CC BY
14doi: 10.17116/terarkh2014861272-77
© Коллектив авторов, 2014
Прямое повреждающее воздействие на ДНК человека неблагоприятных экологических и климатических факторов
Н.А. ДОРОЩУК, А.Ю. ПОСТНОВ, А.Д. ДОРОЩУК, З.Б. ХАСАНОВА, Н.В. КОНОВАЛОВА, Ю.Д. ХЕСУАНИ, М.К. ОСЯЕВА, О.В. РОДНЕНКОВ, И.Е. ЧАЗОВА
НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России, Москва
Direct human DNA damage by unfavorable environmental and climatic factors
N.A. DOROSHCHUK, A.Yu. POSTNOV, A.D. DOROSHCHUK, Z.B. KHASANOVA, N.V. KONOVALOVA, Yu.D. KHESUANI, M.K. OSYAEVA, O.V. RODNENKOV, I.E. CHAZOVA
A.L. Myasnikov Research Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiology Research-and-Production Complex, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Резюме
Цель исследования. Изучение влияния искусственно смоделированных климатических условий лета 2010 г. в Москве на теломерные повторы хромосом клеток крови человека.
Материалы и методы. Климатические условия июля—августа 2010 г. в Москве искусственно смоделированы на базе медико-технического комплекса Института медико-биологических проблем РАН. Относительную длину теломерных повторов хромосом клеток крови 6 практически здоровых добровольцев измеряли методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Результаты. Установлено, что данные условия приводят к статистически значимому уменьшению на 15% длины теломерных повторов концевых отделов хромосом.
Заключение. Изменения экологических факторов и аномальные повышения температурного фона могут приводить к развитию окислительного стресса, сопровождающегося укорочением теломер, что в свою очередь может являться фактором преждевременного старения.
Ключевые слова: длина теломерных повторов, ДНК, угарный газ, гипертермия, окислительный стресс.
Aim. To study the impact of simulated climatic conditions of the 2010 summer in Moscow on the telomere repeats of chromosomes in human blood cells.
Materials and methods. The climatic conditions of July—August 2010 in Moscow were simulated at the Medical Technical Complex, Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences. The relative length of the telomeric repeats of blood cell chromosomes from 6 apparently healthy volunteers was measured by quantitative real-time polymerase chain reaction. Results. These conditions were ascertained to lead to a statistically significant decline in the length of telomere repeats in the terminal portions of chromosomes by 15%.
Conclusion. Environmental changes and abnormal temperature rises may result in oxidative stress accompanied by telomere shortening, which can be, in turn, a factor of premature aging.
Key words: telomere repeat length, DNA, carbon monoxide, hyperthermia, oxidative stress.
МТК — медико-технический комплекс СО — угарный газ
ОДТП — относительная длина теломерных повторов COHb — карбоксигемоглобин
В последнее время вырос научный интерес к изучению механизмов, при помощи которых изменение климата может влиять на организм человека [1]. В условиях прогнозируемого глобального потепления к концу XXI века произойдет повышение средних годовых температур на 1,4—5,8 °С [2]. Вероятнее всего, изменение климата будет связано с увеличением частоты тепловых волн, а также с их удлинением [3]. В жаркую погоду происходит увеличение смертности, особенно у лиц пожилого возраста. Так, во время летней жары 2003 г. в Европе смертность выросла в Италии на 15% [4], в Португалии на 40% [5], во Франции на 60% [6].
По данным Росгидромета, в Москве летом 2010 г. зафиксирована рекордная по продолжительности и температурному фону тепловая волна, которая была отягощена
повышенным уровнем содержания в воздухе продуктов горения. В частности, содержание угарного газа (СО) превышало предельно допустимые количества в 2,2 раза. Во время жары 2010 г. в Москве смертность выросла на 11 тыс. случаев по сравнению с июлем—августом 2009 г. (табл. 1) [7, 8].
Согласно приведенным данным смертность в целом по стране за 2010 г. была выше, чем за 2009 г. или 2011 г., причем пик смертности пришелся на период летней жары (рис. 1, 2).
Существует связь между изменениями климата и здоровьем человека [9, 10]. Поэтому изучение адаптационных возможностей организма в условиях климатических катаклизмов особенно важно для понимания формирующихся защитных механизмов. В последнее время увели-
Таблица 1. Увеличение смертности на фоне высоких температур в июле—августе 2010 г. в Москве по данным Росги-
дромета
Параметр Июль Август Всего
Число дней с температурой выше многолетней среднемесячной 31 22 53
Число дней с температурой выше 25 °С 20 12 32
Дополнительное число смертей в 2010 г. по сравнению с 2009 г., абс. (%) 4824 (50,7) 6111 (68,6) 10 935 (59,6)
чилось количество исследований, направленных на изучение влияния климатических изменений на организм человека, однако не показано, что происходит с ДНК на фоне этих изменений. Данная работа посвящена изучению влияния экстремальных климатических условий на длину теломерных повторов хромосом человека.
Теломеры — специализированные ДНК-белковые структуры на концах линейных отделов хромосом. Тело-мерная ДНК человека и всех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб представлена многократным повтором TTAGGG. Длина теломерных повторов хромосом определяется множеством факторов, таких как изначальная длина теломера, количество прошедших митозов, активность белков окислительного стресса и др. [11].
Исходя из этого цель данной работы заключалась в изучении влияния искусственно смоделированных условий гипертермии и высокого содержания СО в воздухе, имитирующих экстремальные условия лета 2010 г. в Москве, на теломерные повторы хромосом клеток крови человека.
Материалы и методы
Исследование проводили на базе медико-технического комплекса (МТК) Института медико-биологических проблем РАН, предназначенного для проведения исследований в условиях искусственно регулируемой среды обитания. МТК состоит из жилого и медицинского модулей. В жилом модуле расположены 6 изолированных помещений для индивидуального проживания (площадь помещения по полу 3,1—3,5 м2), кухни-столовой на 6 человек, кают-компании (площадь около 15,5 м2), главного пульта управления и санузла. Общая площадь около 59 м2. Жилой модуль соединен герметичными шлюзами с медицинским модулем, где проводились медицинские обследования и исследования. Медицинский модуль разделен на 3 зоны: лабораторию, проце-
Сведения об авторах:
Постнов Антон Ювенальевич — д.м.н., рук. Отдела сердечнососудистой патологии и лаборатории медицинской генетики; e-mail: anton-5@mail.ru
Дорощук Александр Дмитриевич — к.б.н., н.с. лаб. медицинской генетики; e-mail: doroschuk_n@mail.ru
Хасанова Зухра Биляловна — м.н.с. лаб. медицинской генетики; e-mail: zukhra@yandex.ru
Коновалова Нина Валерьевна — м.н.с. лаб. медицинской генетики; e-mail: miirka@mail.ru
Хесуани Юсеф Джоржевич — лаборант-исследователь лаб. медицинской генетики; e-mail: usefhesuani@yandex.ru Осяева Мария Константиновна — лаборант-исследователь Отд. хронической ИБС; e-mail: osyaeva_m@mail.ru Родненков Олег Владимирович — к.м.н., с.н.с. Отд. хронической ИБС; e-mail: rodnenkov@mail.ru
Чазова Ирина Евгеньевна — д.м.н., проф., чл.-корр. РАН, директор Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова; e-mail: info@cardioweb.ru
дурную зону и изолятор, и 2 вспомогательные: кухню и санузел. В период нахождения участников исследования в МТК все перемещения между помещениями строго регламентированы для предотвращения нарушений установленных параметров обитания; нормативный уровень микробной обсемененности газовой среды поддерживался за счет работы установки для обеззараживания воздуха.
В исследовании принимали участие 6 практически здоровых мужчин в возрасте от 22 до 46 лет (средний возраст 33,8±9,2 года). Все испытуемые прошли предварительное медицинское обследование и подписали информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования утвержден этическими комитетами ФГБУ РКНПК Минздрава России и ГНЦ РФ ИМБП РАН. Предварительное обследование проводилось на базе ФГБУ РКНПК Минздрава России. После завершения основного этапа участники исследования были переведены в РКНПК Минздрава России для дальнейшего наблюдения и контрольного обследования.
В течение 30 дней добровольцы проживали в МТК при искусственно созданных климатических условиях, соответствующих июлю—августу 2010 г. на территории Москвы в соответствии с данными Росгидромета РФ. Температура окружающей среды составила от 30 до 38 °С в дневное время и 23—31 °С в ночное время при влажности до 75% и уровне СО от 5 до 40 мг/м3.
Образцы венозной крови брали в вакутейнеры, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта, за 4 мес до начала исследования и на 1, 10, 20 и 31-й дни исследования. ДНК выделяли с использованием набора для выделения ДНК «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия). Относительную длину теломерных повторов (ОДТП) хромосом лейкоцитов из периферической крови человека определяли методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени [12, 13] с использованием ДНК-амплификатора в реальном времени АНК-32 (ИАнП РАН, Россия). В качестве калибратора использовали ДНК, выделенную из клеточной линии HeLa.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы SPSS 21.0 («SPSS Inc.», США). Результаты представлены как М+SD, где М — среднее арифметическое, SD — стандартное отклонение. О динамике длины теломерных повторов судили по показателю Д%, который рассчитывали по формуле Д% = (ОДТП1 - ОДТПп)/ОДТП1-100%, где ОДТП1 — относительная длина теломерных повторов за 4 мес до начала исследования, n — значение ОДТП на 1, 10, 20 или 30-й день климатического исследования. Динамику длины теломерных повторов в период пребывания в МТК оценивали при помощи критерия Вилкоксона для зависимых выборок. Для выявления взаимодействия между длиной теломерных повторов и возрастом использовали корреляционный анализ Спирмена. Статистически значимыми считали различия р<0,05.
Результаты
Значения ОДТП лейкоцитов в периферической крови 6 участников климатического исследования за 4 мес до
Контактная информация:
Дорощук Наталья Александровна — врач-лаборант кабинета медицинской генетики; тел.: +7(916)279-6381, +7(495)414-6513; e-mail: natador28@mail.ru
Н.А. Дорощук и соавт.
Рис. 1. Сравнительные данные о числе умерших в Москве за 2009 и 2010 г. по месяцам.
Резкое увеличение смертности в июле—августе 2010 г. по сравнению с аналогичным периодом 2009 г.
Рис. 2. Годовое изменение количества смертей в Москве: увеличение суммарных годовых показателей смертности по сравнению с 2009 и 2011 г.
начала и на момент начала испытания оказались практически равными и составили в среднем 81,7 и 81% соответственно. ОДТП добровольцев отрицательно коррелирует с возрастом (r=—0,67; _р<0,001), что соответствует ожидаемому уменьшению длины теломерных повторов хромосом с увеличением возраста (рис. 3).
Как следует из представленного графика (рис. 4), за 4 мес до начала исследования значения ОДТП хромосом
Рис. 3. Зависимость ОДТП хромосом от возраста.
Показано ожидаемое снижение ОДТП с увеличением возраста испытуемых.
практически не различались. За время пребывания в МТК в течение 30 дней при неблагоприятных климатических условиях произошло снижение ОДТП хромосом на 14,9+3,1% (р<0,028). При этом укорочение длины тело-мерных повторов происходило неравномерно. За первые 10 дней пребывания участников климатического исследования в экстремальных условиях произошло незначительное уменьшение длины теломерных повторов на 2,8% (р=0,028), в то же время за данный период времени воспроизведен разовый подъем концентрации СО до 12 мг/м3,
Рис. 4. Изменение ОДТП (средние значения) за время пребывания на базе МТК Института медико-биологических проблем РАН в сравнении с концентрацией СО.
При увеличении концентрации СО наблюдается заметное снижение длины теломер испытуемых. Пунктирная линия — концентрация СО, сплошная линия — относительная длина теломерных повторов хромосом.
Таблица 2. Рекомендуемые уровни СО в воздухе и время экспозиции по нормам, установленным Всемирной организацией здравоохранения к качеству воздуха для Европы (2000) [14]
Концентрация СО во вдыха-
Продолжительность пребывания
емом воздухе, мг/м3
100 60 30 10 7
15 мин 30 мин 60 мин 8 ч 24 ч
Примечание. Нормативные значения и периоды времени средневзвешенный экспозиции определены таким образом, чтобы уровень карбоксигемоглобина не превышал 2,5%.
наблюдавшийся в реальных условиях летом 2010 г. С 10-го по 20-й день исследования отмечалась тенденция к снижению длины теломерных повторов в среднем на 0,5% (р=0,5), но подъем концентрации СО также отсутствовал. Самое значительное укорочение теломерных повторов в среднем примерно на 11,2% произошло за последний период, когда концентрация СО в течение 6 дней подряд колебалась от 17 до 40 мг/м3 (предельно допустимая концентрация СО в воздухе составляет 20 мг/м3). Таким образом, пик снижения длины теломерных повторов приходится на дни с высоким содержанием СО. Подобная динамика характерна для всех добровольцев.
Показана положительная корреляция увеличения скорости укорочения теломерных повторов от возраста участников исследования (т=0,88; ^<0,001). У 2 добровольцев в возрасте 22 и 24 лет длина теломерных повторов
за все время исследования уменьшилась на 11,4 и 11,8% соответственно, тогда как у испытуемых в возрасте 42 и 44 лет укорочение теломерных повторов достигало 18,2 и 18,1% соответственно (рис. 5).
Обсуждение
Известно, что СО — высокотоксичное соединение (табл. 2). Он быстро связывается с гемоглобином, образуя карбоксигемоглобин (СОНЬ), что приводит к гипоксии тканей. Сродство гемоглобина с СО в 210 раз выше, чем с кислородом, поэтому образование СОНЬ происходит даже при незначительных концентрациях СО во вдыхаемом воздухе [15]. СО быстро вытесняет кислород из гемоглобина, смещая кривую диссоциации оксигемоглобина влево. СО также способен оказывать непосредственное токсическое воздействие на ткани, конкурируя с кислородом в других тканевых гемопротеинах (миоглобин, пероксида-за, каталаза, цитохромы).
Высокое содержание СО приводит к гипоксии, которая, как и гипертермия, вызывает образование свободных радикалов [16, 17]. Действительно, как следует из опубликованных ранее результатов биохимических исследований, в течение 1 мес пребывания в МТК у испытуемых существенно вырос уровень одного из основных продуктов сво-боднорадикального окисления полиеновых липидов (малонового диальдегида) в плазме крови; одновременно в эритроцитах достоверно снизились активности антиокси-дантных ферментов каталазы и GSH-Рх, ответственных за утилизацию пероксида водорода и липогидропероксидов [18]. Эти данные свидетельствуют о том, что через 30 дней пребывания в МТК у испытуемых выявлены характерные изменения, свидетельствующие о наличии у них окислительного стресса, а именно, увеличение содержания про-
H.A. Лорошук и соавт.
Рис. 5. Динамика скорости изменения длины теломер в зависимости от возраста испытуемых.
С увеличением возраста испытуемых происходит ускоренное укорочение теломер.
дуктов свободнорадикального окисления на фоне снижения эффективности утилизации АФК.
АФК, особенно гидроксильный радикал, вызывает разрывы ДНК, преимущественно в области теломерных концов хромосом [19]. Окислительное повреждение тело-мерной ДНК происходит за счет образования аддукта гуанина (8-oxodG), который способствует нарушениям в поддержании длины теломер. В отличие от остальной части генома теломеры не могут восстанавливать одноните-вые разрывы ДНК [20]. Из-за этого теломеры особо чувствительны к накоплению аддукта гуанина [21], при накоплении которого происходит более быстрое укорочение теломерных концов хромосом. Скорость укорочения те-ломерных повторов напрямую влияет на скорость старения всего организма [22].
В теломерах снижена активность системы репарации [23, 24]. Таким образом, возможно, что образовавшиеся
АФК вызывали повреждения теломерных концов ДНК, которые не подвергаются репарации, что привело к существенному сокращению длины теломерных концов хромосом лейкоцитов в периферической крови.
Вероятно, СО вызывает более мощную, чем гипертермия, генерацию АФК, что подтверждается снижением длины теломерных повторов хромосом в периоды его высокого содержания во вдыхаемом воздухе.
Заключение
Таким образом, изменения экологических факторов и аномальные повышения температурного фона могут приводить к развитию окислительного стресса, сопровождающегося укорочением теломер, что в свою очередь может являться фактором преждевременного старения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Haines A., Patz J. Health effects of climate change. J Am Med Assoc 2004; 291: 99—103.
2. McCarthy J., Canziani O, Leary N. et al. Climate change 2001: impacts, adaptation and vulnerability. Cambridge, New York: Cambridge University Press 2001.
3. Hulme M, Jenkins G.J., Lu X. et al. Climate change scenarios for the United Kingdom: the UKCIP02 scientific report. Norwich: Tyndall Centre for Climate Change Research, School of Environmental Sciences, University of East Anglia 2002.
4. Conti S., Meli P., Minelli G. et al. Epidemiologic study of mortality during the Summer 2003 heat wave in Italy. Environ Res 2005; 98: 390—399.
5. Botelho J., Caterino J., Calado R. et al. Onda de calor de Agosto de 2003. Os seus efeitos sobre a mortalidade da populacao portuguesa. Lisboa: Instituto nacional de Saude Dr. Ricardo Jorge 2003.
6. Fotiadou P., Henegariu O, Sweasy J.B. DNA polymerase beta interacts with TRF2 and induces telomere dysfunction in a murine mammary cell line. Cancer Res 2004; 64: 3830—3857.
7. Ревич Б.А. Волны жары, качество атмосферного воздуха и смертность европейской части России летом 2010 года: результаты предварительной оценки. Экология человека 2011; 7: 3—9.
8. http:www.gks.ru
9. Confalonieri U., Menne B., Akhtar R. et al. Human health. climate change 2007: impacts, adaptation and vulnerability. Contribution of Working Group II to the Fourth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. In: Parry M.L., Can-ziani O.F., Palutikof J.P., van der Linden P.J., Hanson C.E. (eds). Cambridge, UK: Cambridge University Press 2007: 391—431.
10. Bowen K.J., EbiK. Multi-layered governance framework for incorporating social science insights into adapting to the health impacts of climate change. Citation: Glob Health Action 2013, 6: 21820.
11. Geserick C, Blasco M.A. Novel roles for telomerase in aging. Mech Ageing Dev 2006; 127: 579—583.
12. Cawthon R.M. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method. Nucleic Acids Res 2009; 37 (3): e21.
13. Дорощук Н.А., Дорощук А.Д., Родненков О.В. и др. Изменение длины теломер хромосом при воздействии климатических условий, имитирующих жару в Москве летом 2010 года. Кар-диол вестн 2013; 2: 21—36.
14. Kao L.W., Nanagas K.A. Toxicity associated with carbon monoxide. Clin Lab Med 2006; 26 (1): 99—125.
15. Cronje F.J., Carraway M.S., Freiberger J.J. et al. Carbon monoxide actuates O(2)-limited heme degradation in the rat brain. Free Radic Biol Med 2004; 37: 1802—1812.
16. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикаль-ные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. Кардиология 2001; 7: 48—61.
17. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: АРТА 2008;
18. Ланкин В.З., Постнов А.Ю., Родненков О.В. и др. Окислительный стресс как фактор риска осложнения сердечно-сосудистых заболеваний и преждевременного старения при действии неблагоприятных климатических условий. Кардиол вестн 2013; 1: 22—25.
19. Fotiadou P., Henegariu O, Sweasy J.B. DNA polymerase beta interacts with TRF2 and induces telomere dysfunction in a murine mammary cell line. Cancer Res 2004; 64: 3830—3857.
20. Petersen S, Saretzki G., von Zglinicki T. Preferential accumula-tionof single-stranded regions in telomeres of human fibroblasts. Exp Cell Res 1998; 239: 152—160.
21. Kawanishi S., Oikawa S. Mechanism of telomere shortening by oxidative stress. Ann N Y Acad Sci 2004; 1019: 278—284.
22. Hong Jiang, Wenqing Chen, Lihui Qu et al. ELISA for Aging Bio-markers Induced by Telomere Dysfunction in Human Plasma. J Biomed Biotechnol 2010; 25: 1—4.
23. von Zglinicki T. Oxidative stress shortens telomeres. Trends Bio-chem Sci 2002; 27 (7): 339—344.
24. Tchirkov A., Lansdorp P.M. Role of oxidative stress in telomere shortening in cultured fibroblasts from normal individuals and patients with ataxia-telangiectasia. Human Mol Genet 2003; 12 (3): 227—232.
Поступила 04.03.2014
