРТ — инфекционный ринотрахеит, МПА — мясопептонный агар, КРС — крупный рогатый скот, ПГ-3 — парагрипп 3
Введение
Респираторные болезни причиняют значительный экономический ущерб в промышленном животноводстве. В возникновении бронхопневмоний у КРС большую роль играют представители семейства Раэ-1еиге11асеае, грамотрицательные, факультативно анаэробные палочкообразные бактерии, являющиеся ком-менсальными обитателями поверхности слизистых оболочек млекопитающих и птиц, которые способны
вызывать вторичные инфекции и болезни. Семейство включает в себя несколько родов: Mannheimia, Pasteurella, Haemophilus, Actinobacillus, Lonepinella и Phocoenobacter [8, 12, 15, 16]. В зарубежной литературе выделяют болезни, вызываемые антигенно различающимися бактериями, членами этого семейства: Mannheimia haemolytica биотип A (сероварианты 1, 2, 5...9, 11) и биотип T (сероварианты 3, 4, 10), а также Pasteurella multocida (сероварианты A, B, D, E, F) [3, 6, 14, 15].
В этиологии респираторных болезней телят откормочного и молочного направления чаще участвуют M. haemolytica А1 и А2 и P. multocida A и D. Однако, первая чаще выделяется при «транспортной лихорадке», а вторая — при «энзоотической бронхопневмонии», хотя четкой закономерности не установлено. M. haemolytica вызывает вспышки респираторных бо-
