CC BY
49
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2009 Биология Вып. 10 (36)
УДК 579.26:579.222.4
ПЦР-АНАЛИЗ ГЕНОВ АЛЬДОКСИМДЕГИДРАТАЗ НИТРИЛУТИЛИЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
М.В. Кузнецоваb, А.В. Максимоваa, Г.В. Овечкинаb, А.Ю. Максимовa,b
a Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15 b Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Проведена детекция генов альдоксимдегидратаз у нитрилутилизирующих бактерий, выделенных на территории Пермского края. Установлено, что 14,3% бактерий лабораторной коллекции содержали гены альдоксимдегидратаз. У 12 штаммов рода Rhodococcus (20,3%) присутствовали фрагменты ДНК, соответствующие по размеру гену альдоксимдегидрата-зы. На матрице ДНК одного штамма из группы грамотрицательных микроорганизмов -Pseudomonas fluorescens 3220 - амплифицирована последовательность, соответствующая по размеру гену альдоксимдегидратазы P. chlororaphis B23.
Альдоксимы - это интермедиаты биосинтеза некоторых биологически активных веществ, таких как индолилуксусная кислота, цианогенный глико-зид и глюкозинолаты в растениях. Так, индолаце-тальдоксимгидролаза катализирует специфическую дегидратазную реакцию индолацетальдокси-ма в индолацетонитрил. Этот фермент можно обнаружить в некоторых родах грибов и высших растений, и впервые он выделен из Gibberella sp. (Asano et al., 1981).
У бактерий конверсия альдоксимов в нитрилы, а затем в соответствующие карбоновые кислоты происходит путем сочетания работы ферментов альдоксимдегидратазы и нитрилутилизирующих ферментов - нитрилгидратазы и амидазы и/или нитрилазы (Kato et al., 1998):
альдоксимдегидратаза нитрилгидратаза
R-CH=NOH -------► R-CN + H2O-----► R-CONH2 + H2O
амидаза
R-CONH2 + H2O __________► R-COOH +NH4+
альдоксимдегидратаза нитрилаза
R-CH=NOH _______► R-CN + H2O_____► R-COOH +NH4+
Штаммы - продуценты нитрилгидролитических ферментов имеют важное практическое применение: в крупнотоннажном промышленном производстве акриламида и солей акриловой кислоты (Kobayashi et al., 1992; Yanenko et al., 1995). Несмотря на постоянный поиск новых бактерий в природе, информация о распределении систем гидролиза нитрилов в группах микроорганизмов и их физиологическая роль еще не в полной мере определены. Поэтому внимание исследователей, изучающих нитрилутилизирующие ферменты микроорганизмов, привлекли альдоксимдегидрата-зы - ферменты, катализирующие альдоксимы до нитрильных соединений. В настоящее время выделены альдоксимтрансформирующие микроорганизмы Bacillus sp. OxB-1 и Rhodococcus sp. YH3-3.
Данные штаммы конвертировали альдоксимы через нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты путем последовательной работы альдоксим-дегидратазы и нитрилгидролизующих ферментов (Asano, Kato, 1998).
Процесс отбора штаммов, обладающих активностью альдоксимдегидратазы, может быть ускорен быстрым скринингом с помощью молекулярных методов детекции генов, кодирующих эти ферменты.
Работа посвящена детекции генов альдоксим-дегидратаз у бактерий, способных утилизировать нитрилы карбоновых кислот, ранее выделенных из почвы на территории Пермского края.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования являлись бактериальные культуры, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот.
Культуры получены ранее в результате селекции на ацето- и/или изобутиронитриле из образцов почв и вод естественной среды и почвы промышленных предприятий (ФГУП "ПЗ им. С.М. Кирова" и ОАО "Бератон"). Всего проанализирована 91 культура микроорганизмов: 59 штаммов грамположительных бактерий (роды Rhodococcus, Arthrobacter, Microbacterium, Citreo-bacterium, Nocardia, Gordonia, Aureobacterium) и 32 штамма грамотрицательных бактерий (роды Pseudomonas, Azomonas, Azotobacter и Acidovorax).
Препараты хромосомной ДНК грамположи-тельных бактерий получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из акти-номицетов (Гловер и др., 1988). ДНК грамотрица-тельных микроорганизмов получали следующим образом: полную петлю биомассы бактериальной культуры инокулировали в 100 мкл стерильной
© М. В. Кузнецова, А. В. Максимова, Г. В. Овечкина, А. Ю. Максимов, 2009
111
Таблица 1
Праймеры для ПЦР-анализа генов альдоксимдегидратаз_________________________
Праймер Последовательность Размер фрагмента, пар нуклеотидов № в GenBank
PsOxd F R ATGGAATCTGCGATCGACACGCATC TCAGGTGGGCGCGACAACGGCATC 1058 АВ093544
RhOxd F R ATGGAATCTGCAATCGGCGAACAC TCAGTGCTCGGCGGTTGTCACCG 1069 АВ094201
Н2О, выдерживали при 95°С в течение 15 мин в твердотельном термостате «Термит» (Россия) (Stone et al., 1994). Пробы охлаждали, центрифугировали 5 мин при 12 тыс. об./мин. Супернатант использовали в генетических исследованиях.
Детекцию генов альдоксимдегидратаз осуществляли посредством ПЦР с праймерами к генам, кодирующим известные альдоксимдегидратазы грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Олигонуклеотидные праймеры были разработаны с использованием баз данных GENBANK и по заданным последовательностям синтезированы ООО «Евроген», Москва (табл. 1).
Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Тад-полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на термоциклере Т3 (Biometra, Германия). Режим амплификации для всех праймеров включал начальный цикл денатурации - 1 мин при 94°С и завершающий цикл 3 мин при 72°С. Для праймеров RhOxd F1/R1 режим амплификации составлял: 94°С - 20 сек; 64°С - 30 сек; 72°С - 60 сек (35 циклов). Для праймеров PsOxd F1/R1: 94°С - 20 сек; 54°С - 70 сек; 72°С - 60 сек (35 циклов). Электрофоретическое разделение ДНК проводили стандартным способом в 1,5% агарозном геле. Визуализацию результатов осуществляли с помощью системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия).
Результаты исследований
Известна только хромосомная локализация генов, кодирующих альдоксимдегидрогеназы у бактерий (Xie et al., 2003). Гены, контролирующие гидролиз нитрилов, также имеют хромосомную локализацию (Kobayashi et al., 1992).
Установлено, что у 12 штаммов (20,3%) грам-положительных нитрилутилизирующих бактерий присутствовали фрагменты ДНК, соответствующие по размеру гену альдоксимдегидратазы (рис. 1). Все штаммы принадлежали к роду Rhodococcus (из них 11 - R. erythropolis, 1 -R. rhodochrous).
У штаммов, принадлежащих к родам Microbacterium, Citreobacterium, Nocardia, Gordonia, Aureo-bacterium, не обнаружены фрагменты генов аль-доксимдегидратаз ни с одной парой праймеров к генам гидролитических ферментов.
На матрице ДНК одного штамма из группы грамотрицательных микроорганизмов (Pseudomonas fluorescens 3220) амплифицирована последовательность, соответствующая гену альдоксимде-гидратазы P. chlororaphis B23 (Oinuma et al., 2003).
Нужно подчеркнуть, что в большинстве случаев гены альдоксимдегидратазы были детектированы в штаммах (8), содержащих весь комплекс генов, кодирующих ферменты гидролиза нитрилов: нитрилгидратазу/амидазу и/или нитрилазу (табл. 2).
В трех случаях детектировали ген альдоксим-дегидратазы и один из генов, ответственных за синтез гидролитических ферментов.
■3 S
Рч
Л
Л
о
<N
<N
і
<N
О
<N
1 kb-
Рис. 1. Электрофорез ПЦР-продуктов, соответствующих генам альдоксимдегидратаз грамположи-тельных бактерий
1кЬ
маркер
ПЦР-анализ генов альдоксимдегидратаз.
113
Таблица 2
Распределение генов, кодирующих ферменты метаболизма нитрилов у некоторых штаммов изучаемой коллекции
Г ены, кодирующие ферменты, участвующие в метаболизме нитрилов
Культура nhc Fe nhc Co nh aFe nh pFe ami nit oxd
R. rhodochrous К17(Р) + +/+ + + +
R. erythropolis Б2-4 + +/+ + +
R. erythropolis Б4-1 + +/+ + + +
R. erythropolis Б4-3 + +/+ +
R. erythropolis Б4-4 + +
R. erythropolis Б5-2 + +/+ + + +
R. erythropolis Б5-5 + +/+ + +
R. erythropolis Б20-8 + -/+ + +
R. erythropolis ДО-1-1с + +
Pseudomonas sр. C3220 + + +
R. erythropolis П4-1-3 + +
R. erythropolis П11-2 + + + +
Rhodococcus sр. П3 + + +
Заключение
На основе коллекции нитрилутилизирующих штаммов бактерий исследовано распространение генов альдоксимдегидратаз, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме нитрилов карбоновых кислот. Установлено, что только 14,3% штаммов нитрилутилизирующих бактерий лабораторной коллекции содержали гены альдоксимдегидратаз. Возможно, это связано с вариабельностью фланкирующих участков генов, кодирующих эти ферменты, и используемые праймеры не охватывают все возможные комбинации этих последовательностей.
При оценке распространения генов альдоксим-дегидратаз среди микроорганизмов различных таксономических групп показано превалирование представителей рода Rhodococcus, продуцирующих железосодержащие нитрилгидратазы. Следует отметить, что при анализе и других генов, кодирующих гидролитические ферменты, доля этих бактерий была наибольшей.
Метод молекулярного скрининга при помощи ПЦР позволяет быстро идентифицировать альдок-симдегидратазы и может быть использован в процессе селекции альдоксим- и нитрилконверти-рующих микроорганизмов.
Полученные результаты подтверждают важную роль альдоксимдегидратаз в метаболизме бактерий.
Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (20092010 годы)» и программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие»
Библиографический список
Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы / Д.
Гловер. М.: Мир, 1988. 538 с.
Asano Y. Fungal degradation of triacrylonitrile / Y.Asano, S. Ando, Y. Tani, H. Yamada, T. Ueno // Agric. Biol. Chem. 1981. Vol. 45. P. 57-62.
Asano Y. Z-Phenylacetaldoxime degradation by a novel aldoxime dehydratase from Bacillus sp. strain OxB-1 / Y. Asaro, Y. Kato // FEMS Microbiol. Lett. 1998. Vol. 158. P. 185-190.
Kato Y. et al. Isolation and characterization of a bacterium possessing a novel aldoxime-dehydration activity and nitrile-degrading enzymes / Y. Kato // Arch. Microbiol. 1998. Vol. 170. P. 85-90.
Kobayashi M. Enzymatic synthesis of acrylamide: a success story not yet over ... / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Trends Bioechnol. 1992. Vol. 10. P. 402-408.
Oinuma K. et al. Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas chlororaphis B23. Sequencing, gene expression, purification, and characterization / K. Oinuma, Y. Hashimoto, K. Konishi, M. Goda et al. // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 29600-
29608.
Stone G.G. Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth cultivation-PCR procedure / G.G. Stone, R.D. Oberst, M.P. Hays, S. McVey, M.M. Chengappa // J. Clin. Microbiol. 1994. Vol. 32. P. 1742-1749.
Xie S.X. A novel gene cluster responsible for alkylaldoxime metabolism coexisting with nitrile hydratase and amidase in
Rhodococcus globerulus A-4 / S.X. Xie, Y. Kato,
H. Komeda et al. // Biochemistry. 2003. Vol. 42. P. 12056-12066.
Yanenko A.S. Regulation of nitrile utilization in Rhodococcus / A.S. Yanenko, O.B. Astaurova, T.V. Gerasimova et al. // Biotechnologia. 1995. № 7-8. P. 139-144.
Поступила в редакцию 16.06.2009
The PCR-analysis of the aldoxime dehydratase genes from nitrile-degrading bacteria
M.V. Kuznetsova, A.V. Maksimova, G.V. Ovechkina, A.Ju. Maksimov
We conducted the PCR-analysis of the aldoxime dehydratase genes from nitrile-degrading bacteria, which were isolated from the Perm region. It was established that only 13 of 91 strains (14.3%) from the laboratory collection contained aldoxime dehydratase genes. 12 strains of genus Rhodococcus (20.3%) contained DNA fragments which corresponded to aldoxime dehydratase gene by size. On the DNA matrix one of the Gram-negative strains - Pseudomonas fluorescens 3220 - the sequence identity with aldoxime dehydratase gene of the P. chlororaphis B23 was detected.
